Name: Podejście do pobierania próbek z 4 naczyń w integracyjnych badaniach fizjologii łożyska człowieka in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Poznaj metodę pobierania próbek z czterech naczyń do badania fizjologii łożyska człowieka in vivo. Technika umożliwia analizę transferu składników odżywczych i metabolizmu w czasie rzeczywistym podczas ciąży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przede wszystkim serdecznie dziękujemy matkom, które wzięły udział w tym projekcie. Następnie dziękujemy całemu personelowi, który pomagał i ułatwiał procedurę pobierania próbek, anestezjologowi, pielęgniarce anestezjologowi i pielęgniarkom chirurgicznym. Projekt nie byłby możliwy bez dofinansowania ze strony Regionalnego Urzędu ds. Zdrowia w Norwegii Południowo-Wschodniej i Norweskiej Jednostki Doradczej ds. Zdrowia Kobiet Uniwersytetu w Oslo oraz lokalnych funduszy zapewnionych przez Szpital Uniwersytecki w Oslo.

Badanie zostało zatwierdzone przez urzędników ds. ochrony danych w Szpitalu Uniwersyteckim w Oslo oraz Regionalną Komisję ds. Etyki Badań Medycznych i Zdrowotnych w południowej Norwegii (nr 2419/2011). Wszyscy uczestnicy podpisali pisemną zgodę na udział w badaniu w momencie włączenia do grupy.
1. Przygotowania
UWAGA: Harmonogram procedur przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Oś czasu procesu obsługi próbek; schemat przedstawiający gromadzenie danych klinicznych, transport próbek i analizę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat blokowy opisujący ramy czasowe oraz personel zaangażowany w procedurę pobierania próbek z 4 naczyń. 
Jeden kolor reprezentuje jedną osobę. Szczegółowy opis metody znajduje się w protokole. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Personel
	<ol>
		<li>Upewnij się, że dostępni są wszyscy wymagani pracownicy: wysoko wykwalifikowany specjalista medycyny płodu wykonujący pomiary ultrasonograficzne, dwóch położników przeprowadzających zabieg chirurgiczny, jeden z położników oraz dwie pielęgniarki pobierające próbki, jeden asystent odpowiedzialny za analizy gazometryczne krwi oraz jeden asystent zajmujący się pozostałymi próbkami kolejno i niezwłocznie po ich pobraniu. 
		UWAGA: W przypadku bardziej zaawansowanego pobierania tkanki łożyska wymagana jest dodatkowa osoba.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprzęt
	<ol>
		<li>Przygotuj sprzęt, 50 mL lodowatego 1 M roztworu fosforanowego buforu soli (PBS), 25 mL zimnego roztworu stabilizującego RNA oraz 5 x 0.5 mL związku OCT (optimal cutting temperature compound). Oznakuj probówki typu vacutainer i pozostałe probówki. Zobacz wstępną listę sprzętu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka matek
<ol>
	<li>Zarejestruj kliniczne i niekliniczne cechy matki w momencie włączenia do badania, a następnie powtórz odpowiednie pytania i pomiary, w tym masę ciała, w czasie porodu. Odnotuj czas trwania okresu postu przed cięciem cesarskim oraz wszelkie epizody niedociśnienia występujące w trakcie operacji. 
	Uwaga: Uwzględnij minimalny zestaw danych klinicznych matki opisany w niedawnej publikacji Global Pregnancy CoLaboratory (COLAB). Artykuł ten zawiera również bardzo ważne aspekty dotyczące wyboru populacji badawczej, które należy uwzględnić podczas planowania badania 18.</li>
	<li>Rozważ zarejestrowanie cech ojca, w tym pochodzenia etnicznego, wieku i wskaźnika masy ciała (BMI).</li>
</ol>
3. Ultradźwięki
<ol>
	<li>Badanie dopplerowskie USG należy przeprowadzić w dniu porodu, gdy kobiety znajdują się w stanie na czczo. Badanie należy wykonać w okresie spoczynku płodu, przy kobiecie w pozycji półleżącej, lekko przechylonej bokiem w stronę przeciwną do badanego obszaru, aby uniknąć ucisku aorty i żyły głównej dolnej. Należy monitorować intensywność wyjściową za pomocą wskaźników mechanicznych i termicznych wyświetlanych na ekranie.</li>
	<li>Żyła pępowinowa
	<ol>
		<li>Należy zwizualizować żyłę pępowinową w przekroju strzałkowym lub skośnym brzucha płodu. Należy zmierzyć wewnętrzną średnicę naczynia w prostym odcinku wewnątrzbrzusznej żyły pępowinowej, przed wystąpieniem widocznych odgałęzień. Należy użyć standardowego trybu B i zwizualizować naczynie pod kątem insonacji prostopadłym do pomiaru średnicy oraz zachować kilka optymalnych klatek do późniejszych pomiarów, aby zminimalizować wpływ pulsacyjnych zmian średnicy.
		<ol>
			<li>Pomiary należy powtórzyć od pięciu do dziesięciu razy 19.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W tym samym miejscu należy użyć USG Doppler i ustawić głowicę tak, aby uzyskać jak najmniejszy kąt insonacji (zawsze &lt;30°), w celu pomiaru średniej prędkości maksymalnej w czasie (TAMX). Prędkość należy zarejestrować w okresie od 3 do 5 s (przepływ niepulsacyjny).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tętnica maciczna
	<ol>
		<li>Należy użyć USG Doppler, aby zwizualizować tętnicę maciczną w miejscu, gdzie przecina ona tętnicę biodrową zewnętrzną, bezpośrednio po jej odejściu od tętnicy biodrowej wewnętrznej. W tym miejscu należy ustawić głowicę tak, aby uzyskać mały kąt insonacji (zawsze &lt;30°), i zmierzyć TAMX. Prędkość należy wyznaczyć jako średnią prędkość z trzech cykli pracy serca.</li>
		<li>Ponieważ uzyskanie kąta prostopadłego w tym samym miejscu, w którym mierzona jest TAMX, jest mało prawdopodobne, należy śledzić naczynie dystalnie, aby uzyskać prawidłowy kąt do pomiarów średnicy, jak najbliżej miejsc pomiaru średnicy, na ile to możliwe. Pomiary średnicy należy odrzucić, jeśli w kolorowym USG Doppler widoczne są jakiekolwiek odgałęzienia naczyń przed tym miejscem.
		<ol>
			<li>Należy użyć standardowego trybu B i zwizualizować naczynie pod kątem insonacji prostopadłym do pomiaru średnicy oraz zachować kilka optymalnych klatek do późniejszych pomiarów, aby zminimalizować wpływ pulsacyjnych zmian średnicy.</li>
			<li>Pomiary należy powtórzyć od pięciu do dziesięciu razy 19.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy odnotować położenie łożyska.</li>
</ol>
4. Pobieranie krwi z 4 naczyń
UWAGA: Harmonogram procedur przedstawiono na Rysunku 1, a przegląd próbek zilustrowano na Rysunku 2.
<img alt="Schemat przepływu krwi łożyskowej przedstawiający żyłę maciczną, żyłę pępowinową, tętnicę promieniową oraz tętnice pępowinowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczny rysunek unaczynienia łożyska i miejsc pobierania próbek. 
W metodzie pobierania z 4 naczyń próbki krwi są pobierane z żyły macicznej, tętnicy promieniowej (jako zamiennika tętnicy macicznej) oraz z tętnic i żyły pępowinowej. Przepływ krwi w tętnicy macicznej i żyle pępowinowej jest mierzony za pomocą badania USG. Pobierane są również próbki tkanek z łożyska. Ilustracja: Øystein H. Horgmo, University of Oslo. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55847/55847fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Procedury bezpieczeństwa
	<ol>
		<li>Zapewnić wszystkim osobom w sali operacyjnej rękawiczki, chirurgiczne kostiumy operacyjne, maseczki i nakrycia głowy.</li>
		<li>Zapewnić chirurgom oraz personelowi badawczemu mającemu kontakt z polem operacyjnym chirurgiczne kostiumy operacyjne, maseczki, nakrycia głowy, fartuchy i podwójne rękawiczki. Okulary ochronne są opcjonalne.</li>
		<li>Zapewnić personelowi zajmującemu się próbkami krwi rękawiczki.</li>
		<li>Zapewnić personelowi zajmującemu się próbkami łożyska rękawiczki i maseczkę chirurgiczną. Homogenizacja wymaga użycia dygestorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie w sali operacyjnej
	<ol>
		<li>Przeprowadzić odprawę i przekazać sprzęt wszystkim osobom, które będą pomagać w pobieraniu próbek, przed rozpoczęciem operacji.</li>
		<li>Ustalić z anestezjologiem i pielęgniarką anestezjologiczną, którzy pomogą w zapewnieniu niezbędnego dostępu tętniczego i żylnego do naczyń obwodowych, oraz upewnić się, że przed pobraniem próbek nie podawano żadnych płynów dożylnie.</li>
