Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie zdrowych, czystych populacji neuronów ziarnistych móżdżku oraz genetyczne manipulowanie nimi i modelowanie różnych mechanizmów uszkodzenia neuronów w pierwotnej hodowli in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie uszkodzeń neuronów. Używamy tego protokołu do zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uszkodzeń nerwowych po ostrym uszkodzeniu mózgu i chorobach neurogeneratywnych.

Główną zaletą tego protokołu jest to, że możemy modelować różne mechanizmy śmierci komórki, takie jak ekscytotoksyczność, stres oksydacyjny, uszkodzenie DNA i zdarzenie rozwojowe za pomocą systemu hodowli. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat uszkodzeń neuronów, może być również stosowana z neuronami móżdżku szczura do badania aktywności neuronalnej i morfogenezy w odpowiedzi na czynniki wzrostu i zdarzenia uboczne. Aby wydobyć mózg sześcio- lub siedmiodniowej myszy, użyj kleszczy, aby chwycić głowę, a następnie za pomocą nożyczek do mikropreparacji przeciąć skórę do przodu w kierunku głowy.

Odepchnij skórę, aby odsłonić czaszkę. Następnie przebij czaszkę czubkiem nożyczek i przetnij z przodu i na boki. Uważając, aby nie uszkodzić móżdżku i ułatwić identyfikację i usunięcie opon mózgowych, użyj kleszczy, aby odkleić czaszkę, odsłaniając mózg.

Za pomocą kleszczy lub szpatułki delikatnie przetrzyj mózg w chłodnym roztworze preparacyjnym. Aby wyizolować móżdżek, umieść mózg w roztworze preparacyjnym uzupełnionym siarczanem magnezu i trzymaj roztwór i mózg na lodzie. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń opony mózgowe za pomocą drobnych kleszczy, a następnie wypreparuj móżdżek z mózgu w roztworze preparacyjnym uzupełnionym siarczanem magnezu.

Pomaga to w odklejaniu pozostałych opon mózgowych i pozwala przejść między warstwami w celu oczyszczenia fałdów móżdżku. Obecność opon mózgowych w hodowli neuronów powoduje niezdrowe komórki i ostateczną śmierć komórki. W związku z tym ważne jest, aby zapewnić całkowite usunięcie opon mózgowych przed przystąpieniem do hodowli.

Następnie obróć móżdżek na jego brzuszną stronę i upewnij się, że usunięto splot naczyniówkowy. Następnie wciągnij móżdżek do 35-milimetrowego naczynia zawierającego jeden mililitr roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego siarczanem magnezu. Pokrój tkanki na małe kawałki i przenieś je do 50-mililitrowej probówki zawierającej 30 mililitrów roztworu rozwarstwiającego z buforem siarczanu magnezu.

Na tym etapie odwiruj 15-mililitrową probówkę zawierającą posiekaną tkankę mózgową przez pięć minut w temperaturze 644 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Następnie usuń supernatant i dodaj 10 mililitrów roztworu do rozwarstwiania trypsyny. Następnie potrząsaj stołem na wysokich obrotach przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj dwa mililitry roztworu inhibitora trypsyny do probówki i delikatnie kołysz przez dwie minuty. Następnie odwiruj probówkę przez pięć minut w temperaturze 644 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Po pięciu minutach usuń supernatant i dodaj dwa mililitry roztworu inhibitorów trypsyny dwa przed przeniesieniem go do 15-mililitrowej probówki.

Następnie rozcieraj tkankę w 15-mililitrowej probówce, aż roztwór stanie się mętny. Pozwól mu osiąść na pięć minut. Następnie usunąć klarowny supernatant i przenieść go do nowej probówki zawierającej jeden mililitr roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego chlorkiem wapnia.

Dodaj kolejne dwa mililitry roztworu inhibitora trypsyny dwa na dno probówki zawierającej osad. Ponownie rozetrzyj go i pozwól mu osiąść przez pięć minut. Usunąć supernatant i dodać go do probówki zawierającej supernatant z poprzedniego etapu.

Powtarzaj ten proces, aż większość tkanki zostanie mechanicznie zdysocjowana. Dodać 0,3 mililitra roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego chlorkiem wapnia do zbioru sklarowanego nad osadem na każdy mililitr supernatantu. Wymieszać zawartość probówki, a następnie odwirować przez pięć minut w temperaturze 644 razy G w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń supernatant. Dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki do granulki i wymieszaj. Następnie policz żywe komórki i rozcieńcz je do stężenia 1,5 razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

Płytkie komórki na wcześniej przygotowanych płytkach z poli D-lizyny. Dla płytek czterodołkowych, płytka 0,5 mililimitera próbki, co daje 7,5 razy 10 do piątej komórki na studzienkę. W przypadku szalek o średnicy 35 milimetrów umieść na płytce cztery mililitry próbki, dając sześć razy 10 do szóstych komórek na płytkę.

