Name: Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Poznaj metodę monitorowania sygnałów wapniowych w komórkach HEK293 i C2C12 za pomocą biosensora CatchER+. Technika mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia rejestrację szybkich zmian stężenia wapnia w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B&B Seed Grant oraz NIH Supplemental Grant dla FR, stypendium BB dla CM, stypendium CDT dla RG.

1. Przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Umieść szkiełka mikroskopowe o wymiarach 22 mm x 40 mm w 6-centymetrowych naczyniach do hodowli komórkowych, po 1 szkiełku na naczynie.</li>
	<li>Wystaw każdą stronę każdego szkiełka, a także 6-centymetrową naczynie na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 15-20 minut, aby wysterylizować w sterylnym kapturze.</li>
	<li>Przykryj naczynia ze szkiełkami w środku folią parafilmową i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki,, roztworów i odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) w wodzie dejonizowanej i dodaj 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO3 i 1 mM EGTA. Dostosuj do pH 7,2-7,3 za pomocą NaOH. Filtruj bufor z filtrem 0,22 μm do autoklawowanej butelki.</li>
	<li>Przygotuj 900 ml wysokoglukozowego Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) h w wodzie dejonizowanej. Dodać 44 mM NaHCO3 i dostosować pH do 7,2-7,3 za pomocą HCl. Media filtracyjne z filtrem 0,22 μm umieścić w autoklalawowanej butelce. Dodaj 100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do pożywki, aby stężenie FBS wynosiło 10%. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 1 l buforu wewnątrzkomórkowego (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl2) w wodzie dejonizowanej i dostosuj pH do 7,25. Końcowe [Ca2+] będzie wynosiło ~100 nM. Przed użyciem dodaj 0,5 mM ATP. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 1 l buforu Ringera (121 mM NaCl, 2,4 mM K2HPO4, 0,4 mM KH2PO4, 10 mM HEPES i 1,2 mM MgCl2) w wodzie dejonizowanej i dostosować pH do 7,2. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Aby użyć, podajcie porcję 50 ml do probówki o pojemności 50 ml i dodajcie 1,8 mM Ca2+ i 10 mM glukozy.</li>
	<li>Przygotuj 1 l roztworu do płukania KCl (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl2) w wodzie dejonizowanej i dostosuj pH do 7,25.</li>
	<li>Rozpuścić 5 mg jonomycyny w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Podwielokrotność 30 μl rozlać do mikroprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować zapas kwasu cyklopiazonowego (CPA), rozpuszczając CPA w DMSO. Upewnij się, że końcowy procent DMSO wynosi ≤ 1% dla CPA dodanego do komórek, aby zapobiec apoptozie. Przygotować 20 mM 4-chloro-m-krezolu (4 cmc), rozpuszczając go w przefiltrowanymH2Oi pozostawiając do rozpuszczenia przez noc przez wstrząsanie w temperaturze 37 °C. Przygotować wywar ATP, rozpuszczając go w przefiltrowanymH2Odo 100 mM.</li>
	<li>Aby oznaczyć Kd in situ, przygotuj po 15 ml 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM i 100 mM Ca2+ w buforze KCl, używając 100 mM EGTA i 1 M CaCl2 rozpuszczonych w wodzie dejonizowanej.</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla komórek mioblastów C2C12 i HEK293 zgodnie z protokołami ATCC dla każdej z nich przy użyciu 10 cm naczyń do hodowli komórkowych w sterylnym kapturze UV. 
	UWAGA: Komórki C2C12 nie powinny rosnąć szybciej niż ~70% konfluencji, ponieważ mioblasty zaczną różnicować się w miotuby. Zarówno komórki HEK293, jak i C2C12 rosną łatwo i nie należy dopuścić do wzrostu powyżej 100% zbiegu w celu utrzymania integralności komórek. Ponadto komórki nie powinny być pasażowane więcej niż 10 razy przed użyciem ich do eksperymentu w celu zachowania zdrowia komórek.</li>
</ol>
4. Transfekcja komórek HEK293
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki HEK293 na wysterylizowane szklane szkiełka mikroskopowe o wymiarach 22 mm x 40 mm w 6 cm naczyniach, dzięki czemu są one ~ 70% zlewające się w dniu transfekcji.</li>
	<li>Następnego dnia postępuj zgodnie z protokołem producenta odczynnika do transfekcji, aby transfekować komórki przy użyciu 2 μg cDNA Catcher+ i stosunku odczynnika DNA:transfekcja 1:3 (waga/objętość) w zredukowanej pożywce surowicy (np. Opti-MEM).</li>
	<li>Opróżnij pożywkę DMEM z naczynia i dodaj 3 ml zredukowanej pożywki surowicy. Dodać mieszaninę odczynników do transfekcji DNA do naczynia i inkubować przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji przemyj komórki 5-6 ml HBSS. Wyrzucić HBSS z naczynia i zastąpić je 3 ml świeżego DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin, aby umożliwić ekspresję GECI.</li>
	<li>Transfekcja komórek mioblastów C2C12
	<ol>
		<li>W przypadku komórek mioblastów C2C12 trypsynizuj komórki, dodając tyle trypsyny, aby pokryć dno naczynia (1-2 ml). Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2-6 minut, aby trypsyna mogła rozluźnić komórki z dna naczynia.</li>
		<li>Po zakończeniu inkubacji usuń trypsynę i odessaj komórki w 8 ml DMEM. Dokładnie odpipetuj komórki za pomocą DMEM, aby równomiernie rozproszyć i ponownie zawiesić te komórki, a następnie wysiewaj je na sterylnych szkiełkach nakrywkowych w 6-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych zawierających 3 ml DMEM, tak aby końcowe złożenie wynosiło 60%.</li>