		<li>Przekazać trzy strzykawki (10 mL) bez igieł osobie pomagającej w pobieraniu próbek z żyły łokciowej oraz dwie strzykawki (jedną 20 mL i jedną 10 mL) oraz jedną strzykawkę do gazometrii (z heparyną) osobie pomagającej przy tętnicy promieniowej.</li>
		<li>Przygotować dwie sterylne strzykawki (20 mL), pięć sterylnych strzykawek (10 mL), trzy igły typu „motylek” i dwie strzykawki do gazometrii na pole operacyjne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostęp do naczyń krwionośnych
	<ol>
		<li>Przed cięciem cesarskim postępować zgodnie ze standardową procedurą w celu zapewnienia obwodowego dostępu dożylnego (iv). 
		UWAGA: Preferowana jest żyła łokciowa, ponieważ pobieranie próbek z tego miejsca jest łatwiejsze.</li>
		<li>Zlokalizować tętnicę promieniową w nadgarstku za pomocą USG lub palpacji. Po podaniu 0,5 mL lidokainy podskórnie w celu znieczulenia, wprowadzić kaniulę do tętnicy promieniowej. Zrezygnować z pobierania próbek z tego miejsca w przypadku trzech nieudanych prób wprowadzenia kaniuli lub jeśli pacjentka odczuwa ból podczas zabiegu. 
		UWAGA: Zabieg chirurgiczny cięcia cesarskiego przeprowadzić zgodnie ze standardową procedurą. Poniżej podkreślono jedynie modyfikacje niezbędne dla procedury pobierania próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki krwi matki 
	UWAGA: Wszystkie trzy próbki krwi matki (z żyły macicznej, tętnicy promieniowej i żyły łokciowej) należy pobrać jednocześnie przed nacięciem macicy.
	<ol>
		<li>W przypadku żyły macicznej, po otwarciu jamy brzusznej, użyć retraktora do uniesienia ściany brzusznej i odsłonięcia głównych odgałęzień żył macicznych po przednio-bocznych stronach macicy. Pobrać krew z odgałęzień żyły macicznej po tej samej stronie, po której znajduje się łożysko, jeśli jest to możliwe, lub użyć najbardziej wyraźnego splotu żylnego, jeśli łożysko znajduje się w linii środkowej macicy.
		<ol>
			<li>Wprowadzić igłę typu motylek połączoną ze strzykawką do gazometrii do żyły macicznej pod kątem około 30 stopni i pobrać krew poprzez delikatną aspirację, aby uniknąć hemolizy. Ostrożnie stabilizując pozycję dożylną igły typu motylek, zastąpić wypełnioną strzykawkę do gazometrii kolejno strzykawką 20 mL, a następnie 10 mL. 
			UWAGA: Optymalny dostęp jest najlepiej zapewniony, gdy osoba pobierająca stoi po przeciwnej stronie niż wybrana żyła maciczna.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku tętnicy promieniowej, aspirować krew z kaniuli wewnątrztętniczej. Odrzucić pierwsze 5 mL, a następnie pobrać 3 mL do strzykawki z heparyną do analizy gazometrycznej, a następnie 3 mL do dwóch strzykawek (20 + 10 mL).</li>
		<li>W przypadku żyły łokciowej, delikatnie aspirować krew z cewnika dożylnego. Odrzucić pierwsze 5 mL, a następnie pobrać 30 mL do trzech strzykawek (10 mL).</li>
		<li>Przed rozpoczęciem zamykania jamy brzusznej przeprowadzić końcową inspekcję miejsca pobrania z żyły macicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki krwi płodu
	<ol>
		<li>Niezwłocznie po narodzinach dziecka pobrać krew z tętnicy pępowinowej, bez zaciskania pępowiny i przed oddzieleniem łożyska. Rozpocząć od strzykawki do analizy gazometrycznej, a następnie, jeśli to możliwe, użyć trzech strzykawek 10 mL.</li>
		<li>Po zabezpieczeniu próbek tętniczych zacisnąć pępowinę i przekazać dziecko położnej przed pobraniem krwi z żyły pępowinowej (strzykawka do gazometrii oraz strzykawki 20 + 10 mL). 
		UWAGA: Wszystkie próbki pępowinowe należy pobrać w ciągu kilku sekund od urodzenia, gdy łożysko znajduje się in situ, chyba że oddzieliło się samoistnie.</li>
		<li>Postępować zgodnie z norweskimi zaleceniami dotyczącymi opóźnionego zaciskania pępowiny. W przypadku stanu zagrożenia życia dziecka, natychmiast zacisnąć i przeciąć pępowinę, a następnie przekazać dziecko położnej i neonatologowi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępowanie z próbkami krwi
	<ol>
		<li>Umieścić strzykawki do gazometrii w lodzie podczas przygotowywania pozostałych próbek krwi i przeanalizować je w analizatorze gazometrii w ciągu 5 min.</li>
		<li>Bezzwłocznie przelać próbki krwi do probówek typu vacutainer; probówki z plazmą umieścić na mieszadle obrotowym na 1 - 2 min przed włożeniem do lodu. Probówki z surowicą pozostawić na blacie laboratoryjnym na 30 minut w celu zakrzepnięcia. 
		UWAGA: Jest to krytyczny etap procedury, który wymaga szczególnej uwagi, ponieważ próbki ze wszystkich pięciu miejsc muszą być przygotowane jednocześnie, aby zapewnić ich wysoką jakość.</li>
		<li>Wirować próbki plazmy tak szybko, jak to możliwe, nie później niż w ciągu 30 min, w temperaturze 6 °C, przy 2 500 x g przez 20 min.</li>
		<li>Po 30 min wirować próbki surowicy w temperaturze pokojowej przez 10 min przy 2 500 x g.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść nadsączki do probówek kriogenicznych 2 mL, pozostawiając 0,5 mL nadsączki nad osadem, aby zapewnić uzyskanie plazmy wolnej od płytek krwi.</li>
		<li>Próbki przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pobieranie tkanki łożyska
<ol>
	<li>Jak najszybciej po porodzie umieść łożysko płasko na schłodzonej lodem tacy do sekcji. Wykonaj fotografię.oraz zmierzyć średnicę maksymalną oraz średnicę pod kątem 90 stopni. </li>
	<li>Zważ łożysko.</li>
	<li>Należy odnotować masę, dwie średnice, wszelkie widoczne zmiany patologiczne, liczbę naczyń w pępowinie oraz odstęp czasu od momentu porodu do umieszczenia łożyska w lodzie. 
	UWAGA: W przypadku wskazań klinicznych należy przekazać łożysko do badania histopatologicznego.</li>
	<li>Umieść łożysko powierzchnią macierzystą skierowaną do góry i wyznacz 4–5 miejsc pobrania próbek, rozmieszczonych losowo w każdym kwadrancie łożyska, unikając obszarów z wyraźnymi zmianami patologicznymi. Usuń błonę podstawną (decidua), odcinając nożyczkami 3–5 mm z powierzchni macierzystej. Pobierz fragment o wielkości 1–2 cm3 fragment tkanki kosmkowej z każdego miejsca.</li>
	<li>Przemyj zebraną tkankę delikatnie w 50 ml zimnego 1M PBS. Podziel tkankę z każdego miejsca pobrania na kilka części i rozdziel do osobnych probówek. 
	Uwaga: Wielkość fragmentów łożyska będzie zależała od planowanych analiz.</li>
	<li>Dodaj alikwoty o rozmiarze 0,1–0,5 cm3 przenieść próbki tkanek do 5 probówek kriogenicznych i gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie.</li>
	<li>Dodać niewielkie fragmenty o rozmiarze 0,1–0,2 cm3 do probówki zawierającej 25 ml roztworu do stabilizacji RNA. Przechowywać w 4 °C przez 24 h, odrzucić roztwór do stabilizacji RNA i zastąpić go nowym. Zamrozić.</li>
	<li>Dodać kawałki o długości 0,5 cm3 do 5 probówek kriogenicznych z 0,5 ml OCT należy dolać OCT do pełna, wymieszać i zamrozić.</li>
	<li>Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu analizy. 
	UWAGA: Burton i wsp. przedstawiają doskonały przegląd praktycznych aspektów pobierania próbek łożyska w zależności od planowanych analiz. 20 Należy przygotować pozostałą tkankę do izolacji błon mikrokoskowych i podstawnych oraz pobrać tkankę błony wypadkowej metodą ssania próżniowego. 21,22</li>
</ol>
6. Charakterystyka noworodków
<ol>
	<li>Zanotuj charakterystykę noworodkową, w tym ocenę w skali Apgara (1, 5 i 10 min), płeć, masę ciała, długość, wiek gestacyjny oraz przyjęcie na Oddział Intensywnej Terapii Noworodka (czas trwania i wynik pobytu).</li>
	<li>Rozważ pomiar składu ciała noworodka za pomocą pomiarów antropometrycznych, plejtyzmografii powietrznej lub dwuenergetycznej absorpcjometrii promieni rentgenowskiej.23,24</li>
</ol>
7. Obliczenia
<ol>
	<li>Przyjmij podobny skład krwi w tętnicy promieniowej i tętnicy macicznej, a następnie oblicz różnicę stężeń tętniczo-żylnych w obrębie maciczno-łożyskowym. 
	Różnica stężeń tętniczo-żylnych w obrębie maciczno-łożyskowym = CA - CV 
	Różnica stężeń żylno-tętniczych w pępowinie = Cv - Ca 
	 
