Name: Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj szybką metodę preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila do immunodetekcji i PCR. Technika umożliwia badanie lokalizacji transkryptów i białek podczas rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować CSIC za wsparcie finansowe udzielone temu projektowi, Marianie Di Doménico za jej pomoc techniczną przy mikroskopii konfokalnej; José Leonardo Báezowi za jego poprawki rękopisu; Luciano Correi za jego poświęcenie się tworzeniu filmu; Natalii Rosano za użyczenie swojego głosu do filmu i Bloomington Drosophila Stock Center w celu udostępnienia zapasów wykorzystanych w tym badaniu. Monoklonalny anty-Ptc Apa1 opracowany przez Isabel Guerrero został uzyskany z Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) pod auspicjami NICHD i utrzymywany przez The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.

Dzień 1
1. Zbieranie i hodowla poczwarek.
<ol>
	<li>Usunąć 0 godzin po utworzeniu się poczwarki (APF) lub przedwarek za pomocą mokrego pędzla z fiolek z kulturami i umieścić je w nowych fiolkach, aby prawie zakończyć okres rozwoju (patrz 2.1 i 2.2). 
	nuta: Zdrowa populacja much powinna być utrzymywana przy użyciu standardowych protokołów hodowli. Po trzech lub czterech dniach składania jaj dorosłe osobniki można wyjąć z fiolek, aby umożliwić optymalny rozwój osobników. Są one utrzymywane w stałej temperaturze do momentu, gdy larwy trzeciego stadium rozwojowego zainicjują przepoczwarzenie. Przejście larwala/poczwarka jest zaznaczone przez utworzenie się poczwarki uważanej za 0 h APF. Poczwarka to nieruchoma biała larwa, która ma podłużny, okrągły kształt z wystającymi przednimi przetchlinkami.</li>
</ol>
Dzień 2
2. Transfer, rozbiór i fiksacja.
<ol>
	<li>Poczwarki (2 godziny przed zakończeniem czasu rozwoju) przenieść pędzlem na szkiełko mikroskopowe z przyklejoną do niego taśmą dwustronną. Ustaw poczwarki tak, aby utworzyły rząd z grzbietowymi stronami do góry i końcami głowowymi skierowanymi w tym samym kierunku.</li>
	<li>Przywróć szkiełko mikroskopowe do stałej temperatury i pozwól poczwarkom na osiągnięcie odpowiedniego czasu rozwoju (tj. 24-30 godzin APF). 
	nuta: Szkiełko mikroskopowe z taśmą dwustronną będzie przejściową platformą preparacyjną do usunięcia obudowy poczwarki (patrz poniżej). Upływ czasu na szkiełku mikroskopowym (na zewnątrz fiolki) pomaga wysuszyć etui poczwarki, dzięki czemu łatwo je złamać kleszczami.</li>
	<li>Usuń wieczko z etui poczwarki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przełam obudowę kleszczami (jak pokazano na filmie), tworząc linię wzdłuż boku poczwarki do jej ogonowego końca. Przy odpowiednim oświetleniu możliwe jest wykrycie wewnętrznego kształtu poczwarki, dzięki czemu uwidacznia się przestrzeń tuż nad zawiasem skrzydła poczwarki. Ta przestrzeń służy jako przewodnik do wykonania otwarcia bez uszkadzania poczwarki.</li>
	<li>Usuń części etui, podnosząc je za otwartą krawędź i przenosząc na przeciwną stronę, gdzie pomieści je taśma dwustronna. Pod koniec sekcji poczwarki będą prawie "nagie", tylko mały kawałek obudowy będzie zakrywał tylny koniec. 
	Uwaga: Celem pozostawienia niewielkiej ilości etui na górnym końcu ogonowym jest zapewnienie płynnego zwolnienia z etui na zamek za pomocą taśmy dwustronnej. Powodem tego działania jest to, że jeśli usuniesz zbyt dużo obudowy, znacznie ryzykujesz uszkodzenie poczwarki. Z drugiej strony, jeśli usuniesz zbyt mało, poczwarka nie wydobędzie się łatwo z etui.</li>
	<li>Dociśnij (kleszczami) pozostałą część etui. Ten ruch podniesie przedni koniec poczwarki, pozwalając zarówno głowie, jak i tułowiu pozostać w preferencyjnej pozycji, aby przylegać i zostać przeniesione w kolejnym kroku.</li>
	<li>Weź nowy slajd z taśmą dwustronną i odwróć go w rzędzie poczwarek lub poczwarek. Zalecamy wykonanie tego podejścia poprzez obserwację ruchów za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby zapobiec pękaniu poczwarek.</li>
	<li>Lekko dociśnij, aby poczwarki przykleiły się do taśmy i delikatnie przesuń suwak, aby usunąć poczwarki z reszty etui. Odwróć szkiełko mikroskopowe: poczwarki utkną po stronie grzbietowej na poziomie głowy / klatki piersiowej.</li>
