Name: Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego. Ta metoda umożliwia badanie błędnie złożonych białek w chorobach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują doktorom Jimowi Lahowi i Allanowi Leveyowi, Emory Department of Neurology, za pomocne komentarze i sugestie. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu Accelerating Medicine Partnership (U01AG046161-02), Emory Alzheimer's Disease Research Center (P50AG025688) oraz grantu National Institute on Aging (R01AG053960-01) dla NTS. Badania te były również częściowo wspierane przez Neuropathology Core w ramach grantu Emory Neuroscience NINDS Core Facilities, P30NS055077.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie tkanki mózgowe zostały pozyskane z Banku Mózgu Centrum Badań nad Chorobą Alzheimera (ADRC) Emory. Ludzkie tkanki pośmiertne zostały pozyskane zgodnie z odpowiednimi protokołami Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB).
1. Homogenizacja i frakcjonowanie
<ol>
	<li>Selekcja tkanek 
	UWAGA: Zamrożona pośmiertna tkanka kory czołowej ze zdrowej grupy kontrolnej (Ctl) i patologicznie potwierdzone przypadki AD zostały wybrane z banku mózgu Emory ADRC (n = 2). Pośmiertną ocenę neuropatologiczną rozmieszczenia blaszek amyloidowych przeprowadzono zgodnie z półilościowymi kryteriami punktacji Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease 24, chociaż patologia splątania neurofibrylarnego została oceniona zgodnie z systemem oceny stopnia zaawansowania Braaka. 16
	<ol>
		<li>Uzyskaj zamrożoną pośmiertną tkankę mózgową od zdrowej grupy kontrolnej (Ctl) i patologicznie potwierdzonych przypadków AD. Wykorzystując pojemniki z suchym lodem, kleszcze i żyletkę, wyciąć ~ 250 mg porcji istoty szarej z każdej próbki tkanki na tarowanych jednorazowych łodziach wagowych, uważając, aby zapobiec rozmrożeniu tkanki. Zapisać masę każdego kawałka, który ma być homogenizowany.</li>
		<li>Wyciąć ~ 250 mg istoty szarej za pomocą kleszczy i brzytwy, dokonując oględzin w celu zlokalizowania granicy faz między zewnętrzną istotą szarą a wewnętrzną istotą białą. Unikaj istoty białej, a co ważniejsze, wszelkich dużych naczyń krwionośnych lub krwawych obszarów, opon mózgowych lub pajęczynówki. Utrzymuj tkankę zamrożoną podczas procesu cięcia, pracując szybko i często, umieszczając łódkę wagową z tkanką mózgową w polistyrenowych pojemnikach z suchym lodem.</li>
		<li>Zapisać dokładną masę istoty szarej wyciętej z każdego zamrożonego kawałka za pomocą wagi analitycznej. Obliczyć objętość buforu o niskiej zawartości soli (LS) (patrz Tabela 1) potrzebnego do homogenizacji z beczki (5 ml/g lub 20% w/v).</li>
		<li>Przygotuj 10 ml buforu LS z 1x koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy i schłodź na lodzie.</li>
		<li>Wyjmij zważoną chusteczkę i łódkę wagową z suchego lodu i pokrój w kostkę na kawałki o wymiarach około 2 x 2 mm podczas rozmrażania. Przenieść do 2 ml wstępnie schłodzonej probówki homogenizatora z beczki na lodzie.</li>
		<li>Dodaj 5 ml / g (20% w/v) lodowatego buforu o niskiej zawartości soli (LS) z koktajlem 1X inhibitorów proteazy i fosfatazy.</li>
		<li>Homogenizuj tkankę mózgową na lodzie za pomocą około 10 uderzeń tłuczka A o wysokim prześwicie i 15 uderzeń tłuczka B o niskim prześwicie.</li>
		<li>Przenieść cały homogenat do probówki polipropylenowej o pojemności 2 ml za pomocą szklanej pipety Pasteura. Oznacz probówkę symbolem "TH" (Total Homogenate), numerem tkanki i objętością homogenatu. Podajmy 0,8 ml do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Nadmiar homogenatu może być podobnie podzielony i przechowywany w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Do każdej podwielokrotności 0,8 ml dodać po 100 μl 5 M NaCl i 10% (w/v) sarkozylu do stężeń odpowiednio 0,5 M i 1% w/v. Dobrze wymieszaj probówki przez odwrócenie i inkubuj na lodzie przez 15 minut. Oznaczyć probówki symbolem "TH-S" (Total Homogenate-Sarkosyl), aby wskazać, że homogenaty znajdują się w buforze sarkozylu (Tabela 1).</li>
		<li>Sonikuj każdą probówkę przez trzy 5-sekundowe impulsy o amplitudzie 30% na lodzie (maksymalna intensywność = 40%) za pomocą sondy z mikrokońcówką. </li>
		<li>Oznaczyć stężenia białek w homogenatach za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA)25 method. 
		UWAGA: Średnie stężenie białka w homogenatach TH-S przygotowanych w dawce 5 ml LS na gram tkanki wynosi 15-20 mg/ml. Homogenaty mogą być natychmiast frakcjonowane lub przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
		<li>Rozcieńczyć homogenaty TH-S do 10 mg / ml za pomocą lodowatego buforu Sark (Tabela 1) z 1x inhibitorami proteazy i fosfatazy.</li>
		<li>Przenieść 5 mg białka (0,5 ml) z każdego homogenatu TH-S do probówek ultrawirówek z poliwęglanu o pojemności 500 μl i zrównoważyć parami za pomocą buforu sark. Załadować probówki do wstępnie schłodzonego rotora i ultrawirować przy 180 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść rozpuszczalne w sarkozylu supernatanty (S1) do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: (Opcjonalne mycie) Dodać 200 μl buforu sark do probówek ultrawirówek zawierających frakcje nierozpuszczalne w detergentach (P1) i usunąć granulki (P1) z dna probówek ultrawirówek za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Krótko wiruj pulsacyjnie odwrócone probówki przez 2-3 s (≤2,500 x g) na mikrowirówce, aby przenieść granulki (P1) i bufor do probówek o pojemności 1,5 ml poniżej. Zawiesić nierozpuszczalne granulki (P1) w buforze sark, pipetując w górę i w dół, aby upewnić się, że osad został rozerwany.</li>
		<li>Zrównoważyć parami i odwirować przy 180 000 x g przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 4 °C. </li>
		<li>Odrzucić opcjonalny supernatant do przemywania (S2) i inkubować nierozpuszczalne w sarkozylu granulki (P2) w 50-75 μl buforu mocznikowego (Tabela 1) z 1x (koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu rozpuszczenia osadu. 