	Gdzie C oznacza stężenie, a indeksy: A – tętnica promieniowa; V – żyła maciczna; v – żyła pępowinowa oraz a – tętnica pępowinowa.</li>
	<li>Oblicz objętościowy przepływ krwi, mL/min (Q): 
	<img alt="Wzór na szybkość przepływu \( Q = h \times (\frac{D}{2})^2 \times \pi \times TAMX \)." src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	Gdzie D to średnica naczynia (cm), TAMX to średnia w czasie maksymalna prędkość, a h to współczynnik profilu przestrzennego prędkości krwi. Jako współczynnik przyjmij 0.5 dla żyły pępowinowej oraz 0.6 dla tętnicy macicznej25,26.</li>
	<li>Oblicz wychwyt i uwalnianie łożyskowe zgodnie z zasadą Ficka: 
	 
	Wychwyt maciczno-łożyskowy = (CA - CV) x Qm 
	Wychwyt płodowy = (Cv - Ca) x Qf 
	 
	Indeksy: m – matczyny oraz f – płodowy.</li>
</ol>

<ol><li>Jansson, T., Powell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+placenta+in+fetal+programming%3A+underlying+mechanisms+and+potential+interventional+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Role of the placenta in fetal programming: underlying mechanisms and potential interventional approaches.</a> Clin Sci (Lond). 113 (1), 1-13 (2007).</li>
<li>Hanson, M. A., Gluckman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+developmental+conditioning+of+later+health+and+disease%3A+physiology+or+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Early developmental conditioning of later health and disease: physiology or pathophysiology.</a> Physiol Rev. 94 (4), 1027-1076 (2014).</li>
<li>Guttmacher, A. E., Spong, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+placenta+project%3A+it%27s+time+for+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">The human placenta project: it's time for real time.</a> Am J Obstet Gynecol. 213, 4 Suppl 3-5 (2015).</li>
<li>Battaglia, F. C., Regnault, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+transport+and+metabolism+of+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Placental transport and metabolism of amino acids.</a> Placenta. 22 (2-3), 145-161 (2001).</li>
<li>Hay, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental-fetal+glucose+exchange+and+fetal+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Clin+Climatol+Assoc%22%5BJournal%5D)">Placental-fetal glucose exchange and fetal glucose metabolism.</a> Trans Am Clin Climatol Assoc. 117, 321-339 (2006).</li>
<li>Woollett, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Transport+of+maternal+cholesterol+to+the+fetal+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Review: Transport of maternal cholesterol to the fetal circulation.</a> Placenta. 32, Suppl 2 218-221 (2011).</li>
<li>Prenton, M. A., Young, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+vein-artery+and+uterine+arterio-venous+plasma+amino+acid+differences+%28in+the+human+subject%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Obstet+Gynaecol+Br+Commonw%22%5BJournal%5D)">Umbilical vein-artery and uterine arterio-venous plasma amino acid differences (in the human subject).</a> J Obstet Gynaecol Br Commonw. 76 (5), 404-411 (1969).</li>
<li>Cetin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+erythrocyte+amino+acids+in+mother+and+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Neonate%22%5BJournal%5D)">Plasma and erythrocyte amino acids in mother and fetus.</a> Biol Neonate. 60 (2), 83-91 (1991).</li>
<li>Filshie, G. M., Anstey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+arachidonic+acid+in+plasma+and+tissues+of+patients+near+term+undergoing+elective+or+emergency+Caesarean+section%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">The distribution of arachidonic acid in plasma and tissues of patients near term undergoing elective or emergency Caesarean section.</a> Br J Obstet Gynaecol. 85 (2), 119-123 (1978).</li>
<li>Haberey, P. P., Schaefer, A., Nisand, I., Dellenbach, P. The fate and importance of fetal lactate in the human placenta -a new hypothesis. J Perinat Med. 10 (2), 127-129 (1982).</li>
<li>Prendergast, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+production+by+the+human+placenta+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Glucose production by the human placenta in vivo.</a> Placenta. 20 (7), 591-598 (1999).</li>
<li>Metzger, B. E., Rodeck, C., Freinkel, N., Price, J., Young, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplacental+arteriovenous+gradients+for+glucose%2C+insulin%2C+glucagon+and+placental+lactogen+during+normoglycaemia+in+human+pregnancy+at+term%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Transplacental arteriovenous gradients for glucose, insulin, glucagon and placental lactogen during normoglycaemia in human pregnancy at term.</a> Placenta. 6 (4), 347-354 (1985).</li>
<li>Zamudio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoglycemia+and+the+origin+of+hypoxia-induced+reduction+in+human+fetal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoglycemia and the origin of hypoxia-induced reduction in human fetal growth.</a> PLoS One. 5 (1), 8551(2010).</li>
<li>Holme, A. M., Roland, M. C., Lorentzen, B., Michelsen, T. M., Henriksen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+glucose+transfer%3A+a+human+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Placental glucose transfer: a human in vivo study.</a> PLoS One. 10 (2), 0117084(2015).</li>
<li>Holme, A. M., Roland, M. C., Henriksen, T., Michelsen, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+uteroplacental+release+of+placental+growth+factor+and+soluble+Fms-like+tyrosine+kinase-1+in+normal+and+preeclamptic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">In vivo uteroplacental release of placental growth factor and soluble Fms-like tyrosine kinase-1 in normal and preeclamptic pregnancies.</a> Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 781-782 (2016).</li>
<li>Paasche Roland, M. C., Lorentzen, B., Godang, K., Henriksen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uteroplacental+arterio-venous+difference+in+soluble+VEGFR-1+%28sFlt-1%29%2C+but+not+in+soluble+endoglin+concentrations+in+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Uteroplacental arterio-venous difference in soluble VEGFR-1 (sFlt-1), but not in soluble endoglin concentrations in preeclampsia.</a> Placenta. 33 (3), 224-226 (2012).</li>
<li>Brar, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uteroplacental+unit+as+a+source+of+elevated+circulating+prorenin+levels+in+normal+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Uteroplacental unit as a source of elevated circulating prorenin levels in normal pregnancy.</a> Am J Obstet Gynecol. 155 (6), 1223-1226 (1986).</li>
<li>Myatt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+standardization+of+preeclampsia+research+study+design%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Strategy for standardization of preeclampsia research study design.</a> Hypertension. 63 (6), 1293-1301 (2014).</li>
<li>Kiserud, T., Rasmussen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+repeat+measurements+affect+the+mean+diameter+of+the+umbilical+vein+and+the+ductus+venosus%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">How repeat measurements affect the mean diameter of the umbilical vein and the ductus venosus.</a> Ultrasound Obstet Gynecol. 11 (6), 419-425 (1998).</li>
<li>Burton, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+sample+collection+for+placental+research%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Optimising sample collection for placental research.</a> Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).</li>
<li>Illsley, N. P., Wang, Z. Q., Gray, A., Sellers, M. C., Jacobs, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+preparation+of+paired%2C+syncytial%2C+microvillous+and+basal+membranes+from+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Simultaneous preparation of paired, syncytial, microvillous and basal membranes from human placenta.</a> Biochim Biophys Acta. 1029 (2), 218-226 (1990).</li>
<li>Staff, A. C., Ranheim, T., Khoury, J., Henriksen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+contents+of+phospholipids%2C+cholesterol%2C+and+lipid+peroxides+in+decidua+basalis+in+women+with+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Increased contents of phospholipids, cholesterol, and lipid peroxides in decidua basalis in women with preeclampsia.</a> Am J Obstet Gynecol. 180 (3), Pt 1 587-592 (1999).</li>
<li>Catalano, P. M., Thomas, A. J., Avallone, D. A., Amini, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthropometric+estimation+of+neonatal+body+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Anthropometric estimation of neonatal body composition.</a> Am J Obstet Gynecol. 173 (4), 1176-1181 (1995).</li>
<li>Ellis, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body-composition+assessment+in+infancy%3A+air-displacement+plethysmography+compared+with+a+reference+4-compartment+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Body-composition assessment in infancy: air-displacement plethysmography compared with a reference 4-compartment model.</a> Am J Clin Nutr. 85 (1), 90-95 (2007).</li>
<li>Haugen, G., Kiserud, T., Godfrey, K., Crozier, S., Hanson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+and+umbilical+venous+blood+supply+to+the+liver+in+the+human+fetus+near+term%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Portal and umbilical venous blood supply to the liver in the human fetus near term.</a> Ultrasound Obstet Gynecol. 24 (6), 599-605 (2004).</li>
<li>Acharya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+validation+of+uterine+artery+volume+blood+flow+measurement+by+Doppler+ultrasonography+in+pregnant+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Experimental validation of uterine artery volume blood flow measurement by Doppler ultrasonography in pregnant sheep.</a> Ultrasound Obstet Gynecol. 29 (4), 401-406 (2007).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-glutamine+cycle+and+exchange+in+the+placenta-fetus+unit+during+late+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Glutamate-glutamine cycle and exchange in the placenta-fetus unit during late pregnancy.</a> Amino Acids. 47 (1), 45-53 (2015).</li>
<li>Tuckey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+synthesis+by+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Progesterone synthesis by the human placenta.</a> Placenta. 26 (4), 273-281 (2005).</li>
<li>Simmons, M. A., Meschia, G., Makowski, E. L., Battaglia, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+metabolic+response+to+maternal+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Fetal metabolic response to maternal starvation.</a> Pediatr Res. 8 (10), 830-836 (1974).</li>
<li>Simmons, M. A., Jones, M. D., Battaglia, F. C., Meschia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+effect+on+fetal+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Insulin effect on fetal glucose utilization.</a> Pediatr Res. 12 (2), 90-92 (1978).</li>
<li>Bujold, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+supporting+that+the+excess+of+the+sVEGFR-1+concentration+in+maternal+plasma+in+preeclampsia+has+a+uterine+origin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Matern+Fetal+Neonatal+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence supporting that the excess of the sVEGFR-1 concentration in maternal plasma in preeclampsia has a uterine origin.</a> J Matern Fetal Neonatal Med. 18 (1), 9-16 (2005).</li>
<li>Jansson, T., Aye, I. L., Goberdhan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+mTORC1+signaling+in+placental+nutrient-sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The emerging role of mTORC1 signaling in placental nutrient-sensing.</a> Placenta. 33, Suppl 2 23-29 (2012).</li>
<li>Cetin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+transport+of+amino+acids+in+normal+and+growth-restricted+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, Suppl 1 50-54 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda pobierania próbek z 4 naczyń łożyskowych jest istotna dla trzech głównych celów. Po pierwsze, można go wykorzystać do zbadania, w jaki sposób określone substancje są wchłaniane przez łożysko po stronie matki i ewentualnie przenoszone do krążenia pępowinowego i płodu, jak wykazano w naszych badaniach nad glukozą i aminokwasami. Po drugie, metoda ta jest bardzo istotna dla badania substancji wytwarzanych przez łożysko i uwalnianych do krążenia matczynego lub płodowego, jak wykazano w wynikach badań progesteronu. Po ...

