Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie zdrowych, czystych populacji neuronów ziarnistych móżdżku, ich manipulacja genetyczna oraz modelowanie różnych mechanizmów uszkodzeń neuronów w pierwotnej kulturze in vitro. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie uszkodzeń neuronów. Stosujemy ten protokół do badania podstawowych mechanizmów molekularnych uszkodzeń neurologicznych następujących po ostrym uszkodzeniu mózgu oraz w chorobach neurodegeneracyjnych.

Główną zaletą niniejszego protokołu jest możliwość modelowania różnych mechanizmów śmierci komórkowej, takich jak ekscytotoksyczność, stres oksydacyjny, uszkodzenia DNA oraz zdarzenia rozwojowe, przy użyciu tego systemu hodowli. Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o uszkodzeniach neuronów, może być ona również stosowana w przypadku neuronów móżdżku szczura do badania aktywności neuronalnej i morfogenezy w odpowiedzi na czynniki wzrostu oraz zdarzenia poboczne. Aby wyekstrahować mózg myszy w wieku od sześciu do siedmiu dni, należy użyć pęsety do uchwycenia głowy, a następnie za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych naciąć skórę w kierunku przednim w stronę głowy.

Odsunąć skórę, aby odsłonić czaszkę. Następnie przebić czaszkę końcem nożyczek i przeciąć ją w kierunku przednim oraz bocznym. Uważając, aby nie uszkodzić móżdżku i ułatwiając identyfikację oraz usunięcie opon mózgowych, użyć pęsety do odchylenia czaszki w celu odsłonięcia mózgu.

Za pomocą pęsety lub szpatułki delikatnie wyjmij mózg do schłodzonego roztworu sekcyjnego. Aby wyizolować móżdżek, umieść mózg w roztworze sekcyjnym uzupełnionym o siarczan magnezu i trzymaj roztwór oraz mózg na lodzie. Pod mikroskopem sekcyjnym usuń opony mózgowe za pomocą precyzyjnej pęsety, a następnie wypreparuj móżdżek z mózgu w roztworze sekcyjnym uzupełnionym o siarczan magnezu.

Ułatwia to oddzielenie pozostałych opon mózgowych i umożliwia przedostanie się między warstwy w celu oczyszczenia zakładów móżdżku. Obecność opon w kulturze neuronów prowadzi do powstania niezdrowych komórek i ich ostatecznej śmierci. W związku z tym przed przystąpieniem do hodowli ważne jest zapewnienie całkowitego usunięcia opon mózgowych.

Następnie odwróć móżdżek stroną brzuszną i upewnij się, że splot naczyniowy został usunięty. Potem przełóż móżdżki do naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego jeden mililitr roztworu do sekcji z dodatkiem siarczanu magnezu. Posiekaj tkanki na małe kawałki i przelej je do probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 30 mililitrów buforowanego roztworu do sekcji z siarczanem magnezu.

Na tym etapie należy odwirować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą posiekaną tkankę mózgu przez pięć minut przy 644 ×g i temperaturze 4 °C. Następnie należy usunąć nadsącz i dodać 10 ml roztworu trypsyny do dysekcji. Po tym wstrząsać na wytrząsarce z wysoką prędkością przez 15 minut w temperaturze 37 °C.

Do probówki dodaj 2 ml roztworu inhibitora trypsyny nr 1 i delikatnie mieszaj przez 2 minuty. Następnie wiruj probówkę przez 5 minut przy 644 ×g w temperaturze 4 °C. Po 5 minutach odlej supernatant, dodaj 2 ml roztworu inhibitora trypsyny nr 2, a następnie przenieś zawartość do probówki o pojemności 15 ml.

Następnie utrzeć tkankę w probówce o pojemności 15 ml, aż roztwór stanie się mętny. Pozostawić do odstania przez pięć minut. Następnie usunąć klarowny supernatant i przenieść go do nowej probówki zawierającej 1 ml roztworu do sekcji uzupełnionego o chlorek wapnia.

Dodaj kolejne 2 ml roztworu inhibitora trypsyny dwa na dno probówki zawierającej osad. Ponownie go utrzyturuj i pozostaw na pięć minut do sedymentacji. Odlej supernatant i dodaj go do probówki zawierającej supernatant z poprzedniego kroku.

Powtarzaj ten proces, aż większość tkanki zostanie rozdzielona mechanicznie. Do zebranego nadsączu dodaj 0,3 mililitra roztworu do sekcji z dodatkiem chlorku wapnia na każdy mililitr nadsączu. Wymieszaj zawartość probówki, a następnie wiruj przez pięć minut przy 644 ×g w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń supernatant. Do osadu dodaj 10 ml świeżej pożywki i wymieszaj. Następnie policz żywe komórki i rozcieńcz je do stężenia 1,5 × 10⁶ komórek na ml.