		UWAGA: Przed użyciem podgrzej bufor mocznikowy do temperatury pokojowej, aby uniknąć wytrącania się SDS. W przypadku zastosowań wrażliwych na detergenty należy pominąć SDS w buforze mocznikowym i rozważyć umycie nierozpuszczalnego osadu (P2) w buforze o niskiej zawartości soli przed ponownym zawieszeniem w buforze mocznikowym.</li>
		<li>Przenieś zawieszone granulki (P2) do probówek o pojemności 0,5 ml i użyj krótkiej (1 s) sonikacji mikrokońcówek o amplitudzie 20% (maksymalna intensywność = 40%), aby w pełni rozpuszczono granulki.</li>
		<li>Oznaczyć stężenia białek we frakcjach rozpuszczalnych w sarkozylu (S1) i nierozpuszczalnych (P2) przy użyciu metody oznaczania BCA. Frakcje te należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunoblotting
<ol>
	<li>Western blotting 
	UWAGA: Western blotting został wykonany zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami z niewielkimi modyfikacjami. 5,10
	<ol>
		<li>Przygotować 40 μg próbek całkowitych homogenatów (TH-S), frakcji rozpuszczalnych w sarku (S1) i nierozpuszczalnych w sarku (P2) w 1X buforze próbek Laemmli SDS z 5 mM TCEP pH 7. Próbki inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Załaduj próbki na prefabrykowany 10-dołkowy żel Bis-Tris SDS-PAGE o stężeniu 4-12%. Elektroforeza pod napięciem 80 V przez pierwszy centymetr (10 min) i 120 V przez pozostałą część (60 min) lub do momentu, gdy barwnik śledzący dotrze do dna żelu.</li>
		<li>Użyj świeżej żyletki i noża do żelu, aby rozciąć wstępnie odlewaną kasetę z żelem. Delikatnie odetnij grzebienie i sam spód żelu świeżą żyletką.</li>
		<li>Zawiesić nierozpuszczalne granulki (P1) w 200 μl buforze sark z 1x, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Przenieść na membranę nitrocelulozową o grubości 0,2 μm metodą suchego transferu na bibułce (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Zablokuj membranę w buforze blokującym (BB) bez Tween 20 na 30 min, a następnie BB z 0,05% Tween 20 (BB/T) na 30 min. Po zablokowaniu przepłukać membranę w TBS/T (0,1% Tween 20) przez 5 minut, aby usunąć nadmiar buforu blokującego.</li>
		<li>Przygotować rozcieńczenia pierwszorzędowe w stosunku 1:1,000 przeciwciał pierwszorzędowych pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 i EEA1 w BB/T (0,05% Tween 20).</li>
		<li>Inkubować błony w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 °C z mieszaniem okrężnym. Płukać membranę w TBS/T przez 3 x 15 min.</li>
		<li>Sondować membranę rozcieńczeniem 1:20 000 znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała wtórnego bliskiej podczerwieni w BB / T przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce. Płukać membranę przez 3 x 10 min w TBS/T i 2 x 5 min w TBS.</li>
		<li>Zeskanuj membranę za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni o odpowiedniej długości fali wzbudzenia (np. 700 nm (kanał czerwony) dla barwnika podczerwonego, 680 kozy anty-mysiej IgG (H+L) wtórnej i 800 nm (kanał zielony) dla barwnika podczerwonego, 790 osła anty-króliczej IgG (H+L) wtórnej).</li>
		<li>Użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo natężenie sygnału i wykonać pomiary densytometryczne zgodnie z instrukcjami producenta, upewniając się, że ustawienie automatycznego tła jest ustawione na uśrednianie całego tła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991(1991).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li>
<li>Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li>
<li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyloid+Beta+Peptide%3A+A+Chemist%27s+Perspective.+Role+in+Alzheimer%27s+and+Fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li>
<li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li>
<li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer%27s+Disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li>
<li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJulien%2C+C+%22Amyloid+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22">Amyloid Proteins: Methods and Protocols</a>. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).</li>
<li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).</li>
<li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li>
<li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility%2C+including+A%CE%B2+but+not+tau%2C+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li>
<li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+%CE%B1-Synuclein+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+%CE%B1-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+%CE%B1-Synucleinopathy+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130(2006).</li>
<li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/29/1_Supplement/712.3">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1759558">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived%2C+Toxic%2C+High+Mass+Amyloid+%CE%B2-Protein+%28A%CE%B2%29+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+%CE%B2-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li>
<li>Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+%28snRNPs%29+aggregate+in+Alzheimer%27s+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).</li>
<li>Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+change%2C+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li>
<li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer%27s+Disease+%28CERAD%29.+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer%27s+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li>
<li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subfraction+of+A%CE%B2+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule przedstawiamy i omawiamy skrócony jednoetapowy protokół frakcjonowania detergentem, który ma zastosowanie w szerokiej gamie zastosowań eksperymentalnych, począwszy od analizy proteomicznej opartej na spektrometrii mas, a skończywszy na funkcjonalnych testach błędnego fałdowania białek i western blot. 5,6,7,10 Ta metodologia jest prawdopodobnie najbardziej skuteczna, gdy jest stosowana do badania neurodegeneracyjnych proteinopatii, takich jak choroba Alzheimera, AL...

Choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), choroba Huntingtona (HD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i blisko związane choroby prionowe to proteinopatie charakteryzujące się stopniowym gromadzeniem się nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych w mózgu z towarzyszącym spadkiem funkcji poznawczych. 1,2 Uważa się, że ta wspólna cecha patologiczna odgrywa kluczową rolę w etiologii i patofizjologii tych chorób neurodegeneracyjnych. 2 Te agregaty zazwyczaj składają się z polimerowych włókien amyloidowych, które składają się z powtarzających się jednostek nieprawidłowo sfałdowanego białka wykazującego krzyżową strukturę β. 1,2,3,4 Biochemicznie, agregaty amyloidowe są wysoce odporne na chemiczną lub termiczną denaturację i solubilizację,3, co stanowi wyjątkowe wyzwanie dla ich oczyszczania, analizy i badania za pomocą tradycyjnych technik biochemicznych. 2,5,6,7,8,9,10,11 Nic dziwnego, że frakcja białkowa nierozpuszczalna w detergentach była przedmiotem wielu badań nad patofizjologią chorób neurodegeneracyjnych obejmujących akumulację nieprawidłowo sfałdowane białka. 6,12,13,14
Techniki frakcjonowania biochemicznego były często wykorzystywane do wzbogacania frakcji nierozpuszczalnej w detergentach z pośmiertnych homogenatów mózgu. 6,12,13,14 Jedną z najpowszechniejszych metod jest sekwencyjna ekstrakcja homogenatów tkankowych za pomocą i detergentów o rosnącym stopniu rygorystyczności, a następnie ultrawirowanie w celu podzielenia frakcji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych. Powszechnie stosowany protokół frakcjonowania sekwencyjnego6,14 polega na homogenizacji zamrożonych próbek tkanek w bezdetergentowym buforze o niskiej zawartości soli (LS), a powstałe w ten sposób nierozpuszczalne granulki są następnie sekwencyjnie ekstrahowane zawierającymi detergenty o wysokiej zawartości soli, detergenty niejonowe, sacharozę, detergenty jonowe i wreszcie chaotropy, takie jak mocznik. 6,14 Oczywistą wadą takich protokołów sekwencyjnego frakcjonowania jest znaczne zaangażowanie czasu i pracy wymagane do ich wykonania. Łącznie z homogenizacją i ultrawirowaniem, typowy pięcioetapowy protokół frakcjonowania może zająć kilka godzin, a nawet dni. 4,6,7,10,15,16,17,18 Dodatkowo, tyle samo patologicznych agregatów białkowych pozostaje nierozpuszczalnych we wszystkich warunkach, z wyjątkiem najtrudniejszych19,20 Większość generowanych frakcji ma ograniczoną wartość. W związku z tym mniej rygorystyczne etapy frakcjonowania wykorzystujące wysokie stężenia soli i niejonowe detergenty są w dużej mierze zbędne.
Poprzednie badania wykazały, że jonowy detergent N-lauryl-sarkozyna (sarkozyl) jest doskonałym kandydatem do uproszczonego jednoetapowego protokołu frakcjonowania detergentu. 5,6,12,13,14,21,22,23 Jako detergent denaturujący, sarkozyl jest wystarczająco rygorystyczny, aby rozpuścić zdecydowaną większość natywnie pofałdowanych białek w mózgu bez rozpuszczania nieprawidłowo sfałdowanych agregatów białkowych beta-amyloidu (Aβ),6,11 fosforylowane tau (pTau),6 TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43),14 alfa-synukleina,12,13 trzęsawka,23 lub U1 małe jądrowe rybonukleoproteiny (U1 snRNPs), takie jak U1-70K. 5,21,22Ponieważ sarkozyl jest mniej rygorystyczny niż wszechobecny anionowy detergent dodecylosiarczan sodu (SDS), zachowuje mniej wytrzymałe oligomeryczne formy nieprawidłowo sfałdowanych agregatów białkowych, które nie są w stanie wytrzymać obróbki SDS. 9
Poprzednio opisaliśmy skrócony protokół frakcjonowania detergentem, który osiągnął wyniki porównywalne z bardziej pracochłonnymi metodologiami frakcjonowania sekwencyjnego. 5 Pomijając mniej rygorystyczne etapy frakcjonowania, byliśmy w stanie opracować łatwy jednoetapowy protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z pośmiertnego ludzkiego mózgu. 5 Ten szczegółowy protokół opisany tutaj doskonale nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań eksperymentalnych, począwszy od Western blotting i proteomiki opartej na spektrometrii mas, a skończywszy na funkcjonalnych testach błędnego fałdowania białek i agregacji. 5,6,21