		<li>Przetransfekuj komórki tego samego dnia, jak opisano w kroku 4.2-4.3. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Powtórz krok 4.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie preparatu do mikroskopu fluorescencyjnego i szkiełek podstawowych
<ol>
	<li>Włącz mikroskop i źródło światła, a następnie otwórz prosty program PCI. Pozwól mikroskopowi rozgrzać się przez 15-20 minut lub do momentu, gdy kamera z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD) ostygnie do -65 °C. Przygotuj komorę i szkiełko z komórkami w oczekiwaniu.</li>
	<li>Przykryj dno niskoprofilowej otwartej komory obrazowania w kąpieli diamentowej cienką warstwą szczeliwa za pomocą bawełnianego wacika.</li>
	<li>Wyjąć szkiełko z transfekowanymi komórkami z inkubatora i delikatnie przepłukać trzykrotnie 1 ml buforu Ringera z 10 mM glukozy i 1,8 mM Ca2+ podgrzanym do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Pozostaw 1 ml buforu Ringera w naczyniu, aby zapobiec wysychaniu komórek, i użyj kleszczyków, aby wyjąć szkiełko z naczynia. Pozwolić, aby nadmiar roztworu wchłonął się na tkankę laboratoryjną, dotykając krawędzią szkiełka tkanki laboratoryjnej. Następnie umieść komorę z boku zawierającej smar z komórkami skierowanymi do góry w kierunku smaru i przymocuj komorę do mocowania stage za pomocą śrubokręta.</li>
	<li>Dodaj 1 ml buforu Ringera do komory, aby zapobiec wysychaniu komórek podczas montażu komory na stoliku i zakończenia reszty konfiguracji mikroskopu. Po podłączeniu węża ssącego do komory, końcowa objętość, jaką mieści komora, wynosi ~450 μL.</li>
	<li>Przełącz obiektyw mikroskopu na obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 40X.</li>
	<li>Użyj papieru do soczewek i roztworu do czyszczenia soczewek, aby wyczyścić i wysuszyć obiektyw. Nie pocieraj obiektywu. Delikatnie wklep, aż powierzchnia będzie czysta.</li>
	<li>Dodaj jedną kroplę olejku immersyjnego do obiektywu.</li>
	<li>Umieść uchwyt na stoliku mikroskopu i dodaj końcówkę próżniową do komory. Po podłączeniu węża ssącego podciśnienia do komory i włączeniu, końcowa objętość, jaką mieści się w koorze, wynosi ~450 μL. Ta końcowa objętość znajduje się na poziomie boków komory. Konieczne jest, aby roztwór w komorze był wypoziomowany podczas eksperymentu, aby zapobiec rozlaniu się roztworu na obiektyw z powodu przepełnienia.</li>
	<li>Podnieś obiektyw i użyj zgrubnej regulacji, aż olej na obiektywie dotknie dolnej części zamka.</li>
	<li>Korzystając z trybu jasnego pola, ustaw wzmocnienie na 175, a czas ekspozycji na 0.03 s, aby ustawić ostrość komórek.</li>
	<li>Po skupieniu komórek przełącz się w tryb fluorescencji przy użyciu wzbudzenia 488 nm. Zmień czas ekspozycji na 0,07 s. Zlokalizuj pole widzenia, w którym znajduje się wystarczająca liczba zdrowych komórek o odpowiedniej fluorescencji do obrazowania.</li>
	<li>Po wybraniu pola widzenia rób zdjęcia w trybie fluorescencji i jasnego pola.</li>
	<li>Zakreśl obszar zainteresowania (ROI) w komórkach lub zakreśl całą komórkę, aby zarejestrować intensywność z wybranego obszaru.</li>
</ol>
6. Obrazowanie stanów przejściowych Ca2+ wywołanych lekami i kalibracja in situ k d
<ol>
	<li>Rozpocznij pomiar intensywności z liczbą klatek na sekundę ustawioną na jeden co 5 s.</li>
	<li>Poczekaj, aż intensywność linii bazowej ustabilizuje się przez 20-30 klatek (100-150 s). W razie potrzeby zmniejsz liczbę klatek na sekundę na tym etapie, aby zapobiec fotowybielaniu.</li>
	<li>Obliczyć potrzebną ilość 4 cmc z 20 mM materiału wyjściowego na podstawie końcowej objętości komory ~ 450 μL, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM. W razie potrzeby rozcieńczyć podstawę.</li>
	<li>Ostrożnie pobrać 60 μl buforu Ringera z komory i umieścić w probówce do mikrowirówki. Rozcieńczyć obliczoną ilość 4-cmc tym roztworem i dodać z powrotem do komory, aby wywołać zamierzoną odpowiedź obrazowanych komórek.</li>
	<li>Dodać obliczoną ilość 4 cmc do probówki mikrowirówki i wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Delikatnie dodaj roztwór nad polem widzenia, jednocześnie dodając znacznik zdarzenia w pomiarze intensywności.</li>
	<li>Poczekaj, aż lek zwiąże się z receptorem, a następnie zmniejszy się sygnał, a następnie przemyj 3-6 ml buforu Ringera z 1,8 mM Ca2+ i 10 mM glukozy, jednocześnie dodając marker zdarzenia. Ponieważ objętość komory wynosi 450 μl i jest podłączona do próżni, dodanie 3-6 ml buforu zapewnia, że poprzedni roztwór zawierający lek został wypłukany i zastąpiony nowo dodanym roztworem.</li>
	<li>Powtórzyć 6,1-6,7 dla 100 μM ATP i 15 μM CPA, używając nowego szkiełka transfekowanych komórek dla każdego testu.</li>
	<li>Po zakończeniu pomiaru zakończ zbieranie danych w oknie pomiaru intensywności w programie Simple PCI.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia fluorescencyjne i w jasnym polu komórek.</li>
	<li>Otwórz plik danych eksperymentu. W tym miejscu ponownie zakreśl komórki lub obszary zainteresowania, aby w razie potrzeby ponownie obliczyć wartości intensywności.</li>
