Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR
30 grudnia 2017
Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).
Ogólnym celem tej procedury jest szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do testów immunologicznych lub PCR. Opisana tutaj procedura została opracowana w odpowiedzi na zapotrzebowanie na szybką i skuteczną metodę pozyskiwania próbek skrzydeł poczwarek odpowiednich do wykonywania testów PCR lub protokołów immunodetekcji. Za pomocą mokrego pędzla delikatnie usuń poczwarkę APF o zerowej godzinie z fiolek hodowlanych i umieść je w nowych fiolkach, aby zakończyć okres rozwoju.
Na przykład, jeśli używasz poczwarki, która ma 24 godziny APF, pozostanie w fiolce tylko 22 godziny. Po 22 godzinach przenieś poczwarkę na szkiełko mikroskopowe z przyklejoną do niego taśmą dwustronną. To przeniesienie można wykonać za pomocą pędzla, aby uniknąć uszkodzenia poczwarki.
Poczwarkę należy ustawić w rzędzie grzbietem do góry i końcami głowowymi skierowanymi w tym samym kierunku. Następnie przywróć szkiełko mikroskopowe do stałej temperatury i pozwól poczwarce ukończyć odpowiedni czas rozwoju. W tym przypadku byłyby to 24 godziny.
Szkiełko mikroskopowe z taśmą dwustronną będzie przejściową platformą preparacyjną do usunięcia koperty poczwarki. W ciągu dwóch godzin na szkiełku mikroskopowym etui poczwarki wyschnie, dzięki czemu można je łatwo złamać kleszczami. Pierwszym krokiem w sekcji jest usunięcie poczwarki z tuszy.
Następnie poczwarka zostanie przeniesiona na inną szkiełko z przyklejoną do niej taśmą dwustronną. Tusza zostanie pozostawiona. Ta poczwarka zostanie utknięta brzuszną stroną skierowaną do góry, umieszczoną na środku taśmy.
Przed wykonaniem cięcia skrzydła poczwarkę należy pokryć roztworem zgodnie z procedurą z zastosowaniem immunohistochemii. To rozwiązanie będzie afiksywne, a skrzydło zostanie uwolnione od naskórka. Za pomocą kleszczy delikatnie wyjmij wieczko z etui poczwarki.
Przełam obudowę kleszczami, tworząc linię wzdłuż boku poczwarki do jej ogonowego końca. Przy odpowiednim oświetleniu możliwe jest uwidocznienie wewnętrznego kształtu poczwarki, tworząc widoczną przestrzeń tuż nad zawiasem skrzydła poczwarki. Ta przestrzeń służy jako przewodnik do wykonania otwarcia bez uszkadzania poczwarki.
Ponieważ etui jest otwierane z boku, będzie można usunąć jego części, podnosząc je przy otwartej granicy i przenosząc na przeciwną stronę, gdzie przytrzyma je dwustronna taśma. Pod koniec sekcji poczwarka będzie prawie naga. Tylko kawałek etui będzie zakrywał tylną końcówkę.
Za pomocą kleszczy delikatnie dociśnij pozostałą część etui. Ten ruch podniesie wewnętrzny koniec poczwarki, pozwalając zarówno głowie, jak i klatce piersiowej pozostać w preferencyjnej pozycji, aby przykleić się do następnego stopnia. Weź nowy slajd z taśmą dwustronną i odwróć go na poczwarce.
Następnie lekko dociśnij, aby poczwarka przykleiła się do taśmy i delikatnie zsuń suwak, aby wyjąć poczwarkę z pozostałych etui. Odwróć szkiełko mikroskopu. Poczwarka utknie po stronie grzbietowej na poziomie głowy lub klatki piersiowej.
Do celów immunohistochemicznych przykryj całą nagą poczwarkę 4% paraformaldehydem. Po 10 minutach w afiksatywie, za pomocą nożyczek, wykonaj małe nacięcie w okolicy zawiasów skrzydła lub w jego pobliżu. Pozwól, aby afiksatyw dotarł do nabłonka skrzydeł.