Według National Institutes of Health, USA, łożysko jest najmniej poznanym organem w ludzkim ciele 1,2,3. Trudno jest uzyskać dostęp do ludzkiego łożyska i badać je in vivo bez nakładania nieetycznego ryzyka na trwającą ciążę. Badania nad funkcją łożyska u człowieka opierają się zatem w dużej mierze na modelach in vitro i ex vivo. Większość wcześniejszych badań in vivo nad transportem i metabolizmem łożyskowym przeprowadzono na zwierzętach 4,5,6. Ponieważ jednak struktura i funkcje łożyska różnią się znacznie w zależności od gatunku, ekstrapolacja wyników ze zwierząt na ludzi musi być dokonywana z ostrożnością. Tylko kilka mniejszych badań in vivo na ludziach dotyczyło wychwytu i transportu przez łożysko i płód w normalnych warunkach fizjologicznych, a żadne z nich nie badało zintegrowanego transferu kilku związków 7,8,9,10,11,12,13. Te podstawowe badania pokazują, że badania in vivo ludzkiego łożyska są wykonalne i że mogą służyć kilku celom. Po pierwsze, obecne koncepcje funkcji łożyska, wywodzące się głównie z badań in vitro, ex vivo i badań na zwierzętach, mogą być testowane na ludziach, a tym samym dostarczać nowych i bardziej szczegółowych informacji na temat ludzkiego łożyska. Po drugie, można lepiej scharakteryzować właściwości dysfunkcyjnego łożyska związane z nieprawidłowym wzrostem płodu, stanem przedrzucawkowym, cukrzycą matki, zespołem metabolicznym i innymi zaburzeniami metabolicznymi matki. Po trzecie, badania in vivo na ludziach dają możliwość opracowania narzędzi diagnostycznych i predykcyjnych dotyczących funkcji łożyska.
Na tym tle naszym celem było stworzenie obszernego zbioru danych fizjologicznych do zbadania funkcji ludzkiego łożyska in vivo. Podczas planowanego cięcia cesarskiego wykorzystujemy dostęp wewnątrzbrzuszny do żyły macicznej w celu pobrania próbek krwi z naczyń przychodzących i wychodzących po stronie matczynej i płodowej łożyska (metoda pobierania próbek 4-naczyniowych). Próbki te służą do obliczania sparowanych różnic stężeń tętniczo-żylnych składników odżywczych i innych substancji 14. Dodatkowo za pomocą ultradźwięków mierzymy objętość przepływu krwi po obu stronach łożyska. W związku z tym można określić ilościowo wychwyt dowolnego związku przez łożysko i płód. Ponadto możliwe jest określenie substancji uwalnianych przez łożysko do krążenia matczynego i płodowego 15,16,17. W połączeniu z parametrami klinicznymi matki i dziecka oraz analizami łożyska i innych istotnych tkanek, metoda ta ma ekscytujący potencjał w zakresie integracji wielu aspektów funkcji łożyska in vivo w tych samych parach matka-płód.

<table><tbody><tr><td><silny>Skład ciała matki</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skala impedancji</td><td>Tanita</td><td></td><td>lub podobna</td></tr><tr><td><silna>Pomiary ultrasonograficzne&nbsp; Aparat ultrasonograficzny </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512</td><td>Acuson</td><td></td><td>wyposażony w zakrzywiony przetwornik z Dopplerem kolorowym i falą pulsacyjną (pasmo częstotliwości 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td><silne>Próbki krwi</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arerial kaniula</td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>20 cc Ekscentryczna strzykawka z końcówką Luer bez igły</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>lub podobny. Potrzebne 3.</td></tr><tr><td>10 cc Mimośrodowa strzykawka z końcówką Luer bez igły</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>lub podobnej. Potrzeba 9.</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 cc 6% Luer bez igły</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>lub podobnej. Potrzebne 2.</td></tr><tr><td>Strzykawka do gazometrii krwi tętniczej&nbsp;</td><td>Radiometr medyczny</td><td></td><td>lub podobny. Potrzebne 4.</td></tr><tr><td>Sterylna igła ze skrzydełkami podłączona do elastycznej rurki,</td><td>450081</td> <td>Greiner Bio-One</td> o rozmiarze 21 <td>(przeznaczona do jednorazowego użytku).3 Potrzebny.</td></tr><tr><td>Probówka próżniowa 6 ml EDTA&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>lub podobny. Etykieta z przykładową witryną. Potrzebne 10.</td></tr><tr><td>Probówka próżniowa 5 ml LH Separator heparyny litowej</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>lub podobny. Etykieta z przykładową witryną. Potrzebnych 5.</td></tr><tr><td>Probówka próżniowa 6 ml Aktywator krzepnięcia w surowicy&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>lub podobny. Etykieta z przykładową witryną. Potrzebnych 5.</td></tr><tr><td>Probówka próżniowa 3 mL&nbsp; 9NC Koagulacja cytrynian sodu 3,2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>lub podobny. Etykieta z przykładową witryną. Potrzebnych 5.</td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne, 2,0 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>lub podobne. Etykieta z miejscem próbki, surowicą/rodzajem osocza i wymaganym numerem identyfikacyjnym 90.</td></tr><tr><td>Oznaczone tacki do transportu strzykawek</td><td></td><td></td><td>do transportu próbek krwi na sali operacyjnej</td></tr><tr><td>Kołyska</td><td></td><td></td><td>do delikatnego mieszania próbek</td></tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td>w styropianowym pudełku</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td>w odpowiednim pojemniku</td></tr> <tr><td>< mocne>Próbki łożyska</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>metalowy </td><td></td><td></td><td></td>taca</tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td>w styropianowym pudełku</td></tr><tr><td>Kalibrowana skala</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metalowa linijka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>lub podobna. Rozcieńczyć 10 M do&nbsp; 1 M przed użyciem</td></tr><tr><td>roztwór do stabilizacji RNA</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&nbsp;</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>Związek o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.)</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>fiolki kriogeniczne, 2,0 ml</td><td>430488 Corning</td><td></td><td>lub podobne. Etykieta z przykładową witryną. Wymagana treść i ID. 10.</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe ze stożkowym dnem 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>lub podobne. Oznacz etykietą "RNA później", miejsce próbki i ID. 2 wymagane.</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td>w odpowiednim pojemniku</td></tr><tr><td><silny>Skład ciała płodu</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalibrowana skala</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma</td><td></td><td></td><td></td> miernicza</tr></tbody></table>

