Name: In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj metodę polimeryzacji F-aktyny na wczesnych endosomach in vitro przy użyciu komórek HeLa. Ta technika pozwala na rekonstytucję nukleacji i polimeryzacji aktyny na błonach endosomalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Otrzymano wsparcie od Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki, szwajcarskiego programu Sinergia, Polsko-Szwajcarskiego Programu Badawczego (PSPB-094/2010), NCCR w Biologii Chemicznej oraz LipidX z inicjatywy Swiss SystemsX.ch, ocenionej przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (do J. G.). O. M. był wspierany przez długoterminowe stypendium EMBO (ALTF-516-2012).

1. Roztwory i preparaty
UWAGA: Wszystkie i roztwory powinny być przygotowane w podwójnie destylowanym (dd) H2O. Ponieważ stopień uwodnienia sacharozy jest różny, końcowe stężenie wszystkich roztworów sacharozy należy określić za pomocą refraktometru.
<ol>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami bez kationów dwuwartościowych (PBS-): 137 mM NaCI, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 i 6,5 mM Na2HPO4. Dostosować pH do 7,4. Sterylizować w autoklawie (1 cykl w temperaturze 121 °C przez 15 min) i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 300 mM imidazolu: 0,204 g imidazolu w 10 ml ddH2O. Dostosować pH do 7,4 w 4 °C za pomocą HCl. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor homogenizacyjny (HB; przygotować około 100 ml): 250 mM sacharozy w 3 mM imidazolu. Doprowadzić pH do 7,4 w temperaturze 4 °C za pomocą pH-metru. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Uzupełnij HB tuż przed użyciem koktajlem inhibitorów proteazy w końcowych stężeniach odpowiadających 10 mM leupeptyny, 1 mM pepstatyny A i 10 ng/ml aprotyniny.</li>
	<li>Dla stopniowych gradientów flotacji przygotuj 62%, 39% i 35% roztwory sacharozy w 3 mM imidazolu, pH 7,4, jak opisano poniżej. Precyzyjnie określ końcowe stężenie wszystkich roztworów sacharozy za pomocą refraktometru.
	<ol>
		<li>Przygotować 100 ml 62% roztworu sacharozy w 3 mM imidazolu o pH 7,4. Rozpuścić przez wymieszanie 80,4 g sacharozy w ddH2O podgrzanym do 35 °C. Dodać 1 ml 300 mM roztworu podstawowego imidazolu i napełnić do 100 ml ddH2O. Doprowadzić pH do 7,4 w 4 °C. Przefiltrować i wysterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 100 ml 35% roztworu sacharozy w 3 mM imidazolu, pH 7,4. Rozpuścić mieszając 40,6 g sacharozy w ddH2O. Dodać 1 ml 300 ml roztworu podstawowego imidazolu i napełnić do 100 ml ddH2O. Doprowadzić pH do 7,4 w temperaturze 4 °C. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj 50 ml 39% sacharozy w 3 mM imidazolu, pH 7,4. Rozcieńczyć 62% roztwór sacharozy 35% roztworem sacharozy. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić 3 g paraformaldehydu (PFA) mieszając w 100 ml PBS podgrzanego do temperatury 60 °C, dodając kroplami 1 M NaOH; dostosować końcowe pH do 7,4 za pomocą NaOH. Sterylizować filtrem za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: 3% PFA jest odczynnikiem toksycznym.</li>
	<li>Przygotować 1 M roztwór podstawowy KCl. Rozpuścić 3,73 g KCl, mieszając z 50 ml ddH2O. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 50X stężony roztwór podstawowy zawierający 0,625 M Hepes o pH 7,0 i 75 mM MgOAc2 w ddH2O. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj podłoże montażowe. Wymieszać mieszając 2,4 g poli(alkoholu winylowego) Mw ~31 000 (PVA) z 6 g glicerolu. Dodać 6 ml ddH2O i pozostawić na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dodać 12 ml 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) i podgrzać do temperatury około 53 °C, od czasu do czasu mieszając, aż PVA się rozpuści.</li>