Następnie po pięciu minutach oderwij kleszczami brzegi naskórka, rozszerzając otwór i umożliwiając uwolnienie nabłonka skrzydeł z worka naskórka. Po uwolnieniu tkanki skrzydła pozostaw ją w roztworze paraformaldehydu do zakończenia 30 minut utrwalania. Metoda preparacji opisana w tym filmie może być wykorzystana do przygotowania wysokiej jakości próbek skrzydeł poczwarek Drosophila z różnych etapów rozwoju dla wielu rodzajów technik.
Protokół można wykonać w celu wypreparowania jednej poczwarki lub kilku poczwarek w tym samym czasie. Pomaga to przyspieszyć procedurę, ułatwiając dotarcie do dużej liczby wypreparowanych skrzydeł. Aby usunąć nagą poczwarkę z otwartego etui, ważne jest, aby tylna końcówka była wystarczająco mała.
Chociaż możliwe jest usunięcie rzędu czterech lub pięciu nagich poczwarek w tym samym czasie, nie jest to istotny punkt, ponieważ można usunąć te, które pozostały przymocowane do ich etui w kolejnych krokach za pomocą jednej taśmy dwustronnej. Jest to obraz konfokalny skrzydła APF trwającego od 24 do 30 godzin. Barwienie pokazuje ekspresję łaciatego białka, kanonicznego receptora jeża, jąder i włókien aktyny.
Podobny proces preparacji można zastosować do uzyskania większych próbek skrzydeł w celu wyizolowania mRNA. To mRNA może być wykorzystane do syntezy cDNA, które można wykorzystać w reakcjach PCR. Tutaj pokazujemy produkty uzyskane w celu wykrycia ekspresji łaty i aktyny.
Protokół oferuje prostą metodę uzyskiwania próbek skrzydeł poczwarki, które zachowują znaną morfologię skrzydła. Na podstawie tych preparatów możliwe jest uzyskanie stosów obrazów, które mogą być wyświetlane jako obrazy 2D lub 3D w celu zbadania dystrybucji i/lub wzbogacania białek podczas różnicowania skrzydła. Podobny protokół można zastosować do pobrania dużej próbki skrzydeł poczwarki niezbędnej do syntezy cDNA, cząsteczki niezbędnej w reakcjach PCR.
Procedura ta stanowi alternatywne i uzupełniające podejście do już opublikowanych metod rozwarstwiania skrzydeł poczwarki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje szybką i wydajną metodę preparowania skrzydeł poczwarki Drosophila, które są niezbędne do stosowania różnych technik, takich jak immunodetekcja i analizy PCR. Procedura ma na celu ułatwienie badania lokalizacji transkryptów i białek podczas rozwoju.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Genetyka
Wprowadzenie
- Zrozumienie lokalizacji transkryptów i białek jest kluczowe w badaniach rozwojowych.
- Drosophila służy jako organizm modelowy w badaniach genetycznych i rozwojowych.
- Wydajne przygotowanie próbek jest niezbędne dla uzyskania dokładnych wyników eksperymentalnych.
- Immunodetekcja i PCR to powszechne techniki stosowane w badaniach biologicznych.
Cel badania
- Przedstawienie prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki.
- Zwiększenie efektywności pozyskiwania próbek do analiz immunodetekcyjnych oraz testów PCR.
- Wsparcie badań nad lokalizacją transkryptów i białek podczas rozwoju Drosophila.
Zastosowane Metody
- Użycie wilgotnego pędzla do delikatnego manipulowania poczwarkami.
- Przeniesienie poczwarek na szkiełka przedmiotowe za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.
- Dostosowanie czasu przeniesienia do wieku poczwarki.
- Minimalizacja uszkodzeń poczwarki podczas procesu sekcji.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia pobranie nienaruszonych próbek skrzydeł poczwarki.
- Uzyskane próbki nadają się do różnorodnych dalszych zastosowań.
- Procedura jest szybka i minimalizuje stres próbek.
- Ułatwia precyzyjne badania lokalizacji w organizmach Drosophila.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w dyssekcji skrzydeł poczwarki.