podejście do pobierania próbek z 4 naczyń w integracyjnych badaniach fizjologii łożyska człowieka in vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Ludzkie łożysko jest wysoce niedostępne do badań, gdy jest jeszcze w łonie matki. Obecna wiedza na temat fizjologii łożyska człowieka in vivo opiera się zatem w dużej mierze na badaniach na zwierzętach, pomimo dużej różnorodności gatunków pod względem anatomii łożyska, hemodynamiki i czasu trwania ciąży. Zdecydowana większość badań łożyska ludzkiego to badania perfuzji ex vivo lub badania trofoblastów in vitro. Chociaż badania in vitro i modele zwierzęce są niezbędne, ekstrapolacja wyników takich badań na łożysko ludzkie in vivo jest niepewna. Naszym celem było zbadanie fizjologii łożyska człowieka in vivo w terminie i przedstawienie szczegółowego protokołu metody. Wykorzystując dostęp wewnątrzbrzuszny do żyły macicznej tuż przed nacięciem macicy podczas planowanego cięcia cesarskiego, pobieramy próbki krwi z naczyń przychodzących i odpływowych po stronie matczynej i płodowej łożyska. Łącząc pomiary stężeń z próbek krwi z pomiarami objętościowego przepływu krwi, jesteśmy w stanie określić ilościowo wychwyt i uwalnianie dowolnego związku przez łożysko i płod. Co więcej, próbki tkanki łożyska z tych samych par matka-płód mogą dostarczyć pomiarów gęstości i aktywności transportera oraz innych aspektów funkcji łożyska in vivo. Dzięki temu integracyjnemu zastosowaniu metody pobierania próbek z 4 naczyń jesteśmy w stanie przetestować niektóre z obecnych koncepcji przenoszenia składników odżywczych i metabolizmu łożyska in vivo, zarówno w ciążach prawidłowych, jak i patologicznych. Co więcej, metoda ta umożliwia identyfikację substancji wydzielanych przez łożysko do krążenia matczynego, co może stanowić istotny wkład w poszukiwanie biomarkerów dysfunkcji łożyska.

Metoda pobierania próbek z czterech naczyń znajduje zastosowanie w praktyce klinicznej; pomyślnie pobrano próbki krwi od 209 par matka/noworodek. W 128 z tych przypadków udało się również zmierzyć objętościowy przepływ krwi. Kompletne pobranie próbek z czterech naczyń oraz wysokiej jakości pomiary przepływu w naczyniach matczynych i płodowych uzyskano u 70 par matka-płód (Rycina 3). Ponadto zebrano dotychczas próbki krwi i łożyska od 30 pacjentek z preeklamps...

Przedstawiamy szczegółową metodę badania fizjologii łożyska u człowieka in vivo w terminie. Metoda łączy pobieranie próbek krwi z naczyń przychodzących i odpływowych po stronie matczynej i płodowej łożyska z pomiarami ultrasonograficznymi objętości przepływu krwi i pobieraniem próbek tkanki łożyska.

Podejście do pobierania próbek z 4 naczyń w integracyjnych badaniach fizjologii łożyska człowieka in vivo