Wysiej komórki na wcześniej przygotowane płytki z poli-D-lizyną. W przypadku płytek czterodołkowych wysiej 0,5 ml próbki, co zapewni 7,5 × 10⁵ komórek na dołek. W przypadku naczyń 35 mm wysiej 4 ml próbki, co zapewni 6 × 10⁶ komórek na naczynie.

W przypadku szkiełek podstawkowych, nanieś 0,5 ml zawiesiny, co daje 7,5 × 10⁵ komórek na dołek. Po 24 godzinach dodaj do płytek AraC w celu zmniejszenia kontaminacji komórkami glejowymi. Jeśli komórki mają być utrzymywane przez siedem do ośmiu dni, powtórz tę procedurę w trzeciej dobie i inkubuj hodowle w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.

W przypadku kultur utrzymywanych przez więcej niż pięć dni, od piątego dnia należy dostarczać do kultury glukozę co dwa dni. Aby wywołać ekscytotoksyczność neuronalną za pomocą NMDA, po siedmiu dniach in vitro, należy potraktować neurony ziarniste móżdżku 100 µM NMDA i 10 µM glicyny przez jedną godzinę. Następnie należy wymienić medium na medium warunkujące z równoległych kultur niepoddanych działaniu czynnika.

Stężenie to powoduje śmierć 50% komórek w 24 godzinach po zastosowaniu preparatu. Aby wywołać śmierć komórek indukowaną przez ROS, należy traktować neurony nadtlenkiem wodoru w stężeniu od 75 do 100 µM przez pięć minut. Po pięciu minutach należy zmienić medium na medium warunkowane z hodowli równoległych.

Ze względu na niestabilność nadtlenku wodoru, jego stężenie musi zostać zoptymalizowane do poziomu wywołującego od 50 do 70% śmierci komórek po 24 godzinach. Stężenie to zazwyczaj mieści się w przedziale od 75 do 100 micromolar. Aby wywołać śmierć komórek poprzez uszkodzenie DNA, należy potraktować neurony ziarniste móżdżku 10 micromolar kamptotecyną, co indukuje śmierć ponad 50% komórek w ciągu 24 godzin.

W celu indukowania apoptozy neuronalnej indukowanej niskim poziomem potasu w neuronach ziarnistych móżdżku, po siedmiu dniach in vitro należy zmienić medium zawierające 25 millimolar potassium na medium z niską zawartością potasu o stężeniu five millimolar potassium. Neurony zostały transdukowane lentiwirusem dla RFP przy MOI wynoszącym trzy w momencie wysiewania. Utrwalenie i barwienie przeprowadzono w siódmym dniu in vitro.

Współkolokalizacja sygnału RFP, MAP2 oraz Hoechst została przedstawiona w celu wykazania zdrowych neuronów w pełni transdukowanych przez lentiwirusy. Przedstawione tutaj obrazy reprezentują analizy testu żywotności (live-dead assay) neuronów zainfekowanych adenowirusami o różnych wartościach MOI w celu pomiaru toksyczności. Neurony ziarniste móżdżku zainfekowane adenowirusami wykazującymi ekspresję LacZ przy MOI w zakresie od 25 do 50 pozwalają na osiągnięcie maksymalnej wydajności przy zachowaniu minimalnej toksyczności.

Przy infekcji z zastosowaniem tej MOI obserwuje się różnicę w przeżywalności komórek mniejszą niż 1% w porównaniu z grupą kontrolną. Ryciny te przedstawiają barwienie Hoechstem kontrolnych neuronów ziarnistych móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku poddanych działaniu NMDA w celu indukowania śmierci komórek. Zwróć uwagę na powstawanie jąder piknotycznych po zastosowaniu NMDA.

Jest to oznaka śmierci komórek, którą można zaobserwować w około 50% kultury 24 godziny po zastosowaniu 100 µM NMDA oraz 10 µM glicyny. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w dwie i pół godziny dla sześciu preparatów z myszy, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest stosowanie zasad aseptyki oraz sterylizowanych narzędzi chirurgicznych, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji kultury.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do studiowania rozwoju oraz uszkodzeń neuronów w pierwotnych kulturach neuronów mysich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie hodować neurony ziarniste móżdżku, manipulować nimi genetycznie przy użyciu wirusów oraz indukować różne mechanizmy uszkodzeń neuronów. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunofluorescencja lub testy żywotności komórek, aby odpowiedzieć na pytania, na przykład czy interesujący nas gen zwiększa przeżywalność komórek w odpowiedzi na ekscytotoksyczność, stres oksydacyjny lub uszkodzenia DNA.