	<li>Przykryj wszystkie nagie poczwarki 4% paraformaldehydem i odczekaj 10 minut. Z naszego doświadczenia wynika, że ten upływ czasu z utrwalaczem pomaga zmienić konsystencję naskórka, czyniąc go jędrnym, mniej lepkim i łatwym w obsłudze. 
	nuta: Aby przeprowadzić ekstrakcję kwasu rybonukleinowego (RNA), zastąp paraformaldehyd solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) wykonaną z wody wolnej od RNaz i usuń skrzydła poczwarki, wykonując nacięcie (za pomocą nożyczek) w pobliżu punktu zawiasu każdego wyrostka. Za pomocą kleszczy przenieś skrzydło poczwarki do probówki mikrowirówkowej z 1 ml tiocyjanianu guanidyny i odczynnikiem fenolowym. Po zebraniu łącznie 50-80 skrzydeł, przechowuj probówkę mikrowirówki w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia ekstrakcji RNA10,11.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w obszarze zawiasów skrzydła lub w jego pobliżu. Pozwól, aby utrwalacz dotarł do nabłonka skrzydeł. Za pomocą pipety (p200) przepłukać utrwalacz na skrzydełku. Podczas spłukiwania zanieczyszczony fiksat należy wymienić na nowy. Po wypłukaniu trzymaj skrzydło w utrwalaczu przez 5 min. 
	nuta: Chociaż ten manewr pomaga usunąć większość zanieczyszczającej tkanki, niektóre hemocyty i kropelki tłuszczu mogą pozostać uwięzione między grzbietowymi i brzusznymi warstwami nabłonka skrzydła (patrz <silna klasa="xfig">Ryc. 1A).</li>
	<li>Rozerwij kleszczami od brzegów naskórka (jak pokazano na filmie), rozszerzając otwór i umożliwiając uwolnienie nabłonka skrzydeł z worka naskórka. Po uwolnieniu tkanki skrzydła pozostaw ją w roztworze paraformaldehydu, aby zakończyć 30 minut utrwalania.</li>
	<li>Przenieś stałe skrzydełka do jednego 4-dołkowego plastikowego naczynia wypełnionego PBST (Triton X-100 0,05%). Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Dzień 3
3. Inkubacja przeciwciał pierwotnych.
<ol>
	<li>Przepuszczalność tkanki inkubującej skrzydła poczwarki w PBST (Triton X-100 0,2%) przez 15 minut za pomocą platformy kołyszącej, aby ułatwić delikatny ruch płynnego podłoża. 
	nuta: Do momentu zamontowania próbek czynności te należy wykonywać za pomocą platformy bujanej.</li>
	<li>Blokować próbki za pomocą PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Użyć tego samego buforu do rozcieńczenia pierwszorzędowego przeciwciała (mysiego anty-Ptc, 1:100) i inkubować skrzydła poczwarki przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Dzień 4
4. Drugorzędowa inkubacja przeciwciał.
<ol>
	<li>Próbki należy przemywać 4 x po 10 minut PBST (Triton X-100 0,05%)</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (np. anty-mysim sprzężonym z fluorochromem) rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) w temperaturze pokojowej w ciemności, przez 2 godziny 
	nuta: Jeśli jest to właściwe, użyj 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) i/lub falloidyny, aby przeciwdziałać barwieniu tkanki. Dodaj te sondy z przeciwciałem drugorzędowym, biorąc pod uwagę długość fali emisji fluorochromów, aby zapobiec nakładaniu się sygnałów.</li>
	<li>Próbki należy przemywać 4 x po 10 minut PBST (Triton X-100 0,05%)</li>
</ol>
5. Montaż
<ol>
	<li>Przygotuj szkiełko podstawowe, umieszczając 4 kropki przezroczystego lakieru do paznokci na szkiełku mikroskopowym tak, jakby były wierzchołkami kwadratu. Będą to punkty, w których szkiełka nakrywkowe będą spoczywać, pomagając uniknąć zgniecenia tkanki.</li>
	<li>Umieść 30 μl podłoża montażowego (glicerol/Tris-HCl 80%) na środku kwadratu kropek wykonanych lakierem do paznokci, nie dotykając żadnego z rogów (kropek). Weź pipetę z żółtą, przyciętą końcówką, załaduj trochę podłoża montażowego, a następnie wciągnij kilka skrzydełek poczwarki.</li>
	<li>Przenieść skrzydła poczwarki do punktu podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą końcówki rozprowadź podłoże montażowe i zanurz skrzydła poczwarki, aby zapobiec ich unoszeniu się. Morfologia tkanki zostanie zachowana, jeśli skrzydła pozostaną płaskie po nałożeniu szkła nakrywkowego. Przed umieszczeniem szkła nakrywkowego usuń pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Opuścić szkiełko nakrywkowe na próbki, starając się zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Ten ruch można wykonać za pomocą kleszczy.</li>
</ol>