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie funkcji ludzkiej łożyska in vivo z zastosowaniem kilku metod, które łącznie zapewniają gromadzenie kompleksowych i integracyjnych danych na temat fizjologii ludzkiego łożyska płodowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące fizjologii ludzkiego łożyska, takie jak rola łożyska w interakcjach między matką a płodem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona testowanie aktualnych koncepcji transportu, pobierania i wydzielania substancji przez ludzkie łożysko in vivo.Ekstrapolacja badań eksperymentalnych na ludzi jest utrudniona przez znaczne różnice między zwierzętami a ludźmi w anatomii łożyska, czasie trwania ciąży oraz powikłaniach ciążowych. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat metabolizmu łożyska i transportu składników odżywczych, można ją również zastosować do badania uwalniania związków przez łożysko zarówno w zdrowych ciążach, jak i w ciążach powikłanych, takich jak przedeclampsia. Metoda ta wymaga ściśle skoordynowanej współpracy kilku specjalistów medycznych, pielęgniarek oraz badaczy.Kluczem do sukcesu jest rygorystyczne planowanie przy jednoczesnym stałym skupieniu uwagi na matce i jej dziecku. Poniżym schemat przedstawia harmonogram oraz personel niezbędny do pobrania próbek. Każda osoba pomagająca w pobieraniu próbek jest oznaczona innym kolorem.Niniejszy protokół obejmuje połączone zastosowanie trzech metod badania fizjologii ludzkiej łożyska. Po pierwsze, za pomocą ultradźwięków wykonuje się pomiar przepływu krwi w tętnicy macicznej i żyle pępowinowej. Po drugie, podczas cesarskiego cięcia pobiera się próbki krwi z naczyń doprowadzających i odprowadzających po stronie matczynej i płodowej ludzkiego łożyska.Pobrano trzecie próbki tkanek łożyska do analizy. Aby rozpocząć, pomóż kobiecie przyjąć pozycję półleżącą, z lekkim przechyleniem w stronę przeciwną do obszaru zainteresowania, aby uniknąć ucisku aorty i żyły głównej dolnej. W okresie spoczynku płodu zlokalizuj żyłę pępkową w przekroju strzałkowym lub skośnym brzucha płodu i zmierz wewnętrzną średnicę naczynia w prostym odcinku brzusznej części żyły pępkowej, przed widocznymi rozgałęzieniami.Użyj standardowego trybu B, aby zwizualizować naczynie pod kątem padania wiązki prostopadłego do jego osi w celu pomiaru średnicy, a następnie zapisz kilka optymalnych klatek do późniejszych pomiarów, aby zminimalizować wpływ pulsacyjnych zmian średnicy. Powtórz pomiary od 5 do 10 razy. W tym samym miejscu dostosuj położenie głowicy i wykorzystaj ultrasonografię Dopplera, aby uzyskać jak najmniejszy kąt padania wiązki, w celu pomiaru średnio-czasowej maksymalnej prędkości przepływu (TAMX).Wyznacz prędkość w okresie od trzech do pięciu sekund. Następnie wykorzystaj badanie Dopplera do wizualizacji tętnicy macicznej w miejscu, w którym przecina ona tętnicę biodrową zewnętrzną bezpośrednio po oddzieleniu się od tętnicy biodrowej wewnętrznej. Dostosuj głowicę w tym miejscu, aby uzyskać mały kąt insonacji, i zmierz TAMX.Prędkość wyznaczono jako średnią prędkość z trzech cykli pracy serca. Naczynie śledzono w kierunku dystalnym, aby uzyskać właściwy kąt pomiaru średnicy jak najbliżej miejsc pomiaru TAMX. Pomiar objętościowego przepływu krwi w tętnicy macicznej jest trudny, ponieważ mało prawdopodobne jest uzyskanie kąta prostopadłego w tym samym miejscu, w którym mierzono TAMX.Naczynia odchodzące między dwoma punktami pomiarowymi mogą stać się przyczyną wykluczenia pomiarów średnicy. Aby przeprowadzić pobieranie krwi z czterech naczyń przed rozpoczęciem operacji, należy przygotować roztwory, probówki i sprzęt. Następnie należy przeprowadzić instruktaż i przekazać sprzęt całemu personelowi, który będzie pomagał przy pobieraniu próbek.Oprócz standardowego obwodowego dostępu dożylnego, wprowadź kaniulę tętniczą do tętnicy promieniowej. Preferowana jest żyła łokciowa, ponieważ pobieranie próbek z tego miejsca jest łatwiejsze. Następnie, po otwarciu jamy brzusznej, użyj rozwieraka, aby unieść ścianę brzuszną i odsłonić główne odgałęzienia żył macicznych po stronach przednio-bocznych macicy.Zidentyfikuj odgałęzienie żyły macicznej po tej samej stronie, po której znajduje się łożysko, lub, w przypadku gdy najbardziej wyrazisty splot żylny łożyska znajduje się w linii środkowej macicy, wybierz odpowiednią żyłę. Po zidentyfikowaniu odpowiedniej żyły macicznej poproś personel pomocniczy o pobranie próbek krwi z tętnicy promieniowej oraz z żyły łokciowej. Jednocześnie, pod kątem 30 stopni, wprowadź igłę motylkową połączoną ze strzykawką do gazometrii krwi do żyły macicznej i pobierz krew poprzez delikatną aspirację.Podczas uważnego zabezpieczania miejsca wkłucia igły motylkowej, poproś asystenta o zastąpienie wypełnionej strzykawki do gazometrii strzykawką o pojemności 20 ml. Następnie niezwłocznie użyj strzykawki 10 ml. Z tętnicy promieniowej lub żyły łokciowej odrzuć pierwsze 5 ml krwi, a następnie pobierz 3 ml do strzykawki z heparyną w celu przeprowadzenia analizy gazometrii krwi.Następnie odessać 30 mililitrów z każdego miejsca. Po narodzinach dziecka należy rozpocząć od użycia strzykawki do analizy gazometrycznej krwi i niezwłocznie pobrać krew z tętnicy pępkowej bez zaciskania pępowiny i bez usuwania