W przypadku szkiełek nakrywkowych płytka 0,5 mililitra, co daje 7,5 razy 10 do piątych komórek na studzienkę. Po 24 godzinach dodaj AraC do płytek, aby zmniejszyć zanieczyszczenie glejowe. Jeśli komórki mają być utrzymywane przez siedem do ośmiu dni, powtórz ten zabieg w trzecim dniu i utrzymuj hodowle w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W przypadku kultur utrzymywanych dłużej niż pięć dni należy podawać kulturę glukozą co dwa dni, począwszy od piątego dnia. Aby wywołać ekscytotoksyczność neuronalną NMDA, po siedmiu dniach in vitro, należy leczyć neurony ziarniste móżdżku 100 mikromolowymi NMDA i 10 mikromolowymi glicynami przez jedną godzinę. Następnie zastąp pożywkę kondycjonowaną pożywką z równoległych kultur bez obróbki.

Stężenie to powoduje 50% śmierć komórek w ciągu 24 godzin po zabiegu. W przypadku śmierci komórki wywołanej przez ROS należy traktować neurony nadtlenkiem wodoru o stężeniu od 75 do 100 mikromolów przez pięć minut. Po pięciu minutach przełącz go na kondycjonowane podłoża z równoległych kultur.

Ze względu na niestabilność nadtlenku wodoru, stężenie musi być zoptymalizowane do poziomu, który indukuje od 50 do 70% śmierci komórki po 24 godzinach. Stężenie to wynosi zwykle od 75 do 100 mikromolowych. Aby wywołać śmierć komórki przez uszkodzenie DNA, potraktuj neurony ziarniste móżdżku 10 mikromolowymi kamptotecyną, aby wywołać ponad 50% śmierć komórki w ciągu 24 godzin.

W przypadku apoptozy neuronalnej wywołanej niskim poziomem potasu w neuronach ziarnistych móżdżku, zmień pożywkę zawierającą 25 milimolów potasu na pożywkę o niskiej zawartości potasu z pięcioma milimolowymi potasami po siedmiu dniach in vitro. Neurony transdukowano lentiwirusem w celu uzyskania RFP w MOI wynoszącym trzy w czasie posiewu. Utrwalone i barwione po siedmiu dniach in vitro.

Wykazano, że kolokalizacja sygnału RFP MAP2 i Hoechst pokazuje zdrowe neurony, które są w pełni transdukowane przez lentiwirusy. Pokazane tutaj obrazy reprezentują analizy testowe żywych ciał i martwych neuronów zakażonych różnymi MOI adenowirusa w celu zmierzenia toksyczności. Neurony ziarniste móżdżku zakażone adenowirusem wykazującym ekspresję LacZ w zakresie MOI między 25 a 50 pozwalają na maksymalną wydajność przy zachowaniu minimalnej toksyczności.

Mniej niż 1% różnicy w przeżywalności komórek w porównaniu z grupą kontrolną obserwuje się w przypadku zakażenia w tym MOI. Rysunki te pokazują barwienie Hoechst kontrolnych neuronów ziarnistości móżdżku i neuronów ziarnistości móżdżku leczonych NMDA w celu wywołania śmierci komórki. Zwróć uwagę na tworzenie jąder piknotycznych po leczeniu NMDA.

Jest to wskaźnik śmierci komórki i można go zaobserwować w około 50% hodowli 24 godziny po leczeniu 100 mikromolowym NMDA i 10 mikromolową glicyną. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w dwie i pół godziny z sześcioma naciśnięciami myszy, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby używać techniki aseptycznej i przykutych narzędzi chirurgicznych zgodnie z wymaganiami, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia hodowli.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do badania rozwoju neuronów i uszkodzeń neuronów w pierwotnych neuronach myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyhodować ziarniste neurony móżdżku, manipulować nimi genetycznie za pomocą wirusów i indukować różne mechanizmy uszkodzenia neuronów. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak immunofluorescencja lub testy żywotności komórek, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak to, czy gen będący przedmiotem zainteresowania zwiększa przeżywalność komórek w odpowiedzi na ekscytotoksyczność, stres oksydacyjny lub uszkodzenie DNA.