<ol><li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limb+morphogenesis%3A+connections+between+patterning+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li>
<li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li>
<li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing%3A+initiation+of+wing+vein+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li>
<li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing%3A+The+development+of+the+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li>
<li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li>
<li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li>
<li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana w tym filmie metoda preparacji może być wykorzystana do przygotowania wysokiej jakości próbek skrzydeł poczwarki Drosophila z różnych etapów rozwoju dla wielu rodzajów technik (np. immunofluorescencja, synteza cDNA do testów PCR, rozwój skrzydeł in vitro ). Jeśli chodzi o tę metodę, zaangażowani naukowcy wykorzystali 24-30 h APF. Nie powinno być jednak żadnych przeszkód w podstawowych krokach w sekcji młodszych lub starszych poczwarek. Być może trzeba będzie wprowadzić zmiany, aby dosto...

Skrzydła Drosophila są zbudowane z wyimaginowanych dysków skrzydeł. Pierwotne z tych dysków skrzydeł są odkładane na bok podczas rozwoju embrionalnego jako małe grupy 20-30 wyimaginowanych komórek, które wyrastają z nabłonka embrionalnego. Podczas gdy larwa rośnie do trzeciego stadium rozwojowego, mitoza zachodzi w komórkach wyobrażeniowych w określonych charakterystycznych momentach, zwiększając jej liczbę (około 50000 komórek) i tworząc dysk skrzydła1,2,3,4. W miarę namnażania się komórek tworzy się nabłonek rurkowaty, w wyniku czego powstaje samozwijająca się zwarta spirala. Podczas przepoczwarzania nabłonek dysku wysuwa się, tworząc dwuwarstwowe skrzydło, a żyły podłużne zaczynają się jako luki między nimi, co występuje dwukrotnie podczas rozwoju skrzydła5,6.
Układ żył zawsze ma identyczny wzór; Możliwość łatwej identyfikacji każdej zmiany w obrębie tworzenia się żył sprawia, że mutacje są niezwykle widoczne (np. brakujące lub dodatkowe żyły, zmiany w położeniu żył itp.). Co ciekawe, zmiany fenotypu są zwykle dowodem na mutacje w znanych lub nowych składnikach szlaków sygnałowych, które są istotne dla rozwoju skrzydeł. Jedną ze ścieżek, która odgrywa rolę w określaniu pozycji i utrzymywaniu terytoriów żył i międzyżyłowych, jest ścieżka Hedgehog (Hh)6,7,8.
Biorąc pod uwagę znaczenie skrzydła poczwarki jako systemu modelowego, ważne będzie uzyskanie dobrej jakości próbek do pracy. W przeszłości naukowcy, którzy opublikowali protokoły preparowania skrzydeł Drosophila, nie dali odpowiednich wskazówek, jak uzyskać nadające się do pracy próbki. Bez wskazówek badacza nie da się jasno zobrazować tego procesu. W tych naprzemiennych podejściach preparacyjnych poczwarka jest dzielona na dwie części, oddzielając skrzydło od otaczającej tkanki i wielokrotnie myta w celu usunięcia szczątków. Tego rodzaju podejście zakłada, że skrzydło pozostaje wolne od zanieczyszczeń, ale ze względu na wcześniejsze doświadczenia proces ten jest wolniejszy i istnieje większe prawdopodobieństwo naruszenia struktury delikatnych skrzydeł9.
Opisana tutaj procedura została opracowana w odpowiedzi na zapotrzebowanie na szybką i efektywną metodę uzyskania próbek skrzydeł poczwarki odpowiednich do wykrywania określonych białek lub transkryptów za pomocą protokołów immunodetekcji lub testów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Aby to zilustrować, ekspresja i lokalizacja Patched (Ptc lub receptor kanoniczny szlaku Hh) jest wykrywana w próbkach skrzydeł poczwarki, zapewniając protokół, który zawiera istotne szczegóły, aby pomyślnie przeprowadzić całą procedurę.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z chłodnym oświetleniem świetlnym</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td>SMZ1000</tr><tr><td>Platforma bujana</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe (24 x 32 mm)</td><td>Kleszcze D102432</td><td></td><td></td>Deltalab</tr><tr><td></td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe naczynie wielofunkcyjne</td><td>Thermo Pipeta Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 lub p200</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Odczynnik Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC woda uzdatniona</td><td>MO. BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 kozia anty-mysia IgG (H+L), 2 mg/mL (rozcieńczenie robocze 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalny anty-Ptc (Apa-1) 54 &mu; g/mL (rozcieńczenie robocze 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>Autor: Isabel Gerrero z DSHB pod auspicjami NICHD i utrzymywane przez The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/ml (rozcieńczenie robocze 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Falloidyna sprzężona z Alexa 488, 300 U/1,5 mML metanolu (rozcieńczenie robocze 1/600)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (stado muchowe)</td><td>Centrum Magazynowe Bloomington Drosophila&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów pcr