	<li>Aby oznaczyć in situ Kd w komórkach mioblastów C2C12, postępuj zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 4.2 i sekcji 5 i umieść 1 ml 0 mM Ca2+ buforu Ringera w komorze.
	<ol>
		<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 0,002-0,005% saponiny w buforze wewnątrzkomórkowym przez 15-30 s, aby opróżnić komórki z dowolnego Catcher +, który może znajdować się w cytozolu. Przemyć komórki 3-6 ml 1 ml EGTA w buforze KCl z 10 μM jonomycyną. Pozwól, aby intensywność zmniejszyła się, aż do osiągnięcia plateau.</li>
		<li>Przepłukać 3-6 ml buforu KCl z jonomycyną 10 μM i pozwolić intensywności się ustabilizować, a następnie dodać każdy roztwór Ca2+ opisany w kroku 2.7. Pozwól, aby intensywność osiągnęła plateau między każdym dodatkiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby skalibrować elektrodę pod kątem podstawowej kwantyfikacji [Ca2+], wykonaj krok 6.12. Użyj EGTA i bufora 100 mM Ca2+ z kroku 2.7, aby uzyskać minimalną i maksymalną intensywność fluorescencji.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Pobierz plik arkusza kalkulacyjnego z danymi pomiaru intensywności.</li>
	<li>Znormalizuj dane dla każdej komórki do intensywności linii bazowej (F/F0). Wykreśl znormalizowane dane w funkcji czasu w dowolnym programie do tworzenia wykresów.</li>
	<li>Aby obliczyć zmianę procentową, odejmij znormalizowaną wartość szczytową od 1 i pomnóż przez 100. Obliczanie średniej i odchylenia standardowego w przypadku obrazowania wielu komórek.</li>
	<li>Aby obliczyć stosunek sygnału do szumu, SNR, otwórz plik obrazu zapisany w eksperymencie w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, takim jak ImageJ, a następnie zmierz sygnał, transfekowane komórki i szum, tło. Oblicz SNR za pomocą równania SNR = sygnał/szum.</li>
	<li>Aby obliczyć Kd in situ na podstawie zebranych danych obrazowania fluorescencyjnego, należy uśrednić dane dotyczące intensywności, obejmujące płaskowyże, po dodaniu każdego stężenia Ca2+ i EGTA (0 mM Ca2+). Oblicz ułamkowe nasycenie (intensywność względna) za pomocą θ = (F – Fmin)/(Fmax- Fmin), gdzie θ to intensywność względna, F to fluorescencja w dowolnym punkcie, Fmin to minimalna intensywność fluorescencji, a Fmax to maksymalna intensywność fluorescencji, aby zobaczyć zmianę intensywności sondy z dodatkiem Ca2+ w porównaniu z minimalną intensywnością. Wykreśl dane dotyczące intensywności względnej w stosunku do [Ca2+] w dowolnym programie do tworzenia wykresów i dopasowywania krzywych. Użyj równania wiązania 1:1 θ = [MT]/(Kd + [MT]) przetłumaczonego dla dowolnego programu do tworzenia wykresów i dopasowywania krzywych, aby obliczyć Kd. MT oznacza całkowite stężenie metalu.</li>
	<li>Aby określić ilościowo podstawowy wapń na podstawie kalibracji opisanej w ppkt 6.13, należy uśrednić dane dotyczące intensywności, obejmujące płaskowyże, po dodaniu 1 mM EGTA (Fmin) i 100 mM Ca2+ (Fmax). Użyj równania kalibracyjnego [Ca2+] = Kd([F – Fmin)/(Fmax – F)], aby obliczyć podstawowy wapń.</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+remodelling+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li>
<li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li>
<li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+of+intracellular+Ca2%2B%3A+Molecular+determinants+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum%3A+a+multifunctional+signaling+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18083096">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-chloro-m-cresol%2C+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li>
<li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+receptor%3A+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li>
<li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.%2C+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li>
<li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+increases+intracellular+calcium+in+supraoptic+neurons+by+activation+of+both+P2X+and+P2Y+purinergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).</li>
<li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Pumps+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium Pumps in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).</li>
<li>Michelangeli, F., East, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diversity+of+SERCA+Ca2%2B+pump+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li>
<li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells%3A+a+new+look+at+the+refilling+process%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li>
<li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1%2C4%2C5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li>
<li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9759496">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li>
<li>Heim, N., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Indicators+of+Cellular+Calcium+Dynamics+Based+on+Troponin+C+and+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein.</a> J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li>
<li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troponin+C-based+biosensors%3A+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li>