<table><tbody><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz i fosfataz, bez EDTA (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td> koktajl <td>inhibitorów proteazy i fosfataz</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator System (ultradźwięki)</td><td>Ultrasonograf Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>mikrokońcówką Ultrawirówka</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>z chłodzeniem</td></tr><tr><td>Wirnik TLA120.1</td><td>Wirnik ultrawirówkowy</td> <td>Beckman Coulter</td><td>362224</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) probówki poliwęglanowe, grubościenne</td><td>Probówki do ultrawirówek Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>do wirnika TLA120.1</td></tr><tr><td>Bufor do próbek 4X SDS Domowy</td> roztwór <td></td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP, neutralne pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>środek redukujący</td></tr> <tr><td>(TBS) bufor blokujący</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>bufor blokujący</td></tr> <tr><td>(TBS) bufor blokujący + 0,05% Tween 20 Thermo</td><td>Fisher</td><td>37543</td><td>bufor blokujący i rozcieńczalnik przeciwciał</td></tr><tr><td>4-12% Żele Bolt Bis-Tris Plus, 10-dołkowe żele</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>prefabrykowane żele SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Bufor do biegania MES SDS (20X)</td><td>Bufor do biegania Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE Bufor do biegania</td></tr><tr><td>Sól sodowa N-lauroilosarkozyny (sarkozyl)</td><td>Sigma Detergent Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Tau-2 (pan tau)</td><td>Przeciwciała Chemicon</td><td>MAB375</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antyfosfo-treoniny 231 Przeciwciało Tau</td><td>Przeciwciała Millipore</td><td>MAB5450</td><td>Przeciwciała</td></tr><tr><td>anty-fosfo-seroiny 202 i treoniny 205 Przeciwciało Tau (AT8)</td><td>Przeciwciała Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-wczesnego antygenu endosomów 1 (EEA1)</td><td>abcam</td><td>Przeciwciała ab2900</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Przeciwciała drugorzędowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H+L) osła</td><td>Przeciwciała Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td></td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Transfer żelu</td></tr><tr><td>iBlot2 Stacki transferowe, nitroceluloza, mini</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>Transfer żelu</td></tr></tbody></table>

wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

W tym badaniu opisujemy skrócony protokół frakcjonowania jednoetapowego do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego. Jonowy detergent N-laurylo-sarkozyna (sarkozyl) skutecznie rozpuszcza natywnie pofałdowane białka w tkance mózgowej, umożliwiając wzbogacenie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z szerokiego zakresu neurodegeneracyjnych proteinopatii, takich jak choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona i stwardnienie zanikowe boczne oraz choroby prionowe. Ludzka kontrola i pośmiertne tkanki mózgowe AD zostały zhomogenizowane i sedymentowane przez ultrawirowanie w obecności sarkozylu w celu wzbogacenia nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych, w tym patologicznego fosforylowanego tau, podstawowego składnika splątków neurofibrylarnych w AD. Western blot wykazał różnicową rozpuszczalność zagregowanego fosforylowanego tau i rozpuszczalnego w detergentach białka, wczesnego antygenu endosomowego 1 (EEA1) w grupie kontrolnej i mózgu AD. Analiza proteomiczna wykazała również wzbogacenie β-amyloidu (Aβ), tau, snRNP70 (U1-70K) i apolipoproteiny E (APOE) w nierozpuszczalne w sarkozylu frakcje mózgu AD w porównaniu z frakcjami kontrolnymi, zgodnie z wcześniejszymi strategiami frakcjonowania tkanek. W związku z tym ten prosty protokół wzbogacania jest idealny do szerokiego zakresu zastosowań eksperymentalnych, począwszy od testów Western blotting i funkcjonalnej koagregacji białek, a skończywszy na proteomice opartej na spektrometrii mas.

