Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca²⁺ CatchER⁺

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przedstawienie naszych protokołów hodowli i transfekcji komórek HEK293 i C2C12 za pomocą CatchER plus oraz jego zastosowania do monitorowania stanów przejściowych wapnia za pośrednictwem receptora ERSR w pomiarze NC2KD. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące sygnalizacji wapniowej i obrazowania, takie jak podstawowe stężenie wapnia i jego szybkie zmiany w ERSR określonych komórek oraz sposób zastosowania biosensora CatchER plus do tych pomiarów. Główną zaletą tej techniki jest to, że odpowiedź fluorescencyjna pojedynczych komórek może być rejestrowana w czasie rzeczywistym z szybką kinetyką.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania chorób związanych z wapniem ERSR, ponieważ CatchER plus może monitorować nieprawidłowe stany przejściowe wapnia w tych organellach, które powstają w wyniku dysfunkcyjnych elementów sygnalizacji wapniowej. Demonstracja wizualna tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy transfekcji komórek i obrazowania fluorescencji są trudne do nauczenia, ponieważ hodowla komórkowa i mikroskopia mają wiele obszarów błędów. Procedurę zademonstruje Florence Reddish, post-doc z naszego laboratorium.

Aby rozpocząć ten eksperyment, umieść komórki HEK293 na wysterylizowanych szklanych szkiełkach mikroskopowych w sześciocentymetrowych naczyniach i hoduj przez jeden do dwóch dni, aż osiągną około 70% zlewu w dniu transfekcji. Następnie opróżnij DMEM z naczynia i dodaj trzy mililitry zredukowanej pożywki surowicy. Następnie dodaj mieszaninę odczynników do transfekcji DNA do naczynia i inkubuj przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Transfekcja komórek HEK293 jest na ogół łatwiejsza niż w przypadku innych linii komórkowych, ale komórki są mniej odporne na trudne warunki. Dlatego tak ważne jest, aby wystawiać je na działanie odczynników do transfekcji tylko przez cztery do sześciu godzin, aby uniknąć apoptozy. Po czterech do sześciu godzinach umyj komórki pięcioma do sześciu mililitrami HBSS.

Wyrzuć HBSS z naczynia i zastąp trzema mililitrami świeżego DMEM. Następnie inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić ekspresję GECI. W przypadku komórek mioblastów C2C12 trypsynizuj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów trypsyny, aby pokryć dno naczynia.

Następnie umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie do sześciu minut, aby trypsyna mogła poluzować komórki z dna naczynia. Po zakończeniu inkubacji usuń trypsynę i odessaj komórki w ośmiu mililitrach DMEM. Dokładnie odpipetować komórki za pomocą DMEM, aby równomiernie rozproszyć i ponownie zawiesić komórki.

Następnie umieść je na sterylnych szkiełkach nakrywkowych w sześciocentymetrowych szalkach hodowlanych, a następnie dodaj trzy mililitry DMEM, aby uzyskać ostateczną konfluencję 60%Następnie przetransfekuj komórki tego samego dnia. Inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji umyj komórki pięcioma do sześciu mililitrami HBSS.

Wyrzuć HBSS z naczynia i zastąp trzema mililitrami świeżego DMEM. Następnie inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin, aby umożliwić ekspresję GECI. W tej procedurze włącz mikroskop i źródło światła, a następnie otwórz prosty program PCI.

Za pomocą bawełnianego wacika przykryj dno niskoprofilowej komory obrazowania z wanną z otwartym diamentem cienką warstwą szczeliwa. Następnie wyjmij szkiełko zawierające transfekowane komórki z inkubatora i delikatnie przepłucz je trzykrotnie około jednym mililitrem buforu Ringera z 10 milimolową glukozą i 1,8 milimolowym wapniem podgrzanym do 37 stopni Celsjusza. Pozostaw około jednego mililitra buforu Ringera w naczyniu, aby zapobiec wysychaniu komórek i użyj kleszczy, aby wyjąć szkiełko z naczynia.

Wchłonąć nadmiar roztworu, dotykając krawędzią szkiełka tkanki laboratoryjnej. Następnie umieść go z boku komory tak, aby komórki były skierowane w stronę smaru. Następnie przymocuj komorę do uchwytu scenicznego za pomocą śrubokręta.

Dodaj około jednego mililitra buforu Ringera do komory, aby zapobiec wysychaniu komórek podczas montażu na stoliku i kończenia konfiguracji mikroskopu. Przełącz obiektyw mikroskopu na obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w olejku. Dodaj jedną kroplę olejku immersyjnego do obiektywu.

Następnie umieść uchwyt na stoliku mikroskopu. Następnie umieść końcówkę próżniową w komorze, aby utrzymać roztwór wypoziomowany i zapobiec jego przepełnieniu. Następnie podnieś obiektyw za pomocą regulacji kursu, aż olej na obiektywie dotknie dolnej części suwaka.

