Name: Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku myszy do modelowania śmierci komórkowej, stresu oksydacyjnego i uszkodzeń DNA w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych oraz granty Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem dla A.J.-A.

Ten protokół opiera się na modyfikacjach procedur, które zostały opisane wcześniej 18,24,25,26,27. Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie McGill.
1. Przygotowanie do eksperymentu
UWAGA: Następujące roztwory podstawowe mogą być przygotowane i utrzymywane aż do użycia.
<ol>
	<li>Rozwiązanie do rozwarstwiania
	<ol>
		<li>Rozpuścić 3,62 g chlorku sodu (NaCl), 0,2 g chlorku potasu (KCl), 0,069 g fosforanu sodu (NaH2PO4 ∙ H2O) i 1,306 g D-(+)-glukozy w 500 ml destylowanegoH2O. Następnie do roztworu dodać 12,5 ml buforu HEPES, 450 μl roztworu czerwieni fenolowej i 20 ml frakcji B V. Dostosować do pH 7,4 za pomocą 1 N wodorotlenku sodu (NaOH).</li>
		<li>Sterylizować filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie pozostanie stabilne przez okres od tygodnia do 10 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>trypsyna
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 25 g/l trypsyny w 0,9% chlorku sodu. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inhibitor trypsyny
	<ol>
		<li>Przygotować bulion o stężeniu 10 mg/ml, rozpuszczając 1 g inhibitora trypsyny białka jaja kurzego w 100 ml 1 mM HCl. Przechowywać ten roztwór w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strefa DNaza
	<ol>
		<li>Rozpuść 100 mg DNazy 1 w 10 ml sterylnej wody, aby uzyskać zapas 10 mg/ml. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MgSO4
	<ol>
		<li>Dodać 6,02 g siarczanu magnezu (MgSO4) do 50 ml wody destylowanej (H2O), aby uzyskać 1 M zapas. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CaCl 2
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,735 g chlorku wapnia (CaCl2∙ 2H2O) w 50 ml destylowanegoH2Odo stężenia podstawowego 100 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kcl
	<ol>
		<li>Rozpuścić 3,7275 g KCl w 50 ml destylowanegoH2Odo stężenia podstawowego 1 M. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>D-(+)-glukoza
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1,802 g D-(+)-glukozy w 50 ml destylowanegoH2Odo stężenia podstawowego 100 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywki do hodowli komórkowych
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych w następujący sposób: 5 ml inaktywowanej termicznie dializowanej płodowej surowicy bydlęcej, 500 μl 200 mM L-glutaminy, 100 μl 50 mg/ml Gentamycyny i 1 ml 1,0 M KCL należy dodać do 45 ml minimalnej niezbędnej pożywki Eagle'a sterylizowanej filtrem (E-MEM), którą uzupełnia się 1,125 g / l D-glukozy w celu wytworzenia 50 ml pożywki do hodowli neuronów ziarnistych móżdżku. Przechowuj nośniki w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytozyna Beta-D-Arabino Furanoside
	<ol>
		<li>Rozpuścić 48 mg beta-D-arabino furanozydu cytozyny w 10 ml pożywki wzrostowej do stężenia podstawowego 20 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poli-D-lizyna
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć zapas poli-D-lizyny o stężeniu 2 mg/ml, dodaj 10 ml sterylnegoH2Odo 20 mg poli-D-lizyny. Zapas poli-D-lizyny należy przechowywać w temperaturze -80 °C w 100 μl podwielokrotności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>UWAGA: Następujące roztwory należy przygotować przed rozbioru i utrzymywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>MgSO4 Uzupełniony roztwór preparacyjny
	<ol>
		<li>Dodać 300 μl wywaruMgSO4 do 250 ml roztworu rozwarstwiającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór do rozwarstwiania trypsyny
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl trypsyny i 12 μl MgSO 4 do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór inhibitora trypsyny 1