Skrócony jednoetapowy protokół frakcjonowania sarkozylowego został wykorzystany do wzbogacenia agregatów białkowych nierozpuszczalnych w detergencie z mózgów postmortem osób z grupy kontrolnej i chorych na AD (Rycina 1). Białka z frakcji TH-S, S1, S2 i P2 rozdzielono metodą SDS-PAGE, utrwalono przez 15 min w buforze utrwalającym z błękitem Coomassie, a następnie delikatnie zabarwiono buforem barwiącym Coomassie Brilliant Blue G-250. Etap resuspensji jest opcj...

Opisany jest skrócony protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego.

Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu frakcjonowania jest wzbogacenie frakcji agregatów białkowych nierozpuszczalnych w detergencie z ludzkiej tkanki mózgowej pobranej po śmierci. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurodegeneracji, takie jak identyfikacja i charakterystyka błędnie sfałdowanych agregatów białkowych w przebiegu choroby. Główną zaletą tej techniki jest szybkie wzbogacenie i izolacja agregatów białkowych nierozpuszczalnych w detergencie z tkanki mózgowej w krótkim czasie.Procedurę tę zaprezentuje Tram Nguyen, technik z mojego laboratorium. Należy pozyskać zamrożoną tkankę mózgu pobraną po śmierci od zdrowej grupy kontrolnej oraz od osób z patologicznie potwierdzoną chorobą AD. Za pomocą pęsety i żyletki należy wyciąć fragmenty istoty szarej o masie około 250 mg z każdej próbki tkanki. Pozostawić segment mózgu do rozmrożenia na jedną minutę.Teraz, podczas rozmrażania, pokrój fragment tkanki w kostkę o boku około 2 mm. Przenieś go do schłodzonej rurki homogenizatora Dounce o pojemności 2 mL, umieszczonej na lodzie. Pamiętaj, aby unikać białej istoty oraz dużych naczyń krwionośnych.Należy pracować szybko i umieszczać tkankę w jednorazowych łódeczkach wagowych od TARE. Należy zadbać o to, aby tkanka nie rozmroziła się, często umieszczając łódeczkę z tkanką mózgu w pojemnikach polistyrenowych z suchym lodem. Po wycięciu i zważeniu wszystkich wymaganych fragmentów tkanki, należy wyjąć łódeczkę zawierającą fragment tkanki z suchego lodu.Następnie dodać pięć mililitrów lodowatego buforu o niskiej zawartości soli z koktajlem inhibitorów proteaz i fosfataz na każdy gram tkanki i homogenizować na lodzie, wykonując około 10 ruchów tłuczkiem A o dużym prześwicie oraz 15 ruchów tłuczkiem B o małym prześwicie. Następnie za pomocą dziewięciocalowej szklanej pipety Pasteura przenieść każdy homogenat do opisanej dwumililitrowej probówki polipropylenowej. Pozostały homogenat podzielić na kolejne opisane probówki o pojemności 1,5 mililitra w podobny sposób w celu przechowywania w temperaturze minus 80 °C. Aby przystąpić do frakcjonowania, dodać 100 µL pięciomolarnego NaCl oraz 100 µL 10% sarkosylu do każdej porcji o objętości 0,8 mililitra.Wymieszaj dokładnie przez odwracanie. Następnie inkubuj na lodzie przez 15 minut. Po inkubacji użyj sonikatora z mikrosondą, aby przyłożyć trzy pięciosekundowe impulsy przy amplitudzie 30%.Po oznaczeniu stężeń białek w homogenatach metodą kwasu bicinchoninowego, do każdej próbki należy dodać lodowaty bufor Sارك z inhibitorami proteaz i fosfataz, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/mL. Następnie 500 µL każdej próbki należy przenieść do 500-mikrolitrowych poliwęglanowych probówek do ultrawirówki. Probówki należy umieścić w schłodzonym rotorze i wirować w ultrawirówce przy 180 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu przenieś rozpuszczalne w sarkosylu nadnadkliny S1 do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -80 °C. Do probówek do ultrawirowania zawierających nierozpuszczalne w detergencie frakcje P1 dodaj 200 µl buforu sarkozylowego i za pomocą końcówki pipety oderwij osady z dna probówek. Następnie przenieś resuspendowane osady P1 do nowych probówek do ultrawirowania o pojemności 500 µl, zrównoważ masę probówek i wiruj przy 180 000 ×g przez kolejne 30 minut w temperaturze 4 °C.Odlej supernatant S2. Następnie dodaj od 50 do 75 µL buforu mocznikowego z koktajlem inhibitorów