	<li>Klarować roztwór przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant i dodać 2,5% (w/v) 1,4-diazabicyklo-[2.2.2]oktanu (DABCO), aby zapobiec fotowybielaniu podczas wykrywania fluorescencji. Wiruj przez około 30 sekund, aby się rozpuścić. Rozlać do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla komórek HeLa w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą, 10% aminokwasami endogennymi, 10% L-glutaminą i 1% penicyliną-streptomycyną. Utrzymywać je w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.</li>
	<li>Przetransfekuj komórki na 24 godziny przed eksperymentem za pomocą GFP-RAB510, używając dostępnego w handlu odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>W razie potrzeby przygotuj frakcje endosomalne i cytozol z komórek pozbawionych białka będącego przedmiotem zainteresowania (tj. przy użyciu RNAi lub CRISPR/Cas9) i/lub z nadekspresją dzikiego lub zmutowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie frakcji endosomalnej
UWAGA: Ten protokół opisuje proste przygotowanie subkomórkowych frakcji zawierających endosomy i inne błony świetlne. W razie potrzeby można również użyć oczyszczonych frakcji endosomów11. Przygotować 2 szalki Petriego (10 cm średnicy zewnętrznej; 57 cm2) ze zlewających się komórek eksprymujących GFP-RAB5 jako materiał wyjściowy. Całkowita liczba zlewających się komórek HeLa w 2 szalkach Petriego odpowiada w przybliżeniu 2,5 x 107 komórek. W razie potrzeby endosomy można również przygotować z komórek pozbawionych białka będącego przedmiotem zainteresowania (tj. przy użyciu RNAi lub CRISPR/Cas9) i/lub z nadekspresją dzikiego lub zmutowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania, zawsze wykazującego ekspresję GFP-RAB5.
UWAGA: Wszystkie kroki protokołu frakcjonowania powinny być wykonywane na lodzie.
<ol>
	<li>Umieść szalki Petriego na mokrym metalowym talerzu w płaskim wiaderku z lodem i natychmiast umyj komórki dwukrotnie 5 ml lodowatego PBS-.</li>
	<li>Usuń wszystkie PBS z ostatniego prania i dodaj 3 ml lodowatego PBS - na naczynie. Komórki nie powinny wysychać podczas przenoszenia: w razie potrzeby umieść wiaderko z lodem na bujanej platformie, aby odpowiednio pokryć komórki płynem.</li>
	<li>Mechanicznie usuń komórki w PBS z szalek Petriego za pomocą elastycznego gumowego policjanta (tj. domowego skrobaka do komórek). Najpierw zeskrob komórki z naczyń szybkimi, okrężnymi ruchami wokół zewnętrznej strony naczynia, a następnie ruchem w dół na środku naczynia. Delikatnie zeskrob, aby uzyskać "arkusze" przyczepionych komórek. Delikatnie przenieś komórki za pomocą plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml na lodzie.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 175 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Delikatnie usunąć supernatant (SN) i dodać 1 - 3 ml HB do granulki. Używając plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem, delikatnie pipetuj raz w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki.</li>
	<li>Wirować przez 7 - 10 minut w temperaturze 1 355 x g i temperaturze 4 °C. Delikatnie wyjąć SN.</li>
	<li>Wykonaj homogenizację komórek. 
	UWAGA: Warunki powinny być łagodne, aby błony plazmatyczne komórek zostały przerwane, ale endosomy pozostały nienaruszone.
	<ol>
		<li>Dodać znaną objętość HB z inhibitorami proteazy do każdej osadki komórkowej (około 100 μl na osad komórkowy). Za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl delikatnie pipetuj w górę i w dół, aż komórki zostaną ponownie zawieszone. Nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Przygotować strzykawkę tuberkulinową o pojemności 1 ml z igłą 22G, wstępnie przepłukaną HB i pozbawioną powietrza i pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę zawiesiną komórek stosunkowo powoli (aby uniknąć tworzenia pęcherzyków powietrza), przyłóż ściętą końcówkę igły do ścianki rurki i szybko wydal zawiesinę komórkową, aby odciąć błony plazmatyczne przyłączonych komórek.</li>
		<li>Pobrać małą porcję homogenatu (około 3 μl) i rozcieńczyć ją do 50 μl HB na szkiełku podstawowym. Wymieszaj i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Zbadać homogenat pod mikroskopem z kontrastem fazowym wyposażonym w obiektyw 20x lub 40x. 