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Rozwój skrzydeł u Drosophila melanogaster jest idealnym modelem do badania morfogenezy na poziomie tkanki. Wyrostki te rozwijają się z grupy komórek zwanych dyskami imaginalnymi skrzydeł, które powstały podczas rozwoju embrionalnego. W stadiach larwalnych wyobrażone krążki rosną, zwiększając liczbę komórek i tworząc jednowarstwowe struktury nabłonkowe. Wewnątrz koperty poczwarki wyimaginowane dyski wyrastają i składają się w dwie warstwy wzdłuż linii, która staje się przyszłym brzegiem skrzydła. Podczas tego procesu podłużne żyły primodia tworzą komórki żyłowe na prospektywnej grzbietowej i brzusznej powierzchni skrzydła. W stadium poczwarki paski komórek żyłowych każdej powierzchni komunikują się w celu wytworzenia ciasnych rurek; W tym samym czasie zaczynają się tworzyć żyły krzyżowe.
Za pomocą odpowiednich markerów molekularnych możliwe jest zidentyfikowanie głównych elementów składających się na skrzydło podczas jego rozwoju. Z tego powodu zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tej strukturze ma kluczowe znaczenie dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju skrzydła.
Procedura opisana tutaj skupia się na manipulowaniu skrzydłami poczwarki, dostarczając szczegółowych instrukcji, jak przeprowadzić sekcję skrzydła podczas fazy poczwarki. Sekcja tkanki poczwarki jest trudniejsza do wykonania niż ich odpowiedniki u larw w trzecim stadium rozwojowym. Właśnie dlatego opracowano to podejście, aby uzyskać szybkie i wydajne próbki wysokiej jakości. Szczegółowe informacje na temat sposobu barwienia immunologicznego i montowania tych próbek skrzydeł, aby umożliwić wizualizację białek lub składników komórkowych, znajdują się w protokole. Przy niewielkiej wiedzy specjalistycznej możliwe jest zebranie 8-10 wysokiej jakości skrzydeł poczwarek w krótkim czasie.

Protokół ten oferuje prostą metodę pozyskiwania próbek skrzydeł poczwarki, które zachowują typową morfologię skrzydła. Z takich preparatów możliwe jest uzyskanie stosów obrazów, które mogą być projektowane w 2D lub 3D, aby zbadać rozkład i/lub wzbogacenie białek podczas różnicowania skrzydła. Podobny protokół (patrz uwaga w punkcie 2.9) może być wykorzystany do pobrania dużej próbki skrzydeł poczwarki (obejmującej 50-80 skrzydeł poczwarki), niezbędnej do syntezy komplementarnego kwasu dez...

Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie szybkiej i wydajnej metody preparowania skrzydeł poczwarki Drosophila, odpowiedniej do immunodetekcji lub analiz PCR. Opisana tutaj procedura została opracowana w odpowiedzi na zapotrzebowanie na szybką i skuteczną metodę pozyskiwania próbek skrzydeł poczwarek nadających się do przeprowadzenia analiz PCR lub protokołów immunodetekcji. Za pomocą mokrego pędzelka ostrożnie przenieś poczwarki w zerowej godzinie APF z fiolek hodowlanych do nowych fiolek, aby mogły dokończyć okres rozwoju.Na przykład, w przypadku użycia poczwarki w 24. godzinie APF, należy pozostawić ją w fiolce tylko na 22 godziny. Po 22 godzinach przenieść poczwarkę na szkiełko przedmiotowe z przyklejoną dwustronną taśmą. Przenoszenie można przeprowadzić za pomocą pędzla, aby uniknąć uszkodzenia poczwarki.Przeczkrzeszkę należy ułożyć w rządzie, stronami grzbietowymi do góry, a końcami głowowymi skierowanymi w tym samym kierunku. Następnie należy umieścić szkiełko mikroskopowe w stałej temperaturze i pozwolić poczwarce na przejście odpowiedniego czasu rozwoju. W tym przypadku będzie to 24 godziny.Przeszkło podstawne z dwustronną taśmą posłuży jako tymczasowa platforma do sekcji w celu usunięcia poczwarki. Podczas dwóch godzin przebywania na szkiełku podstawnym poczwarka wyschnie, co sprawi, że będzie łatwo pękać pod wpływem pęsety. Pierwszym krokiem sekcji jest usunięcie poczwarki z odwłoka.Następnie poczwarkę przenosi się na inny szkiełko z przyklejoną dwustronną taśmą. Powłoka poczwarki zostaje usunięta. Poczwarkę przykleja się stroną brzuszną do góry, umieszczając ją na środku taśmy.Przed wykonaniem nacięcia skrzydła poczwarka musi zostać pokryta roztworem zgodnie z procedurą stosowaną w immunohistochemii. Roztwór ten będzie pełnił funkcję utrwalającą, a skrzydło zostanie uwolnione z kutykuli. Za pomocą pęsety delikatnie usuń operkulum z poczwarki.Rozłupać poczwarkę za pomocą pęsety, prowadząc nacięcie wzdłuż boku poczwarki aż do jej końca kadalnego. Przy odpowiednim oświetleniu można zwizualizować wewnętrzną strukturę poczwarki, zauważając wyraźną przestrzeń tuż nad zawiasem skrzydła poczwarki. Przestrzeń ta służy jako punkt orientacyjny do wykonania otwarcia bez uszkodzenia poczwarki.Po bocznym otwarciu kokonu możliwe będzie usuwanie jego fragmentów, chwytając je za otwartą krawędź i przenosząc na przeciwną stronę, gdzie zostaną one przymocowane za pomocą dwustronnej taśmy. Pod koniec sekcji poczwarka będzie niemal całkowicie odsłonięta. Tylko fragment kokonu będzie pokrywał jej tylny koniec.Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij pozostałą część kokonu. Ten ruch uniesie wewnętrzny koniec poczwarki, co pozwoli głowie i tułowi pozostać w optymalnej pozycji do utrwalenia w kolejnym kroku. Weź nowe szkiełko z dwustronną taśmą klejącą i odwróć je, przykładając do poczwarki.Następnie lekko dociśnij, aby poczwarka przykleiła się do taśmy, i ostrożnie wsuń szkiełko, aby oddzielić poczwarkę od pozostałych kokonów. Odwróć szkiełko mikroskopowe. Poczwarka będzie przyklejona stroną grzbietową na wysokości głowy lub klatki piersiowej.Do immunohistochemii należy pokryć całą nagą poczwarkę 4%paraformaldehydem. Po 10 minutach w utrwalaczu, za pomocą nożyczek, wykonać małe nacięcie w okolicy zawiasu skrzydła lub w jego pobliżu. Należy dopuścić, aby utrwalacz dotarł do nabłonka skrzydła.Następnie po pięciu minutach, za pomocą pęsety, rozerwij brzegi kutykuli, powiększając otwór i umożliwiając uwolnienie nabłonka skrzydła z worka kutykularnego. Po uwolnieniu tkanki skrzydła pozostaw ją w roztworze paraformaldehydu do momentu zakończenia 30-minutowej fiksacji. Metoda sekcji opisana w tym filmie może być wykorzystana do przygotowania wysokiej jakości próbek skrzydeł poczwarki Drosophila z różnych etapów rozwoju dla wielu rodzajów technik.Protokół można przeprowadzić w celu wypreparowania jednej poczwarki lub kilku poczwarek jednocześnie. Pomaga to przyspieszyć procedurę, ułatwiając uzyskanie dużej liczby wypreparowanych skrzydeł. Aby usunąć nagą poczwarkę z otwartej osłonki, ważne jest, aby końcówka tylna była wystarczająco mała.Choć możliwe jest jednoczesne usunięcie rzędu czterech lub pięciu nagich poczwarek, nie jest to kwestią istotną, gdyż pozostałe przymocowane do swoich pochewek osobniki można usuwać w kolejnych krokach, używając pojedynczej taśmy dwustronnej. Jest to obraz konfokalny skrzydła w 24–30 godzinie APF. Barwienie wykazuje ekspresję białka patched, kanonicznego receptora hedgehog, a także jądra komórkowe i filamenty aktynowe.Podobny proces sekcji można wykorzystać do pobrania większych próbek skrzydeł w celu izolacji mRNA. mRNA to może zostać wykorzystane do syntezy cDNA, który z kolei może być użyty w reakcjach PCR. Przedstawiamy tutaj produkty otrzymane w celu wykrycia ekspresji genów patched oraz actin.Protokół ten oferuje prostą metodę pozyskiwania próbek skrzydeł poczwarki, które zachowują charakterystyczną morfologię skrzydła. Z tych preparatów możliwe jest uzyskanie stosów obrazów, które mogą być rzutowane jako obrazy 2D lub 3D w celu zbadania rozkładu i/lub wzbogacenia białek podczas różnicowania skrzydła. Podobny protokół można zastosować do pobrania dużej próbki skrzydła poczwarki, niezbędnej do syntezy cDNA – cząsteczki kluczowej w reakcjach PCR.Niniejsza procedura stanowi alternatywne i uzupełniające podejście do opublikowanych już metod sekcji skrzydeł poczwarki.