proteaz i fosfataz do osadów nierozpuszczalnych w sarkosylu i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić osad P2. Po inkubacji przenieś resuspendowane osady P2 do opisanych probówek o pojemności 0,5 ml i całkowicie rozpuść osady, stosując krótką, jednosekundową sonikację mikrokońcówką przy amplitudzie 20%.Wyznaczyć stężenia białek w frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w sarkosylu za pomocą metody BCA. Przygotować próbki o masie 40 µg całkowitego homogenatu, frakcji S1 rozpuszczalnej w sarkosylu oraz frakcji P2 nierozpuszczalnej w sarkosylu w 1x buforze do próbek Laemmli SDS-PAGE z dodatkiem 5 mM TCEP przy pH 7. Inkubować próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.Nanieś próbki na gotowe żele SDS-PAGE Bis-Tris o stężeniu od 4% do 12% z 10 dołkami. Przeprowadź elektroforezę przy napięciu 80 V przez pierwszy centymetr, a następnie przy 120 V przez około godzinę lub do momentu, gdy barwnik śledzący dotrze do dolnej krawędzi żelu. Zanurz kasety z gotowymi żelami w wodzie destylowanej, a następnie otwórz je, używając nowej żyletki i noża do żeli.Ostrożnie odetnij grzebienie oraz sam dół każdego żelu za pomocą nowej żyletki. Przenieś białka na membrany nitrocelulozowe o porach 0,2 µm, stosując metodę suchego transferu w urządzeniu do blottingu. Po transferze inkubuj membrany w buforze blokującym bez Tween-20 przez 30 minut, a następnie w buforze blokującym z 0,5% Tween-20 przez kolejne 30 minut.Po blokowaniu przepłucz błony w TBS z 0,1% Tween-20 przez pięć minut, aby usunąć nadmiar buforu blokującego. Przygotuj rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych 1:1 000 w buforze blokującym z 0,5% Tween-20. W tej procedurze zastosowano przeciwciała przeciwko Phospho-Tau pT231 oraz EEA1.Inkubować membrany w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy mieszaniu okrężnym. Następnego dnia przemyć membrany trzy razy w buforze TBS z 0,1% Tween-20, po 15 minut każdorazowo. Inkubować membrany z przeciwciałem wtórnym znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni w rozcieńczeniu 1:20 000 w buforze blokującym z 0,5% Tween-20 przez 60 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności, na wytrząsarce.Po inkubacji przemyj membranę trzykrotnie przez 10 minut w buforze TBS z 0,1% Tween-20 oraz dwukrotnie w buforze TBS przez pięć minut za każdym razem. Zeskanuj membranę za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni, używając odpowiedniej długości fali wzbudzenia dla zastosowanego przeciwciała wtórnego. Ten żel barwiony Coomassie pokazuje 20 mcg białka z frakcji TH-S, S1, S2 i P2.Analiza Western blot wyraźnie wykazuje, że w mózgu w chorobie AD patologiczne, wysokocząsteczkowe fosforylowane białko Tau agreguje z frakcjami nierozpuszczalnymi w sarkosylu, a w frakcjach sarkosylu pozostaje bardzo mało fosfo-Tau. EEA1 wykorzystano jako ogólny marker dla większości natywnych, niepatologicznych białek, które są z natury rozpuszczalne w sarkosylu i przenikają do frakcji S1 zarówno w mózgu kontrolnym, jak i w przypadku AD. Co istotne, sygnał dla EEA1 w frakcji rozpuszczalnej był nieco słabszy w porównaniu z frakcją TH-S, co wskazuje, że niewielka pula EEA1 jest prawdopodobnie nierozpuszczalna w sarkosylu, choć znajduje się poniżej granicy wykrywalności metodą Western blot przy użyciu tego konkretnego przeciwciała.Rysunek ten przedstawia analizę proteomiczną patologicznych białek AD z zastosowaniem jednowyprowadzeniowego lub wielostopniowego protokołu frakcjonowania. Technika jednowyprowadzeniowego frakcjonowania może być korzystna w przypadku białek o niskiej obfitości, ponieważ ogólne straty próbek są znacznie zredukowane. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wyciąć z tkanki mózgowej jak najwięcej istoty białej.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak proteomika oparta na spektrometrii mas, w celu zidentyfikowania i scharakteryzowania głównych komponentów białkowych agregatów patologicznych w chorobach degeneracyjnych.