		UWAGA: W optymalnych warunkach większość komórek jest uszkodzona, ale jądra, które wyglądają jak ciemnoszare i okrągłe struktury, nie są (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
		<li>Powtarzaj kroki 3.7.3 i 3.7.4, aż większość komórek zostanie złamana; zwykle konieczne jest wykonanie 3 - 6 ruchów igłą w górę i w dół. Zachować małą porcję (10 - 30 μl) homogenatu do oznaczania białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować homogenat przez 7 minut w temperaturze 1 355 x g i temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Po odwirowaniu osad (zdefiniowany jako pastylka jądrowa; NP) zawiera jądra i supernatant (zdefiniowany jako supernatant postjądrowy; PNS) zawiera cytozol i organelle uwalniane podczas homogenizacji i w wolnej zawiesinie.</li>
	<li>Ostrożnie zbierz PNS. Zachować małe porcje (10–30 μl) PNS i NP do oznaczania białka i wyrzucić NP.</li>
	<li>Dostosuj PNS do 40,6% sacharozy, rozcieńczając 62% roztwór sacharozy z PNS, stosując stosunek 1:1,1 PNS:62% sacharozy. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Sprawdź stężenie sacharozy za pomocą refraktometru.</li>
	<li>Umieścić PNS w 40,6% sacharozie na dnie probówki do ultrawirówki. Ostrożnie zalać 2,5 ml 35% roztworu sacharozy i napełnić probówkę wirówkową HB. 
	UWAGA: Roztwory sacharozy należy układać warstwami tak, aby interfejsy były wyraźnie widoczne.</li>
	<li>Ultraodwirować gradienty przez 1 godzinę przy ̴165 000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usuń białą warstwę lipidów na wierzchu gradientu. Następnie zebrać granicę faz zawierającą endosomy, między HB a 35% sacharozy, za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką. 
	UWAGA: Frakcje endosomalne mogą być stosowane bezpośrednio w teście polimeryzacji aktynowej in vitro lub mogą być porcjowane na lodzie, zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określić stężenie białka w PNS i frakcjach endosomalnych. 
	UWAGA: Stężenie to powinno wynosić co najmniej 100 μg/ml. Do uzyskania PNS o stężeniu co najmniej 100 μg/ml (patrz uwaga powyżej) potrzeba około 2,5 x 107 komórek wyhodowanych na 2 szalkach Petriego.</li>
</ol>
4. Przygotowanie cytozolu
UWAGA: Przygotuj 2 szalki Petriego (10 cm średnicy; 57 cm2) z konflujących się komórek HeLa jako materiał wyjściowy. W razie potrzeby cytozol można również przygotować z komórek pozbawionych białka będącego przedmiotem zainteresowania (tj. przy użyciu RNAi lub CRISPR/Cas9) i/lub wykazujących nadekspresję typu dzikiego lub zmutowanej formy białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jeśli chodzi o protokół frakcjonowania endosomów, wszystkie kroki należy wykonywać na lodzie.
<ol>
	<li>Powtórz kroki 3.1 - 3.8.</li>
	<li>Umieścić PNS w probówce wirówkowej i ultrawirować przez 45 minut w temperaturze ̴250 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usuń białą warstwę na wierzchu i zbierz SN (frakcję cytozolu), nie naruszając osadu mikrosomowego. Zachować podwielokrotność frakcji cytozolu do oznaczania białka. 
	UWAGA: Cytozol może być stosowany bezpośrednio w teście polimeryzacji aktyny in vitro lub może być podawany na lód, zamrażany w ciekłym azocie i przechowywany w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określ stężenie białka w cytozolu. 