	<ol>
		<li>Dodać 164 μl podstawowego inhibitora trypsyny, 250 μl podstawowej DNazy 1 i 12 μl podstawowego MgSO4 do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór inhibitora trypsyny 2
	<ol>
		<li>Dodać 1040 μl podstawowego inhibitora trypsyny, 750 μl podstawowej DNazy 1 i 12 μl podstawowego MgSO4 do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CaCl 2 uzupełniony roztwór preparacyjny
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl podstawowego CaCl2 i 25 μl podstawowego MgSO4 do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naczynia hodowlane pokryte poli-lizyną
	<ol>
		<li>Aby pokryć szalki hodowlane, rozcieńczyć 100 μl bulionu poliD-lizyny w 40 ml sterylnegoH2O. W przypadku szalek do hodowli Nunc o średnicy 35 mm dodaj 2 ml rozcieńczonego roztworu poli-D-lizyny. W przypadku płytek 4dołkowych dodać 300 μl rozcieńczonej poli-D-lizyny do każdej studzienki.</li>
		<li>Pozostaw poli-D-lizynę na 1 godzinę przed zasysaniem i umyciem każdej studzienki 4 ml lub 600 μl (odpowiednio dla szalek hodowlanych 35 mm lub 4 dołków) sterylnego H2O. Następnie zassaćH2Oi pozostawić naczynia do wyschnięcia na powietrzu przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja mózgu i izolacja móżdżku
<ol>
	<li>Odetnij głowę 6-7-dniowemu szczeniakowi myszy za pomocą nożyczek do dekapitacji. Wykonaj sekcję mózgu w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Aby usunąć mózg, chwyć głowę za pomocą kleszczy i przetnij skórę w kierunku przedniej części głowy za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, jak pokazano na Rysunek 1. Następnie przetnij kość czaszki za pomocą nowej pary nożyczek, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Usuń czaszkę zakrywającą mózg za pomocą kleszczy i wydłub mózg za pomocą kleszczy lub szpatułki.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby przeciąć nerw wzrokowy, aby ułatwić wydostanie mózgu jako całości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mózg w roztworze preparacyjnym, który jest uzupełnionyMgSO4. Utrzymuj roztwór i mózg na lodzie.</li>
	<li>Po usunięciu mózgu, pod mikroskopem preparacyjnym, wypreparuj móżdżek z mózgu, będąc jeszcze w roztworze preparacyjnym uzupełnionym MgSO4, i usuń opony mózgowe za pomocą cienkich kleszczy. Obróć móżdżek na jego brzuszną stronę i zapewnij usunięcie splotu naczyniówkowego.</li>
	<li>Umieść móżdżek w 35-milimetrowym naczyniu zawierającym ~ 1 ml roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego MgSO4</li>.
	<li>Pokrój tkankę na małe kawałki i przenieś do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml buforowanego roztworu preparacyjnegoMgSO4</li>.
</ol>
3. Izolacja i hodowla neuronów ziarnistości móżdżku myszy
<ol>
	<li>Odwirować probówkę o pojemności 50 ml zawierającą rozdrobnioną tkankę mózgową przez 5 minut w temperaturze 644 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad i dodać 10 ml roztworu do rozwarstwiania trypsyny. Następnie wstrząsać probówką z dużą prędkością przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 10 ml roztworu inhibitora trypsyny 1 do probówki i delikatnie kołysz przez 2 minuty.</li>
	<li>Wirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 644 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 2 ml roztworu inhibitora trypsyny 2, a następnie przenieść do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Rozcierać tkankę w probówce o pojemności 15 ml, aż roztwór stanie się mętny. Następnie odstaw na 5 minut.</li>
	<li>Usunąć klarowny supernatant i przenieść go do nowej probówki zawierającej 1 ml roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego CaCl2.</li>