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad oznaczeniami epigenetycznymi w chromatynie, ponieważ większość analiz nie zapewnia rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Neurony są zazwyczaj przemieszane z glejem i innymi komórkami nieneuronalnymi. Przedstawiamy protokół izolacji i gromadzenia jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

Opisujemy technikę przygotowania klarownych homogenatów kory mózgu człowieka, rozdziału białek metodą SDS-PAGE, odsłaniania antygenów oraz immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomeryczne i multimeryczne Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Detekcja multimerów A&beta; w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Nowy gatunek komórkowego białka prionowego (PrPC) został niedawno zidentyfikowany w niezakażonych ludzkich mózgach przy użyciu opisanych tutaj metod. Metody te mogą być wykorzystane do izolacji różnych gatunków PrP, a niektóre z nich są również przydatne w izolacji innych agregatów białek o błędnej strukturze z ludzkich mózgów.

Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w prawidłowym ludzkim mózgu

Ten film demonstruje protokół izolacji włókienek amyloidu z ekstraktu tkanki mózgowej myszy za pomocą wirowania gradientu gęstości i trawienia białek nieamyloidowych.

Izolacja włókien amyloidowych z ekstraktu z tkanki mózgowej

Ten film wyjaśnia proces izolowania i wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z zamrożonej pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Demonstruje kluczowe etapy, w tym homogenizację, obróbkę detergentami, sonikację i ultrawirowanie w celu oddzielenia i oczyszczenia nierozpuszczalnych agregatów. Ostatnim etapem jest solubilizacja agregatów w buforze mocznikowym w celu dalszej analizy.

Izolacja nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Niniejsze badanie przedstawia metody eksperymentalne biochemicznie charakteryzujące GFAP i jego mutacje wywołujące choroby, koncentrując się na składaniu, agregacji i modyfikacji potranslacyjnej filamentu. Analizowano białka GFAP o wysokiej czystości, co ujawniło wgląd w mechanizmy choroby Alexandra, które mogą stanowić ramy do badania potencjalnych celów terapeutycznych oraz zrozumienia mutacji GFAP i powiązanych schorzeń.

Eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą

Poznaj protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego. Ta metoda umożliwia badanie błędnie złożonych białek w chorobach neurodegeneracyjnych.

Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

Przeglądaj więcej filmów