	UWAGA: Powinno to być co najmniej 3 mg/ml.</li>
</ol>
5. Test mierzący polimeryzację aktynową zależną od endosomów in vitro
UWAGA: Polimeryzacja aktyny zależna od endosomów może być przeprowadzona przy użyciu dwóch alternatywnych podejść. W pierwszym podejściu materiały są mieszane w probówce, utrwalane i przenoszone na szkiełko nakrywkowe i analizowane. W drugim podejściu, opisanym tutaj, test można przeprowadzić bezpośrednio w komorze obrazowania i można go ustalić i przeanalizować bez zakłóceń mechanicznych (<silna klasa = "xfig" >rysunek 2C). W tym drugim podejściu mieszanina testowa nie jest przenoszona z probówki do szkiełka nakrywkowego, a zatem pozostaje niezakłócona, co zmniejsza niebezpieczeństwo fizycznego zakłócenia sieci F-aktyny podczas przenoszenia. Ponadto to drugie podejście jest zgodne z analizą poklatkową polimeryzacji F-aktyny. Należy zauważyć, że nie zaobserwowano różnicy w analizie polimeryzacji F-aktyny przy żadnym z podejść. 
UWAGA: Używaj końcówek do cięcia w całym protokole.
<ol>
	<li>W probówce
	<ol>
		<li>Delikatnie wymieszaj lodowato oczyszczone endosomy GFP-RAB5 (krok 3) z cytozolem (krok 4) w stosunku 1:10 (stężenie białka) w lodowatej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Typowy eksperyment przeprowadza się z około 40 - 50 μL.</li>
		<li>Dostosuj lodowatą mieszaninę reakcyjną do końcowych stężeń 125 mM KCl (przy użyciu 1 M roztworu podstawowego KCl), 12,5 mM Hepes i 1,5 mM MgOAc2 (przy użyciu 50-krotnego roztworu podstawowego). Następnie dostosuj mieszaninę z inhibitorami proteazy do końcowych stężeń 10 mM leupeptyny, 1 mM pepstatyny A i 10 ng/ml aprotyniny. Delikatnie wymieszaj wszystkie składniki.</li>
		<li>Umieścić probówkę zawierającą mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C, bez wstrząsania, i inkubować przez żądany czas. 
		UWAGA: Zazwyczaj potrzeba około 3 minut na wykrycie polimeryzacji aktyny na endosomach i 30 minut na utworzenie rozległej sieci.</li>
		<li>W żądanym czasie (tj. 3 minuty lub 30 minut) zatrzymaj reakcję, umieszczając probówkę na lodzie i dodaj 1/10 (vol:vol) wstępnie schłodzonego 3% roztworu PFA.</li>
		<li>Dodaj 0,3:10 (vol:vol) 200 jednostek/ml (~6,6 μM) falloidyny sprzężonej z czerwono-pomarańczowym barwnikiem, aby zabarwić spolimeryzowaną aktynę.</li>
		<li>Umieścić 12 μl mieszaniny na 12 μl podłoża montażowego PVA na szkiełku podstawowym z mikroszkła. Połóż szklaną nakrywkę o wymiarach 18 x 18 mm2 na wierzchu.</li>
		<li>Przeanalizować próbkę za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W komorze obrazowania
	<ol>
		<li>Aby wykonać mikroskopijne komory obrazowe, należy użyć środka do czyszczenia plazmowego przez 1 minutę, aby wyczyścić okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm oraz okrągłą szalkę Petriego o średnicy 35 mm wyposażoną w szklane dno o średnicy 20 mm (0,16-0,19 mm).</li>
		<li>Inkubować oczyszczone powierzchnie z 1% β-kazeiną przez 20 minut, aby zminimalizować wiązanie białek ze szkłem. Umyć dwukrotnie 3 mM imidazolu.</li>
		<li>Dodać endosom i cytozol w tej samej mieszaninie testowej, co w krokach 5.1.1 i 5.1.2, do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml i uzupełnić mieszaninę testową 0,1 μg/μl rodaminy-aktyny.</li>
		<li>Dostosować końcowy współczynnik załamania światła mieszaniny do 1,375 (26,5% sacharozy) przy użyciu 39% roztworu sacharozy. 