<li>Carlson, H. J., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analysis+of+a+Red+Fluorescent+Protein-Based+Calcium+Ion+Indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator.</a> Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).</li>
<li>Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+Calcium+Sensing+by+GCaMP2%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2.</a> Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).</li>
<li>Koldenkova, V. P., Nagai, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23352808">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li>
<li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2%2B+dynamics+in+high+Ca2%2B+concentration+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2%2B+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li>
<li>Wang, Z. -M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+concentration+after+Ca2%2B+release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch.%2C+EJP%22%5BJournal%5D)">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li>
<li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li>
<li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li>
<li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Design+Of+Genetically-Encoded+Ca2%2B+Probes+With+Rapid+Kinetics+for+Sub-Cellular+Application+%5B%5D%22">Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]</a>. , Georgia State University. (2016).</li>
<li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta-Mol.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li>
<li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLambert%2C+DG+%22Calcium+signaling+protocols%22">Calcium signaling protocols</a>. , Humana Press. (1999).</li>
<li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li>
<li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBootman%2C+MD+%22Cold+Spring+Harb%22">Cold Spring Harb</a>. 2013 (2), Cold Spring. 83-99 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie na żywo pojedynczych komórek za pomocą sond fluorescencyjnych, takich jak CatchER+, jest skuteczną techniką analizy skomplikowanych procesów sygnalizacyjnych Ca2+ ER/SR w każdej komórce w odpowiedzi na agonistów receptorów lub antagonistów. Technika ta jest również przydatna do obrazowania przy użyciu wielu długości fal jednocześnie, takich jak w przypadku Fura-2 lub do obrazowania CatchER+ i Rhod-2 razem w celu monitorowania odpowiednio zmian wapnia ER i cytozolowego. W tym p...

Czasoprzestrzenne atrybuty wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia (Ca2+) aktywują różne funkcje biologiczne1. Te zdarzenia sygnalizacyjne Ca2 + są wyzwalane zewnątrzkomórkowo przez różne bodźce i kontrolowane wewnątrzkomórkowo przez główne organelle magazynujące Ca2 + oraz przez liczne pompy Ca2 +, kanały i białka wiążące Ca2 +. Stan nieustalony Ca2+ może ulec znacznej zmianie w wyniku defektów modulacji sygnału, co prowadzi do różnych chorób2. Ze względu na szybkość i złożoność systemu sygnalizacyjnego Ca2 +, z retikulum endo- (ER) i retikulum sarkoplazmatycznym (SR) w centrum, genetycznie kodowane sondy Ca2 +, które zostały zoptymalizowane pod kątem ekspresji ssaków z szybką kinetyką, są potrzebne do obserwacji globalnych i lokalnych zmian Ca2 + w różnych komórkach3.
ER i SR, jego odpowiednik w komórkach mięśniowych, są głównymi wewnątrzkomórkowymi organellami magazynującymi Ca2+ i działają jak pochłaniacze Ca2+, które pomagają wzmocnić sygnał Ca2+4. ER/SR jest integralną częścią sygnalizacji Ca2+ z podwójną rolą jako nadajnik i odbiorca sygnałów5. Receptor ryanodynowy (RyR) i receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3R) są receptorami uwalniania Ca2 + zlokalizowanymi na błonach ER / SR, które są regulowane przez Ca2+ 6. Inne czynniki bezpośrednio lub pośrednio stymulują funkcję tych receptorów. 4-chloro-m-krezol (4-cmc) jest silnym agonistą RyR, mającym 10-krotnie wyższą czułość niż kofeina na indukowanie uwalniania SR Ca2+, gdzie oba są regularnie stosowane do badania uwalniania Ca2+ za pośrednictwem RyR w zdrowych i chorych komórkach7. ATP zwiększa uwalnianie Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pośrednictwem IP3R8. ATP wiąże się z receptorem purynergicznym P2YR, receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), wyzwalając produkcję IP3, który wiąże się z IP3R, aby uwolnić Ca2+ z klasy ER9,10. Pompa ATPazy wapniowej retikulum sarko-endoplazmatycznego (SERCA) jest pompą ATPazy typu P, również umieszczoną na błonie ER/SR, która redukuje cytozolowy Ca2+ i uzupełnia ER / SR poprzez aktywne pompowanie jonu do klasy ER / SR lumen11. Specyficznymi inhibitorami pompy SERCA są thapsigargina z Thapsia garganica i kwas cyklopiazonowy (CPA) z Aspergillus i Penicillium. CPA ma niskie powinowactwo do pompy i odwracalnie blokuje punkt dostępowy Ca2+12. Z drugiej strony Thapsigargin nieodwracalnie wiąże się z pompą wolną od Ca2+ w reszcie F256 w helisie M3 z powinowactwem nanomolowym11. Analiza i ilościowe określenie zmian związanych ze zdarzeniami stymulowanymi przez Ca2+ było i pozostaje wyzwaniem. Ponieważ ER / SR jest głównym subkomórkowym przedziałem zawierającym Ca2 + z centralną funkcją w propagacji sygnału Ca2 +, wiele pracy skoncentrowano na zrozumieniu sygnalizacji ER / SR Ca2 + < klasa sup = "xref">5.