Korzystając z trybu jasnego pola, ustaw wzmocnienie na 175, a czas ekspozycji na 0.03 sekundy, aby ustawić ostrość komórek. Po skupieniu komórek przełącz się w tryb fluorescencji za pomocą wzbudzenia 488 nanometrów i zmień czas ekspozycji na 0,07 sekundy. Zlokalizuj pole widzenia, w którym znajduje się wystarczająca liczba zdrowych komórek o odpowiedniej fluorescencji do obrazowania.

Następnie rób zdjęcia w trybie fluorescencji i jasnego pola. Zakreśl obszar zainteresowania w komórkach lub zakreśl całą komórkę, aby zarejestrować intensywność z wybranego obszaru. Teraz rozpocznij pomiar intensywności z liczbą klatek na sekundę ustawioną na jeden co pięć sekund.

Poczekaj, aż intensywność linii bazowej ustabilizuje się przez 20 do 30 klatek. Następnie oblicz ilość 4-CMC potrzebną z 20-milimolowego materiału na podstawie końcowej objętości komory 450 mikrolitrów, aby uzyskać końcowe stężenie 200 mikromolowych. Następnie ostrożnie przenieś 60 mikrolitrów buforu Ringera z komory do probówki mikrowirówkowej.

Rozcieńczyć obliczoną ilość 4-CMC tym roztworem i dodać z powrotem do komory, aby wywołać zamierzoną odpowiedź z obrazowanych komórek. Poczekaj, aż lek zwiąże się z receptorem, a następnie zmniejszy się sygnał. Następnie umyj komórki trzema do sześciu mililitrami buforu Ringera, jednocześnie dodając znacznik zdarzenia.

Powtórz procedury dla 100 mikromolowych ATP i 15 mikromolowych CPA, używając nowego szkiełka transfekowanych komórek dla każdego testu. Po zakończeniu pomiaru zakończ zbieranie danych w oknie pomiaru intensywności w prostym programie PCI. Następnie wykonaj zdjęcia fluorescencji i jasnego pola komórek.

Następnie otwórz plik danych eksperymentu. Ponownie zakreśl komórki lub obszary zainteresowania, aby w razie potrzeby ponownie obliczyć wartości intensywności. Aby oznaczyć komórki mioblastowe NC2KD i C2C12, powtórz procedurę transfekcji i dodaj jeden mililitr bezwapniowego buforu Ringera do komory.

Przepuszczalność komórek za pomocą 0,002 do 0,005% saponiny i buforu wewnątrzkomórkowego przez 15 do 30 sekund, aby opróżnić komórki z dowolnego CatchER plus, który może znajdować się w cytozolu. Następnie umyj komórki trzema do sześciu mililitrami buforu KCL zawierającego EGTA i 10 mikromolową jonomycynę. Pozwól, aby intensywność zmniejszyła się, aż do osiągnięcia plateau.

Następnie przepłucz komórki trzema do sześciu mililitrami buforu KCL z 10 mikromolową jonomycyną i pozwól intensywności się ustabilizować. Następnie dodaj różne roztwory wapnia, aby intensywność osiągnęła plateau między każdym dodaniem. Aby skalibrować elektrodę do oznaczania ilościowego podstawowego stężenia wapnia, użyj EGTA i 100-milimolowego buforu wapnia, aby uzyskać minimalną i maksymalną intensywność fluorescencji.

Pokazano tutaj reprezentatywne cechy dla znormalizowanej intensywności pobranej z permeabilizowanych komórek mioblastów C2C12 transfekowanych CatchER plus. Komórki były przesiąknięte 0,005% saponiną w buforze wewnątrzkomórkowym przez 15 do 30 sekund. EGTA i roztwory wapnia przygotowano w buforze KCL, a N odnosi się do liczby obrazowanych komórek.

Te wstawkowe obrazy fluorescencyjne są przedstawicielami komórek przed i po leczeniu. 0,2, 0,6, dwa, pięć, 10, 20, 50 i 100 milimolowych komórek wapnia dodano do permeabilizowanych komórek mioblastów C2C12 w obecności 10 mikromolowych jonomycyn, aby uzyskać KD 3,1 plus lub minus 1,4 milimola. Rysunek ten przedstawia reprezentatywny pomiar intensywności CatchER plus transfekowanych komórek przy minimalnych i maksymalnych wartościach po dodaniu jednego milimolowego EGTA i 100-milimolowego wapnia z 10 mikromolową jonomycyną każdy.

Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu 30 do 60 minut w przypadku obrazowania lub trzech dni, jeśli obejmuje transfekcję. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zawsze obchodzić się z komórkami w sterylnym środowisku, przygotować odczynniki przed eksperymentem, nałożyć równą warstwę tłuszczu na komorę i podłączyć odkurzacz przed rozpoczęciem. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak poziom ekspresji CatchER plus.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się sygnalizacją i obrazowaniem wapnia do zbadania dynamiki wapnia w komórkach ssaków w ERSR. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak transfekować komórki i obrazować je za pomocą CatchER plus.