		UWAGA: Zazwyczaj dodawany jest ten sam wolumin; Musi to jednak zostać empirycznie ponownie skorygowane w zależności od stężenia sacharozy w pobranej frakcji, oznaczonego za pomocą refraktomeru, ponieważ stężenie sacharozy może się nieznacznie zmieniać w zależności od eksperymentu.</li>
		<li>Umieścić mieszaninę na wstępnie poddanej obrobionej szalce o średnicy 35 mm (krok 5.2.1) i przykryć ją wstępnie przygotowanym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 18 mm (krok 5.2.1).</li>
		<li>Umieścić komorę w temperaturze 37 °C, nie wstrząsając.</li>
		<li>Przeanalizować próbkę za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Akwizycja i analiza obrazu sieci aktynowej
<ol>
	<li>Akwizycja obrazu
	<ol>
		<li>Uzyskaj obrazy za pomocą odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego. 
		UWAGA: Ustawienia akwizycji obrazu zostały zoptymalizowane pod kątem odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem olejowym 63X 1,25 NA. Dostosuj moc lasera (zwykle około 50%), aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja sieci aktynowej
	<ol>
		<li>Przeanalizuj mikrofotografie fluorescencyjne. Użyj oprogramowania open source CellProfiler (v2.1.1)12, aby zmierzyć ilość aktyny na endosom (można użyć alternatywnego oprogramowania).
		<ol>
			<li>Najpierw zidentyfikuj endosomy jako główny obiekt za pomocą sygnału GFP-RAB5. Następnie określ ilościowo F-aktynę związaną z poszczególnymi endosomami, wykorzystując propagację sygnału aktyny (czerwono-pomarańczowy barwnik sprzężony z falloidyną) jako obiekt wtórny.</li>
			<li>Uśrednij i znormalizuj liczbę materiału skojarzonego dla każdego obiektu z warunkiem kontrolnym.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).</li>
<li>Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+Maturation%2C+Transport+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosome Maturation, Transport and Functions.</a> Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+sorting+of+recycling+proteins+by+actin-stabilized+endosomal+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains.</a> Cell. 143 (5), 761-773 (2010).</li>
<li>Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer-mediated+endosomal+protein+sorting%3A+all+WASHed+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!</a> Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).</li>
<li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer%3A+a+master+conductor+of+endosome+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774(2014).</li>
<li>Woodman, P. G., Futter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+bodies%3A+co-ordinated+progression+to+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ESCRT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The ESCRT pathway.</a> Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li>
<li>Morel, E., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2+binding+to+endosomes+and+functions+in+endosomal+transport+are+regulated+by+tyrosine+23+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).</li>
<li>Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moesin+and+cortactin+control+actin-dependent+multivesicular+endosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis.</a> Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).</li>
<li>Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+membrane+domains+on+endosomes+in+the+recycling+pathway+visualized+by+multicolor+imaging+of+Rab4%2C+Rab5%2C+and+Rab11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11.</a> J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).</li>
<li>Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2-dependent+polymerization+of+actin+mediates+endosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis.</a> Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+and+molecular+motors+in+endosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics.</a> Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).</li>
<li>Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+II+regulates+multivesicular+endosome+biogenesis+in+the+degradation+pathway+of+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells.</a> EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).</li>
<li>Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rab5+controls+early+endosome+fusion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">rab5 controls early endosome fusion in vitro.</a> Cell. 64 (5), 915-925 (1991).</li>
<li>Wandinger-Ness, A., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+proteins+and+the+compartmentalization+of+the+endosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616(2014).</li>
<li>Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+intermediates+in+the+pathway+of+intercompartmental+transport+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system.</a> Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aktyna odgrywa kluczową rolę w dynamice błony endosomów 4,14. Wcześniej informowaliśmy, że zarodkowanie i polimeryzacja aktyny zachodzą na wczesnych endosomach, tworząc małe plamy lub sieci F-aktyny. Te sieci F-aktyny są absolutnie niezbędne do transportu błonowego poza wczesne endosomy wzdłuż szlaku degradacji. Ingerencja na dowolnym etapie tego procesu zarodkowania i polimeryzacji zapobiega dojrzewaniu endosomów, a tym samym dalszemu transportowi w kierunku<sup...