Stworzenie syntetycznych barwników Ca2+ przyczyniło się do rozwoju dziedziny i praktyki obrazowania Ca2+. Chociaż barwniki, takie jak Mag-Fura-2, są szeroko stosowane do pomiaru Ca2+ w różnych komórkach,13,14,15 mają ograniczenia, takie jak nierównomierne ładowanie barwnika, fotowybielanie i niemożność ukierunkowania na określone organelle. Odkrycie białka zielonej fluorescencji (GFP) i postęp w dziedzinie sond Ca2+ opartych na białku fluorescencyjnym pchnął naprzód dziedzinę obrazowania Ca2+16. Niektóre z istniejących GECI to pary transferu energii rezonansu Förstera (FRET) obejmujące żółte białko fluorescencyjne (YFP), cyjanowe białko fluorescencyjne (CFP), kalmodulinę i peptyd wiążący M1317,18. GECI na bazie troponiny C są również dostępne jako pary FRET CFP i cytrynu oraz jako pojedyncze sondy fluoroforowe19,20,21. Inne, takie jak GCaMP2 i R-GECO, to pojedyncze czujniki fluoroforowe zawierające kalmodulinę22,23. Aby przezwyciężyć ograniczenia wąskiego dostrajania Kd i kooperatywnego wiązania związanego z wieloma miejscami wiązania Ca2+ znajdującymi się w ich domenach wiązania Ca2+24, stworzono nową klasę czujników wapnia poprzez zaprojektowanie miejsca wiązania Ca2+ na powierzchni beczki beta w wrażliwym na chromofor miejscu wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP)25, 26. Ten bardzo reklamowany czujnik, zwany Catcher, ma Kd ~ 0,18 mM, kw pobliżu granicy dyfuzji i koff 700 s-1. CatchER został wykorzystany do monitorowania uwalniania wapnia ER/SR za pośrednictwem receptora w różnych liniach komórkowych ssaków, takich jak HeLa, HEK293 i C2C1225. Ze względu na jego szybką kinetykę, CatchER zastosowano we włóknach mięśniowych zginacza palca brevis (FDB) młodych i starych myszy Friend Virus B NIH Jackson (FVB), aby ujawnić, że więcej Ca2 + pozostaje w SR po 2 s depolaryzacji we włóknach FDB starych myszy w porównaniu do młodych myszy 27. Aby przezwyciężyć jego niską fluorescencję w temperaturze 37 °C, co utrudnia jego zastosowanie w obrazowaniu komórek ssaków wapniem, opracowaliśmy ulepszoną wersję CatchER o nazwie CatchER+. CatchER+ wykazuje zwiększoną fluorescencję w temperaturze 37 °C, co zapewnia lepsze zastosowanie w komórkach ssaków. Dodatkowe mutacje zostały włączone do CatchER w celu poprawy termostabilności i fluorescencji w temperaturze 37 °C28,29, aby stworzyć CatchER+. CatchER+ wykazuje sześciokrotny wzrost stosunku sygnału do szumu (SNR) w porównaniu z CatchER30.
Tutaj przedstawione są protokoły hodowli i transfekcji komórek HEK293 i C2C12 za pomocą CatchER+ oraz jego zastosowanie do monitorowania stanów przejściowych wapnia za pośrednictwem receptora ER/SR. Reprezentatywne wyniki przedstawiono dla CatchER+ ulegającego ekspresji w komórkach HEK293 poddanych działaniu 4-cmc, CPA i ATP. Udostępniamy również protokół do oznaczania in situ Kd CatchER+ w komórkach mioblastów C2C12 i oznaczania ilościowego podstawowego [Ca2+].