	<li>Dodać kolejny ml roztworu inhibitora trypsyny 2 na dno probówki zawierającej osad z kroku 3.6. Ponownie rozetrzeć i odstawić na 5 minut. Usunąć supernatant i dodać go do probówki zawierającej supernatant z kroku 3.7 (jest to powtórzenie kroków 3.6-3.7). Powtarzaj ten proces, aż większość tkanki zostanie mechanicznie zdysocjowana.</li>
	<li>Dodać 0,3 ml roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego CaCl2 do zbioru supernatantu na każdy ml supernatantu.</li>
	<li>Wymieszać zawartość probówki, a następnie wirować przez 5 minut przy 644 x g.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad i dodać 10 ml świeżej pożywki do osadu i wymieszać.</li>
	<li>Komórki można następnie policzyć i rozcieńczyć do stężenia 1,5 x 106 komórek/ml. Należy pamiętać, że ogólnie oczekuje się, że z każdego wypreparowanego mózgu oczekuje się 10 milionów komórek, w zależności od czasu trypsynizacji i skuteczności sekcji. Ogniwa płytkowe na wcześniej wykonanych płytkach poli D-lizynowych. W przypadku płytek 4-dołkowych płytka 0,5 ml, co daje 7,5 x 105 komórek na dołek. W przypadku szalek 35 mm talerz 4 ml, co daje 6 x 106 komórek na płytkę.</li>
	<li>Po 24 godzinach dodać do płytek cytozyno-β-arabino furanozyd (AraC) w celu zmniejszenia zanieczyszczenia glejowego. Na każdy ml pożywki wymagane jest 0,5 μl z 20 mM AraC. Dodanie AraC nie wymaga zmiany nośnika. Jeśli komórki mają być utrzymywane przez 7-8 dni, powtórz ten zabieg w 3 dniu.</li>
	<li>Utrzymywać kultury w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C i karmić 100 μl 100 mM glukozy dodawanej do kultury na każde 2 ml pożywki co 2 dni po 5 dniach. Całkowita zmiana nośnika nie jest wymagana.</li>
</ol>
4. Pakowanie, oczyszczanie i miareczkowanie lentiwirusa
UWAGA: Protokół pakowania, zagęszczania, oczyszczania i miareczkowania lentiwirusa został wcześniej szczegółowo opisany bez użycia zestawu 28, w tym alternatywne metody miareczkowania, takie jak cytometria przepływowa 29. W tym miejscu pokrótce przedstawiamy protokół stosowany w naszym laboratorium do produkcji lentiwirusa do badania uszkodzeń neuronów przy użyciu szybkiego roztworu do oczyszczania wirusa i zestawu do miareczkowania lentiwirusa qPCR.
<ol>
	<li>Płytki komórek Hek293T w 10-centymetrowych szalkach hodowlanych ze zmodyfikowanym minimalnym niezbędnym podłożem (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 10% FBS. Aby uzyskać wysokie miano wirusa, należy wyhodować co najmniej 5 płytek komórek Hek293T dla każdej transfekcji. Upewnij się, że w dniu transfekcji komórki są w 70% zlewne. Zmień podłoże na trzy godziny przed transfekcją.</li>
	<li>Do każdej transfekcji przygotuj dwie probówki. Do probówki 1 dodać 1,5 ml pożywki surowicy o obniżonej zawartości MEM i 41 μl odczynnika do transfekcji, dobrze wymieszać. Do probówki 2 dodać 1,5 ml pożywki surowicy o obniżonej zawartości MEM i 6 μg plazmidu transferowego, 6 μg wektora pCMV-dR8.2 (plazmid pakujący), 3 μg wektora pCMV-VSV-G (plazmid otoczkowy) i 35 μl odczynnika wzmacniającego p3000 (dostarczanego z lipofektaminą). Dobrze wymieszaj i połącz probówki 1 i 2, wiruj i inkubuj przez 15 minut.</li>
	<li>Usuń 50% pożywki z płytek Hek293T i dodaj kompleksy DNA-lipidowe do komórek. Inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Usuń pożywkę i zastąp 5 ml świeżego DMEM, inkubuj przez noc.</li>
	<li>Po 24 godzinach od transfekcji należy pobrać pierwszą partię supernatantu wirusa z każdej płytki. Utrzymuj pożywkę wirusową w temperaturze 4 °C i dodaj 5 ml świeżej pożywki do każdej płytki komórek Hek293T. Inkubować przez noc.</li>
	<li>48 godzin po transfekcji zebrać drugą partię supernatantu wirusowego, połączyć go z pierwszą partią i odwirować połączony supernatant wirusowy przez 10 minut przy 600 x g.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant przez filtr o wielkości porów 45 μm.</li>