W wyższych komórkach eukariotycznych białka i lipidy są internalizowane do wczesnych endosomów, gdzie następuje sortowanie. Niektóre białka i lipidy, które są przeznaczone do ponownego wykorzystania, są włączane do kanalikowatych regionów wczesnych endosomów, a następnie transportowane do błony plazmatycznej lub do sieci trans-Golgiego (TGN)1,2. Natomiast inne białka i lipidy są selektywnie pakowane w regiony wczesnych endosomów, które wykazują wygląd wielopęcherzykowy. Regiony te rozszerzają się i po oderwaniu od wczesnych błon endosomalnych ostatecznie dojrzewają do postaci wolnych endosomalnych pęcherzyków nośnych lub ciał wielopęcherzykowych (ECV/MVB), które są odpowiedzialne za transport ładunku w kierunku późnych endosomów1,2.
Aktyna odgrywa kluczową rolę w procesie przebudowy błony związanym ze zdolnością sortowania endosomalnego i biogenezą endosomów. Sortowanie białek wzdłuż szlaków recyklingu do błony plazmatycznej lub do TGN zależy od kompleksu retromerów i powiązanych białek. Ta maszyna sortująca wydaje się być sprzężona z tworzeniem kanalików recyklingowych poprzez interakcje kompleksu retromeru, z kompleksem WASP i homologiem blizny (WASH) oraz rozgałęzioną aktyną 3,4,5. Natomiast cząsteczki przeznaczone do degradacji, w szczególności aktywowane receptory sygnałowe, są sortowane do pęcherzyków śródświetlnych (ILV) przez endosomalne kompleksy sortujące wymagane do transportu (ESCRT)2,6,7. Chociaż możliwa rola aktyny w procesie sortowania zależnym od ESCRT nie jest znana, F-aktyna odgrywa ważną rolę w biogenezie ECV/MVB i w transporcie poza wczesne endosomy. W szczególności odkryliśmy, że aneksyna A2 wiąże wzbogacone w cholesterol regiony wczesnego endosomu i wraz ze spire1 nukleatyzuje polimeryzację F-aktyny. Tworzenie rozgałęzionej sieci aktynowej obserwowane na endosomach wymaga rozgałęzionej aktywności kompleksu 2/3 białka związanego z aktyną (ARP), a także białka ERM mezyny i białka wiążącego aktynę kortaktyny8,9.
Tutaj opisujemy test in vitro oparty na mikroskopii, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach. Test ten był wcześniej używany do zbadania roli aneksyny A2 w zarodkowaniu F-aktyny oraz mezyny i kortaktyny w tworzeniu endosomalnych sieci aktynowych8,9. Dzięki temu protokołowi in vitro złożona seria reakcji zachodzących na endosomach podczas polimeryzacji aktyny staje się podatna na analizę biochemiczną i molekularną kolejnych etapów procesu, w tym zarodkowania aktyny, polimeryzacji liniowej, rozgałęziania i sieciowania.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Octan magnezuny czterowodny</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Sondy molekularne</td> falloidyny <td>A34055</td><td></td></tr><tr>Cytoszkielet<td>aktyny rodaminy</td><td>. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poli(alkohol winylowy), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-kazeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0,22 &mu; m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe 10 cm szalki do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta Pasteura</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15-mL probówka polipropylenowa</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna 22G 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki Luer-slip 1mL bez igła</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Micro</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm szkiełko nakrywkowe</td><td>szklane Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 probówka wirówkowa</td><td>Beckman 344062</td><td></td><td></td></tr> rurka <tr><td>wirówkowa TLS-55</td><td>Redlica Beckman</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; L żółta końcówka</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1,000-&mu; L Niebieska końcówka z podziałką Starlab</td><td></td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe o średnicy 18 mm</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe naczynie o średnicy 35 mm ze szklanym dnem 20 mm (0,16 - 0,19 mm)</td><td>Refraktometr In vitro Scientific</td><td>D35-20-1,5-N</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultrawirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka stołowa</td><td>Redlica