<table><tbody><tr><td>4-Chloro-3-metylofenol (4-CmC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C55402</td><td></td></tr><tr><td>515DCXR lustro dichroiczne</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td>NC338059</tr><tr><td>Hydrat soli disodowej 5&trifosforanu adenozyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>EMD Millipore</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane Corning (100 mm)</td><td></td>Naczynia hodowlane poddane kulturze tkankowej <td>Sigma-Aldrich</td> CLS430167 <td></td></tr><tr><td>Corning (60 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cyklopiazonowy (CPA)</td><td>EMD Milipor</td><td>239805</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glukoza</td><td>ACROS Organics</td><td>41095-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 111 Smar do zaworów i Uszczelniacz</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0275</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>Etylenobis(oksyetylenenitrylo) Kwas tetraoctowy (EGTA)</td><td>ACROS Organics</td><td>409911000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe Fisherbrand 22x40 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 12-544B</td><td></td></tr><tr><td>Hanksa' Sole zrównoważone (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>- HEPS - Wolny kwas, Biologia molekularna</td><td>EMD Millipore</td><td>391340</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny bez autofluorescencji</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>jonomycyna, wolny kwas</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-230-5804</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Leica DM6100B z chłodzoną kamerą EM-CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>Odczynnik</td> do transfekcji ThermoFisher <td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td></td><td>ThermoFisher</td> L3000015 <td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowa otwarta komora obrazowania w kąpieli diamentowej</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>51985034</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>EMD Milipore</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, Dwuzasadowy</td><td>EMD Milipor</td><td>PX1570</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, Monozasadowy</td><td>EMD Milipora</td><td>PX1565</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>SimpleOprogramowanie do analizy obrazu PCI</td><td>Hamamatsu</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-GV 0,22 &micro; m filtr</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGVB1010</td><td></td></tr><tr><td>Till Polychrome V Lampa ksenonowa</td><td>Till Photonics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (2,5%), bez czerwieni fenolowej (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie uwalniania wapnia er/sr za pomocą ukierunkowanego czujnika ca2+ catcher+

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Wewnątrzkomórkowe stany przejściowe wapnia (Ca2+) wywołane przez bodźce zewnątrzkomórkowe inicjują wiele procesów biologicznych w organizmach żywych. W centrum wewnątrzkomórkowego uwalniania wapnia znajdują się główne wewnątrzkomórkowe organelle magazynujące wapń, retikulum endoplazmatyczne (ER) i bardziej wyspecjalizowana retikulum sarkoplazmatyczne (SR) w komórkach mięśniowych. Dynamiczne uwalnianie wapnia z tych organelli odbywa się za pośrednictwem receptora ryanodyny (RyR) i receptora 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3R), przy czym uzupełnianie odbywa się przez pompę ATPazy wapniowej sarko/retikulum endoplazmatycznego (SERCE). Stworzono genetycznie kodowany czujnik wapnia (GECI) o nazwie CatchER w celu monitorowania szybkiego uwalniania wapnia z ER/SR. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły transfekcji i ekspresji ulepszonego, ukierunkowanego na ER / SR GECI CatchER+ w komórkach HEK293 i C2C12 oraz jego zastosowanie w monitorowaniu stanów przejściowych wapnia za pośrednictwem pompy IP3R, RyR i SERCA w komórkach HEK293 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wybrany agonista lub inhibitor receptora jest rozpraszany w roztworze komory, a zmiany intensywności są rejestrowane w czasie rzeczywistym. Dzięki tej metodzie obserwuje się spadek wapnia ER z aktywacją RyR za pomocą 4-chloro-m-krezolu (4-cmc), pośrednią aktywacją IP3R za pomocą trifosforanu adenozyny (ATP) i hamowaniem pompy SERCA za pomocą kwasu cyklopiazonowego (CPA). Omawiamy również protokoły oznaczania in situ Kd i ilościowego określania podstawowego [Ca2 +] w komórkach C2C12. Podsumowując, protokoły te, stosowane w połączeniu z CatchER+, mogą wywoływać uwalnianie wapnia z ER za pośrednictwem receptora, co w przyszłości znajdzie zastosowanie w badaniu patologii związanych z wapniem ER/SR.

W tej sekcji zaprezentowane zostaną wyniki uzyskane przy użyciu wcześniej opisanych metod z wykorzystaniem zoptymalizowanego, celowanego na ER/SR wskaźnika GECI CatchER+ do monitorowania zmian stężenia Ca2+ w ER/SR poprzez różne ścieżki pośredniczone przez receptory.
Rycina 1 przedstawia opróżnianie ER poprzez RyR stymulowane 20 µM 4-cmc. 4-cmc jest agonistą RyR. Dodanie leku i...