- Wspiera ona badanie procesów rozwojowych u Drosophila.
- Technikę tę można dostosować do różnych potrzeb eksperymentalnych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne przygotowanie próbek skrzydeł poczwarek Drosophila umożliwia wiarygodną detekcję ekspresji transkryptów i białek, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Metoda ta zapewnia szybki i powtarzalny schemat postępowania w celu uzyskania wysokiej jakości materiału biologicznego odpowiedniego do dalszych analiz, co redukuje zmienność w przesiewaniu fenotypowym i opracowywaniu testów. Dzięki standaryzacji dyssekcji skrzydeł zespoły badawcze mogą zwiększyć pewność prognostyczną w analizie szlaków sygnałowych i priorytetyzować cele o silniejszym uzasadnieniu mechanistycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez lokalną detekcję białek, takich jak patched (kanoniczny receptor hedgehog), w rozwijającej się tkance skrzydła.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego, umożliwiając spójne pobieranie próbek na różnych etapach rozwoju w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ocenę stopnia zaangażowania celu oraz wzorców ekspresji, które są kluczowe dla identyfikacji wiodących związków i selekcji projektów w portfolio.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie nienaruszonych próbek skrzydeł poczwarki odpowiednich do immunodetekcji i analiz PCR, co umożliwia ilościowe odczyty ekspresji genów i białek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek, poprawiając powtarzalność i skalowalność kampanii wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
- Gotowość do analizy: Generuje materiał kompatybilny z dalszą analizą molekularną, wspierając niezawodną ocenę związków w badaniach fenotypowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia system istotny dla badania chorób pod kątem morfogenezy, z bezpośrednią możliwością zastosowania w modelowaniu szlaków rozwojowych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia wizualizację rozmieszczenia i wzbogacenia białek podczas różnicowania, co pozwala ocenić wiarygodność celów terapeutycznych.
- Zgodność przedkliniczna: Wspiera ocenę biomarkerów poprzez wykrywalną ekspresję markerów, takich jak aktyna i patched, w nabłonku skrzydła.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu, przez rozwój testów, aż po ocenę przedkliniczną, oferując wielokrotnego użytku technikę przygotowania próbek do badań opartych na Drosophila.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie wykrywania komunikacji komórek żyłkowania oraz powstawania żyłek poprzecznych podczas rozwoju poczwarki.
- Przesiewy: Dostarcza próbek gotowych do analizy o spójnej morfologii, co zwiększa wiarygodność wyników immunodetekcji oraz odczytów opartych na PCR.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary poziomów transkrypcyjnych i białkowych, pomagając w analizie porównawczej w różnych warunkach genetycznych lub eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne odkrycia z walidacją przedkliniczną dzięki konserwatywnym mechanizmom rozwojowym obserwowalnym w morfogenezie skrzydeł.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia standaryzowany protokół sekcji, który można zastosować w wielu projektach badających genetykę rozwoju Drosophila.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach rozwojowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność przygotowania próbek, wspierając spójną wydajność testów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki dostarczeniu wiarygodnych danych o ekspresji i lokalizacji celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju skorygowanych o ryzyko dzięki wysokiej jakości danym mechanistycznym pochodzącym z powtarzalnych próbek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy w zakresie obchodzenia się z Drosophila oraz mikroskopii.
- Opiera się na standardowych narzędziach: mokrym pędzelku, pincecie, szkiełkach przedmiotowych z obustronną taśmą klejącą oraz 4% paraformaldehydzie.
- Wymaga precyzyjnego przestrzegania czasu liczonego od momentu powstania poczwarki (APF), aby dopasować do odpowiednich etapów rozwoju.
- Metoda jest możliwa do zastosowania na różnych etapach rozwoju skrzydeł, lecz zoptymalizowano ją dla poczwarek w 24–30 godzinach APF.
- Ograniczeniem jest konieczność starannego manualnego preparowania w celu uniknięcia uszkodzenia tkanek, choć biegłość w tej czynności wzrasta wraz z praktyką.