Beckman</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60</td><td>Rotor Redlica Beckman</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55</td><td>Rotor Redlica Beckman</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Carl Odczynnik</td> do transfekcji Zeiss <td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>Kawałek gumy silikonowej o długości około 2 cm, przycięty pod bardzo ostrym kątem i przymocowany do metalowego pręta lub przytrzymany kleszczami</td></tr><tr><td>Refraktometr</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ oprogramowanie</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polimeryzacja f-aktyny na wczesnych endosomach

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Wiele wczesnych funkcji endosomów, szczególnie sortowanie białek ładunkowych i deformacja błony, zależy od plam krótkich włókien F-aktyny zarodkowanych na błonie endosomalnej. Opracowaliśmy test in vitro oparty na mikroskopii, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje genetyczne i biochemiczne. Frakcje endosomalne są otrzymywane przez flotację w gradientach sacharozy z komórek eksprymujących wczesne białko endosomalne GFP-RAB5. Frakcje cytozolowe przygotowuje się z oddzielnych partii komórek. Zarówno frakcja endosomalna, jak i cytozolowa mogą być przechowywane w stanie zamrożonym w ciekłym azocie, jeśli zajdzie taka potrzeba. W teście frakcje endosomalną i cytozolową miesza się, a mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37 °C w odpowiednich warunkach (np. siła jonowa, środowisko redukujące). W pożądanym czasie mieszanina reakcyjna jest utrwalana, a F-aktyna ujawnia się z falloidyną. Zarodkowanie i polimeryzacja aktyny są następnie analizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym miejscu informujemy, że test ten można wykorzystać do zbadania roli czynników, które są zaangażowane w zarodkowanie aktyny na błonie lub w późniejsze wydłużanie, rozgałęzianie lub sieciowanie włókien F-aktyny.

Aby uzyskać wgląd w proces formowania się skupisk F-aktyny na błonach wczesnych endosomów, zastosowano protokół opisany w Rycina 2Krótko mówiąc, komórki poddano transfekcji GFP-RAB5, a następnie przygotowano wczesne endosomy poprzez frakcjonowanie subkomórkowe. Oczyszczone wczesne endosomy inkubowano z cytozolem, aby dostarczyć samą aktynę, a także inne czynniki potencjalnie zaangażowane w reakcję. Po zakończeniu okresu inkubacji reakcję zatrzymano poprzez ut...

Wczesne funkcje endosomów zależą od polimeryzacji F-aktyny. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test in vitro, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje biochemiczne i genetyczne.

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Ogólnym celem tego mikroskopowego testu in vitro jest badanie polimeryzacji aktyny z endosomów in vitro. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu transportu błonowego i biologii aktyny, takie jak rola aktyny w szlakach kwaśnych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość rekonstruowania nukleacji i polimeryzacji aktyny F na błonach wczesnych endosomów w probówce.Dzięki temu ta złożona seria reakcji staje się podatna na moje manipulacje chemiczne. Procedurę zaprezentują Jorge Larios i Olivia Muriel z laboratorium. Rozpocznij od umieszczenia naczyń z komórkami HeLa na mokrej metalowej płycie w płaskim wiadrze z lodem.Następnie komórki należy przemyć dwukrotnie 5 ml lodowatego PBS. Po usunięciu PBS z ostatniego płukania, do każdej płytki należy dodać 3 ml lodowatego PBS. Następnie, używając elastycznego gumowego skrobaka (policemana), należy szybko zdrapać komórki z płytek, wykonując okrężne ruchy wzdłuż zewnętrznej krawędzi płytki.Następnie wykonaj ruch w dół w centralnej części naczynia. Delikatnie zeskrob komórki, aby uzyskać płaty przytwierdzonych komórek. Następnie użyj plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem, aby delikatnie przenieść komór

in-vitro-polymerization-of-f-actin-on-early-endosomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Poznaj metodę polimeryzacji F-aktyny na wczesnych endosomach in vitro przy użyciu komórek HeLa. Ta technika pozwala na rekonstytucję nukleacji i polimeryzacji aktyny na błonach endosomalnych.

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

Przeglądaj więcej filmów