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER+ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ Kd.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przedstawienie naszych protokołów hodowli i transfekcji komórek HEK293 oraz C2C12 biosensorem CatchER plus oraz zastosowania tej metody do monitorowania przejściowych zmian poziomu wapnia pośredniczonych przez receptory ERSR w pomiarze NC2KD. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące sygnalizacji wapniowej i obrazowania, takie jak bazowe stężenie wapnia i jego gwałtowne zmiany w ERSR określonych komórek, a także w kwestii zastosowania biosensora CatchER plus do tych pomiarów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość rejestrowania w czasie rzeczywistym odpowiedzi fluorescencyjnej pojedynczych komórek z szybką kinetyką.Zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę chorób związanych z gospodarką wapniową w ERSR, ponieważ CatchER plus pozwala na monitorowanie nieprawidłowych przejściowych zmian stężenia wapnia w tych organellach, wynikających z dysfunkcji elementów sygnalizacji wapniowej. Prezentacja wizualna tej metody jest kluczowa, gdyż etapy transfekcji komórek oraz obrazowania fluorescencyjnego są trudne do opanowania ze względu na liczne potencjalne źródła błędów w hodowlach komórkowych i mikroskopii. Procedurę zaprezentuje Florence Reddish, pracownik postdoktorski z naszego laboratorium.Aby rozpocząć ten eksperyment, wysiej komórki HEK293 na wysterylizowane szklane szkiełka mikroskopowe w naczyniach o średnicy sześciu centymetrów i hoduj przez jeden do dwóch dni, aż w dniu transfekcji osiągną około 70% konfluencji. Następnie wylej DMEM z naczynia i dodaj trzy mililitry medium z obniżoną zawartością surowicy. Następnie dodaj do naczynia mieszaninę odczynników do transfekcji DNA i inkubuj przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 37°C.Transfekcja komórek HEK293 jest zazwyczaj łatwiejsza niż w przypadku innych linii komórkowych, jednak komórki te są mniej odporne na trudne warunki. Dlatego kluczowe jest poddanie ich działaniu odczynników do transfekcji przez zaledwie cztery do sześciu godzin, aby uniknąć apoptozy. Po upływie czterech do sześciu godzin należy przemyć komórki pięcioma do sześciu mililitrów HBSS.Odsącz HBSS z naczynia i zastąp go trzema mililitrami świeżej pożywki DMEM. Następnie inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37°C, aby umożliwić ekspresję GECI. W przypadku mioblastów C2C12 przeprowadź trypsynizację komórek, dodając od jednego do dwóch mililitrów trypsyny tak, aby pokryła dno naczynia.Następnie umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na od dwóch do sześciu minut, aby trypsyna mogła odczepić komórki od dna płytki. Po zakończeniu inkubacji usuń trypsynę i aspiruj komórki do 8 mL DMEM. Dokładnie pipetuj komórki w DMEM, aby równomiernie je rozproszyć i zawiesić.Następnie wysiej je na sterylne szkiełka nakrywki w szalkach hodowlanych o średnicy 6 cm, a potem dodaj 3 mL DMEM, aby uzyskać końcową konfluencję na poziomie 60%. Następnie, tego samego dnia, przeprowadź transfekcję komórek. Inkubuj je przez 24 h w temperaturze 37°C. Po inkubacji przemyj komórki 5–6 mL HBSS.Odlej HBSS z naczynia i zastąp go trzema mililitrami świeżego DMEM. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin, aby umożliwić ekspresję GECI. W ramach tej procedury włącz mikroskop oraz źródło światła, a następnie otwórz program simple PCI.Używając patyczka kosmetycznego, pokryj dno niskoprofilowej komory obrazowania typu open-diamond cienką warstwą uszczelniacza. Następnie wyjmij ze spektrometru szkiełko zawierające przetransfekowane komórki i delikatnie wypłucz je trzy razy około 1 ml buforu Ringera z 10 mM glukozy i 1,8 mM wapnia, uprzednio podgrzanego do 37 °C. Pozostaw w naczyniu około 1 ml buforu Ringera, aby zapobiec wysychaniu komórek, a następnie za pomocą pęsety wyjmij szkiełko z naczynia.Nadmiar roztworu należy wchłonąć, dotykając krawędzi szkiełka przedmiotowego chusteczki laboratoryjnej. Następnie należy umieścić szkiełko na boku komory, tak aby komórki były skierowane w stronę smaru. Następnie należy przykręcić komorę do uchwytu stolika za pomocą śrubokręta.Dodać około jednego mililitra buforu Ringera do komory, aby zapobiec wysychaniu komórek podczas montowania jej na stoliku i kończenia konfiguracji mikroskopu. Przełączyć obiektyw mikroskopu na obiektyw imersyjny 40x. Nanieść jedną kroplę oleju imersyjnego na obiektyw.Następnie umieść preparat na stoliku mikroskopu. Potem wprowadź końcówkę próżniową do komory, aby utrzymać poziom roztworu i zapobiec jego przelewaniu. Następnie podnoś obiektyw za pomocą pokrętła grubego ustawiania, aż olej na obiektywie dotknie spodu szkiełka przedmiotowego.Korzystając z trybu pola jasnego, ustaw wzmocnienie na 175 i czas ekspozycji na 0,03 sekundy, aby ustawić ostrość na komórki. Po ustawieniu ostrości przełącz na tryb fluorescencji, stosując wzbudzenie 488 nanometrów i zmieniając czas ekspozycji na 0,07 sekundy. Znajdź pole widzenia zawierające wystarczającą liczbę zdrowych komórek o odpowiedniej fluorescencji do obrazowania.Następnie wykonaj zdjęcia w trybie fluorescencyjnym oraz w jasnym polu. Obrysuj obszar zainteresowania w komórkach lub obrysuj całą komórkę, aby zarejestrować