łożyska. Jeśli to możliwe, następnie pobrać krew trzema strzykawkami o pojemności 10 mililitrów każda.Po zabezpieczeniu próbek z tętnic, zaklemować i przeciąć pępowinę przed pobraniem krwi z żyły pępkowej, pobierając wszystkie próbki pępowinowe z łożyskiem in situ. Metoda czterech naczyń wymaga skoordynowanego pobierania krwi oraz szybkiej obsługi próbek z pięciu różnych miejsc jednocześnie. Należy zwrócić szczególną uwagę na tętnicę pępkową, która jest podatna na skurcze, hemolizę i koagulację.Przed rozpoczęciem zamykania jamy brzusznej przeprowadź końcową inspekcję miejsca poboru próbek z żyły macicznej. Wszystkie strzykawki do gazometrii krwi umieść w lodu i przeanalizuj próbki za pomocą analizatora gazometrii krwi w ciągu pięciu minut. Natychmiast przenieś próbki krwi do probówek typu vacutainer i mieszaj probówki z osoczem metodą kołysania przez jedną do dwóch minut przed umieszczeniem ich w lodu.Odwiruj próbki osocza tak szybko, jak to możliwe, nie później niż w ciągu 30 minut, przy 2 500 ×g i temperaturze sześciu stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie ostrożnie przenieś naddatki do probówek kriogenicznych o pojemności dwóch mililitrów. Przeanalizuj próbki krwi pod kątem poszukiwanych substancji i wykonaj obliczenia transferu przez łożysko zgodnie z protokołem tekstowym.Jak najszybciej po porodzie umieść łożysko na płasko na schłodzonej lodem tacy sekcyjnej. Zapisz masę tkanki oraz jej największą średnicę i średnicę prostopadłą do pierwszego pomiaru. Następnie odnotuj wszelkie zmiany makroskopowe oraz liczbę naczyń w pępowinie.Umieść łożysko stroną macierzystą do góry i wyznacz od czterech do pięciu miejsc poboru próbek, rozmieszczonych losowo w każdym kwadrancie łożyska. Użyj nożyczek, aby usunąć błonę błonistą, odcinając od trzech do pięciu milimetrów z powierzchni macierzystej. Następnie pobierz fragment tkanki kosmkowej o objętości od jednego do dwóch centymetrów sześciennych z każdego miejsca.Tkankę zebraną należy delikatnie przemyć 50 mililitrami schłodzonego, jednomolarnego PBS. Następnie tkankę z każdego miejsca pobrania należy podzielić na kilka części i rozdzielić na aliquoty. Alikwoty próbek tkanki o objętości od 0,1 do 0,5 centymetra sześciennego należy umieścić w pięciu krioprobówkach i zamrozić próbki w ciekłym azocie.Dodaj małe fragmenty o rozmiarze od 0,1 do 0,2 cm³ do wcześniej przygotowanych probówek zawierających 25 ml roztworu stabilizującego RNA. Do badań histologicznych dodaj fragmenty o rozmiarze 0,5 cm³ do pięciu krioprobówek z 0,5 ml OCT, uzupełnij objętość OCT, a następnie wymieszaj zawartość probówek. Przechowuj próbki w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.Próbki krwi od 209 par matka-niemowlę zostały pomyślnie pobrane przy użyciu metody pobierania z czterech naczyń. Objętość przepływu krwi zmierzono w 128 próbkach. Pełne pobranie z czterech naczyń oraz wysokiej jakości pomiary przepływu w naczyniach matczynych i płodowych uzyskano u 70 par matka-płód.Metoda czterech naczyń została wykorzystana do badania transportu przez łożysko, na przykładzie glukozy przedstawionym tutaj. Wykazano istotne różnice w stężeniu glukozy w tętnicach i żyłach po obu stronach łożyska, co dowiodło in vivo poboru maciczno-łożyskowego na poziomie 0,29 millimoli na litr oraz poboru płodowego na poziomie 0,54 millimoli na litr. Zmierzono medianę przepływu w żyle pępkowej wynoszącą 196,2 mililitrów na minutę.Stosując zasadę Ficka, obliczono medianę poboru glukozy przez płód z krążenia pępowinowego wynoszącą 0,10 mmol/min. Z wykorzystaniem metody czterech naczyń zbadano pobór kwasu glutaminowego przez łożysko, który jest istotny jako paliwo w szlakach metabolicznych oraz dla konwersji aminokwasów w układzie płód-łożysko. Zaobserwowano pobór kwasu glutaminowego przez łożysko zarówno z krążenia pępowinowego, jak i matczynego.Zmierzono również uwalnianie progesteronu przez łożysko in vivo w terminie, stwierdzając istotne uwalnianie progesteronu do krwiobiegu matki, co wykazało, w jaki sposób metoda czteronaczyniowego pobierania próbek z łożyska może być wykorzystana do wykrywania substancji uwalnianych przez łożysko. Podczas wykonywania tej procedury należy podkreślić, że pomiary objętości przepływu krwi powinny być przeprowadzane przez specjalistę medycyny płodowej z doświadczeniem w tego typu sonografii, aby uzyskać dokładne pomiary. Po wykonaniu tej procedury próbki krwi mogą zostać poddane analizie w celu zbadania transportu łożyskowego oraz poboru lub uwalniania interesującej substancji, niezależnie od tego, czy są to składniki odżywcze, metabolity, cząsteczki sygnałowe, egzosomy, związki odpadowe, leki czy toksyny.Ponadto analiza próbek łożyska może przynieść odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące regulacji transportu oraz metabolizmu łożyska. Całość niniejszego protokołu demonstruje, w jaki sposób można przeprowadzić skoordynowany pobór pomiarów objętościowego przepływu krwi, próbek krwi oraz tkanek, aby uzyskać spójny model in vivo do badania fizjologii łożyska ludzkiego. Po obejrzeniu tego filmu lekarz położnik powinien posiadać dokładną wiedzę na temat bezpiecznego pobierania próbek krwi tętniczej i żylnej po obu stronach ludzkiego łożyska podczas cięcia cesarskiego.