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Opisano metodę immunobarwienia i wizualizacji organów chordotonalnych w larwach i poczwarkach Drosophila melanogaster.

Wizualizacja proprioceptorów w larwach i poczwarkach Drosophila

Mięśnie lotu Drosophila są używane jako modelowy system dla rozwoju i fizjologii mięśni. Ten film opisuje muskulaturę lotu dorosłych osobników i przedstawia protokół analizy rozwijających się pośrednich mięśni lotu, które są odpowiednie do sekwencjonowania RNA z poczwarek.

Drosophila Rozwarstwienie mięśni lotu pośredniego późnej poczwarki (IFM): metoda wysokoprzepustowego pobierania tkanek

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

Opisano protokoły dotyczące okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Klasyfikacja i kwantyfikacja pigmentacji stanowią solidną podstawę do badania mechanizmów rozwojowych cech dorosłych i umożliwiają międzygatunkowe porównanie rozwoju cech.

Metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera

Tutaj prezentujemy protokół do etapowania i preparowania rozwijającej się tkanki węchowej z gatunku Drosophila. Wypreparowana tkanka może być później wykorzystana do analiz molekularnych, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa RT-Transcription-Polymerase Chain Reaction) lub sekwencjonowanie RNA (RNAseq), a także do analiz in vivo, takich jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ.

Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Mięsień lotu Drosophila to potężny model do badania regulacji transkrypcji, alternatywnego splicingu, metabolizmu i mechanobiologii. Przedstawiamy protokół preparacji znakowanych fluorescencyjnie mięśni lotnych z żywych poczwarek w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych próbek, idealnych do proteomiki i głębokiego sekwencjonowania. Próbki te mogą dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w różne aspekty rozwoju mięśni.

Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje przygotowanie i wizualizację utrwalonej tkanki poczwarki Drosophila notum. Może być stosowany zarówno do nienaruszonej, jak i zranionej tkanki, a oryginalna architektura tkanki zostaje zachowana. Procedury preparowania, mocowania i barwienia są opisane w tym artykule.

Preparowanie, naprawianie i wizualizacja poczwarki Drosophila notum

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Poznaj szybką metodę preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila do immunodetekcji i PCR. Technika umożliwia badanie lokalizacji transkryptów i białek podczas rozwoju.

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

Przeglądaj więcej filmów