intensywność z wybranego obszaru. Teraz rozpocznij pomiar intensywności, ustawiając częstotliwość klatek na jedną klatkę co pięć sekund.Pozwól intensywności linii bazowej ustabilizować się przez 20 do 30 klatek. Następnie, oblicz ilość 4-CMC potrzebną z roztworu zapasowego o stężeniu 20 millimolar, bazując na końcowej objętości komory wynoszącej 450 microliters, aby uzyskać stężenie końcowe 200 micromolar. Następnie ostrożnie przenieś 60 microliters buforu Ringera z komory do probówki do mikrocentryfugi.Rozcieńczyć obliczoną ilość 4-CMC w tym roztworze i dodać z powrotem do komory, aby wywołać zamierzony efekt w obrazowanych komórkach. Odczekać czas niezbędny do związania leku z receptorem i następczego spadku sygnału. Następnie przemyć komórki od trzema do sześciu mililitrów buforu Ringera, jednocześnie dodając marker zdarzeń.Powtórz procedury dla 100 µM ATP oraz 15 µM CPA, używając dla każdego pomiaru nowej szkiełka z transfektowanymi komórkami. Po zakończeniu pomiaru zatrzymaj zbieranie danych w oknie pomiaru intensywności w programie simple PCI. Następnie wykonaj zdjęcia komórek w fluorescencji oraz w jasnym polu.Następnie otwórz plik danych z eksperymentu. W razie potrzeby ponownie zaznacz komórki lub obszary zainteresowania, aby przeliczyć wartości intensywności. Aby wyznaczyć mioblasty NC2KD i C2C12, powtórz procedurę transfekcji i dodaj do komory jeden mililitr buforu Ringera pozbawionego wapnia.Przeprowadź permeabilizację komórek przy użyciu 0,002 do 0,005% saponiny i buforu wewnątrzkomórkowego przez 15 do 30 sekund, aby usunąć z cytozolu ewentualny CatchER plus. Następnie przemyj komórki od trzema do sześciu mililitrów buforu KCL zawierającego EGTA i 10 µM jonomycyny. Odczekaj, aż intensywność sygnału spadnie i osiągnie poziom plateau.Następnie przemyj komórki od trzema do sześciu mililitrów buforu KCL z 10 µM jonomycyny i poczekaj, aż intensywność się ustabilizuje. Po tym czasie dodawaj kolejne roztwory wapnia, pozwalając intensywności osiągnąć poziom plateau po każdym dodaniu. Aby skalibrować czujnik do ilościowego oznaczenia podstawowego stężenia wapnia, użyj EGTA oraz buforu wapniowego 100 mM, aby uzyskać minimalną i maksymalną intensywność fluorescencji.Przedstawiono tutaj reprezentatywne cechy znormalizowanej intensywności uzyskanej z permeabilizowanych mioblastów C2C12 transfekowanych CatchER plus. Komórki poddano permeabilizacji za pomocą 0,005% saponiny w buforze wewnątrzkomórkowym przez 15 do 30 sekund. Roztwory EGTA i wapnia przygotowano w buforze KCL, a N oznacza liczbę obrazowanych komórek.Te wstawione obrazy fluorescencyjne są reprezentatywne dla komórek przed i po traktowaniu. Do permeabilizowanych komórek mioblastów C2C12 dodano 0,2, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 i 100 mM wapnia w obecności 10 µM jonomycyny, aby uzyskać KD na poziomie 3,1 ± 1,4 mM. Rysunek ten przedstawia reprezentatywny pomiar intensywności w komórkach z transfekcją CatchER plus przy wartościach minimalnych i maksymalnych po dodaniu odpowiednio 1 mM EGTA oraz 100 mM wapnia z 10 µM jonomycyną.Po opanowaniu, technikę tę można przeprowadzić w czasie od 30 do 60 minut w przypadku obrazowania lub w ciągu trzech dni, jeśli proces obejmuje transfekcję. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby zawsze operować komórkami w środowisku sterylnym, przygotować odczynniki przed rozpoczęciem eksperymentu, nałożyć równą warstwę smaru na komorę oraz podłączyć pompę próżniową przed startem. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące poziomu ekspresji CatchER plus.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu sygnalizacji wapniowej i obrazowania do analizy dynamiki wapnia w ERSR w komórkach ssaków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak transfekować komórki i obrazować je przy użyciu CatchER plus.

monitoring-ersr-calcium-release-with-the-targeted-ca2-sensor-catcher

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Ładowanie barwnikiem indukowane przez esterazy celowane (TED) wspiera analizę dynamiki wewnątrzkomórkowego magazynowania wapnia za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda opiera się na ukierunkowaniu rekombinowanej karboksylesterazy na retikulum endoplazmatyczne (ER), gdzie poprawia miejscowe demaskowanie syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca2+ o niskim powinowactwie w świetle ER.

Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach.  Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER.   Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach. W tym miejscu opisujemy protokół oceny rezerwy Ca2 + retikulum sarkoplazmatycznego i rozkurczowej funkcji usuwania wapnia w kardiomiocytach za pomocą systemu obrazowania wapnia.

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Ten protokół opisuje podejście do wykonywania obrazowania wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych i oferuje podejście do analizy.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj metodę monitorowania sygnałów wapniowych w komórkach HEK293 i C2C12 za pomocą biosensora CatchER+. Technika mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia rejestrację szybkich zmian stężenia wapnia w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca²⁺ CatchER⁺

Przeglądaj więcej filmów