the-4-vessel-sampling-approach-to-integrative-studies-human-placental

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

Model podwójnej recyrkulacji ludzkiego łożyska ex vivo może być wykorzystany do zbadania transferu ksenobiotyków i nanocząsteczek przez ludzkie łożysko. W tym protokole wideo opisujemy sprzęt i techniki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia perfuzji łożyska.

Oznaczanie szybkości transportu ksenobiotyków i nanomateriałów przez łożysko przy użyciu modelu perfuzji łożyska człowieka ex vivo

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnych ludzkich hodowli łożyskowych (kosmków) i narządów dziesiętnych. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych są nieocenionymi narzędziami do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem. Wykazano zakażenie fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes.

Ludzkie posiewy łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania zakażeń na granicy matczyno-płodowej

To badanie przedstawia protokół odwracalnego oczyszczania tkanek, barwienia immunologicznego, renderowania 3D i analizy sieci naczyniowych w próbkach ludzkich kosmków łożyskowych rzędu 1 - 2 mm3.

Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych

Opisujemy system, który wykorzystuje trzy metody do oceny bezpieczeństwa i skuteczności dostarczania leków ukierunkowanych na łożysko: obrazowanie in vivo do monitorowania akumulacji nanocząstek, ultradźwięki o wysokiej częstotliwości do monitorowania rozwoju łożyska i płodu oraz HPLC do ilościowego określania dostarczania leków do tkanek.

Kompleksowa ocena skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu trzech uzupełniających się metod

Tutaj przedstawiono protokół perfuzji naczyniowej ex vivo matczyno-płodowej, który umożliwia podanie artykułu testowego do układu naczyniowego matki i ocenę transferu przez łożysko cząsteczek ksenobiotycznych lub środków farmakologicznych oprócz zmian w fizjologii łożyska.

Perfuzja ex vivo łożyska gryzonia

Oto protokół hodowli eksplantatów łożyskowych w warunkach stałego przepływu. Podejście to wzmacnia tradycyjne statyczne systemy hodowli kosmków, umożliwiając replikację dynamicznych środowisk fizjologicznych.

Ex vivo Hodowla eksplantatów łożyskowych - naśladowanie dynamicznych warunków w macicy

Protokół ten opisuje przygotowanie roślin tkanki łożyskowej ludzkich hodowanych na styku powietrze-ciecz do badania infekcji wirusowych.

Ex vivo Hodowla ludzkich implantów łożyskowych do badania transmisji wirusa na styku matka-płod

W ostatnim czasie przeprowadzono liczne badania z wykorzystaniem szczurzych modeli pominięcia żołądka, aby odkryć podstawowe mechanizmy fizjologiczne operacji pominięcia żołądka metodą Roux-en-Y. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie i omówienie technicznych oraz eksperymentalnych szczegółów naszego opublikowanego szczurzego modelu pominięcia żołądka, aby zrozumieć zalety i ograniczenia tego narzędzia eksperymentalnego.

Operacja pomostowania żołądka typu Roux-en-Y u szczurów

Ksenoprzeszczepy ludzkich nowotworów są unaczyniane i infiltrowane przez komórki pochodzenia mysiego podczas fazy wzrostu in vivo. Aby obejść odchylenia spowodowane przez te zanieczyszczające komórki podczas dalszej analizy, opracowaliśmy metodę pozwalającą na kompleksowe zubożenie wszystkich komórek myszy poprzez magnetyczne sortowanie komórek.

Zubożenie komórek myszy z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych znacznie poprawia dalszą analizę komórek docelowych

Poznaj metodę pobierania próbek z czterech naczyń do badania fizjologii łożyska człowieka in vivo. Technika umożliwia analizę transferu składników odżywczych i metabolizmu w czasie rzeczywistym podczas ciąży.

Podejście do pobierania próbek z 4 naczyń w integracyjnych badaniach fizjologii łożyska człowieka in vivo

Przeglądaj więcej filmów