	<li>Oczyść wirusa za pomocą szybkiego roztworu do oczyszczania wirusów. Na każde 45 ml supernatantu wirusa dodać 5 ml roztworu wiążącego lentiwirusa, wymieszać i odwirować przez 10 minut w temperaturze >5 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant, aby nie naruszyć osadu.</li>
	<li>Dodać 20-40 μl podłoża i ponownie zawiesić osad. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Aby uzyskać miano lentiwirusa, stosuje się zestaw do miareczkowania lentiwirusowego qPCR. Rozcieńczyć 2 μl oczyszczonego wirusa w 500 μl PBS. Dodać 2 μl rozcieńczonego wirusa do 18 μl buforu do lizy wirusa (dostarczonego w zestawie).</li>
	<li>Ustaw trzy różne reakcje RT-q-PCR w trzech egzemplarzach i oznacz je jako lizat wirusa, kontrola pozytywna 1 (STD1) i kontrola pozytywna 2 (STD2). Do każdej reakcji dodaj 12,5 μl 2x qPCR MasterMix, 2,5 μl lizatu wirusowego lub STD1 (dostarczone w zestawie) lub STD2 (dostarczone w zestawie) i 10 μl mieszaniny odczynników (dostarczonych w zestawie) w probówkach PCR o pojemności 0,2 ml.</li>
	<li>Ustaw program PCR w następujący sposób: 20 minut w temperaturze 42 °C dla odwrotnej transkrypcji, 10 minut w temperaturze 95 °C dla aktywacji enzymu, 40 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C dla denaturacji i 1 minuta w temperaturze 60 °C dla wyżarzania/przedłużania.</li>
	<li>Oblicz miano wirusa za pomocą tego wzoru: 
	Miano lizatu wirusa = 5 x 107/23(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1). 
	Ctx = średnia wartość Ct nieznanej próbki, Ct1 = średnia wartość STD1, Ct2 = średnia wartość STD2, 
	UWAGA: CGN mogą być najlepiej transdukowane lentiwirusami lub zakażone adenowirusami, w zależności od badanego sposobu uszkodzenia. Dodanie lentiwirusów przy MOI 2-3 do roztworu do hodowli komórkowej w czasie posiewu stosuje się do badania sygnalizacji indukowanej NMDA w 7 dniu hodowli. Powoduje to ponad 80% transdukcji i jest odpowiednie do przeprowadzenia analiz biochemicznych tych neuronów (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Dodanie adenowirusów w 5 dniu hodowli (w MOI 50) i badanie sygnalizacji indukowanej NMDA w 7-8 dniu jest stosowane w innych technikach, takich jak obrazowanie. Zabieg ten powoduje mniej niż 10% infekcję neuronów, co czyni go idealnym do obrazowania i kolokalizacji białek. Adenowirusy mogą być używane w czasie posiewu do badania śmierci komórek wywołanej uszkodzeniem DNA przez dodanie kamptotecyny w 2-3 dniu lub stresu oksydacyjnego przez dodanie nadtlenku wodoru. Obecność białek fluorescencyjnych (GFP, RFP, CFP lub YFP) znakowanych do genu będącego przedmiotem zainteresowania może być wykorzystana do oszacowania procentowej transdukcji i potencjalnej toksyczności. Przy zalecanym MOI widzimy minimalną toksyczność i maksymalną transdukcję (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>
5. Modelowanie uszkodzeń neuronów
<ol>
	<li>Aby wywołać ekscytotoksyczność neuronalną wywołaną NMDA, po 7 dniach in vitro należy traktować CGN 100 μM NMDA i 10 μM glicyny przez 1 godzinę. Zastąp całą pożywkę kondycjonowaną pożywką z równoległych kultur bez leczenia. Stężenie to powoduje 50% śmierć komórki w ciągu 24 godzin po leczeniu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C). Fragmentacja mitochondriów jest widoczna po 6-8 godzinach od leczenia (patrz Jahani-Asl i wsp.26,27).</li>
	<li>Aby wywołać śmierć komórki indukowaną przez ROM (stres oksydacyjny), potraktuj neurony nadtlenkiem wodoru o stężeniu 75-100 μM (H2O2) i przełącz się na kondycjonowane pożywki z równoległych kultur po 5-minutowej ekspozycji naH2O2. Uwaga, ze względu na niestabilnośćH2O2, zoptymalizuj stężenie do poziomu, który indukuje 50-70% śmierć komórek w hodowli po 24 godzinach leczenia.</li>
	<li>Aby wywołać śmierć komórki wywołaną uszkodzeniem DNA, należy potraktować CGN 10 μM kamptotekiną. Stężenie to indukuje ponad 50% śmierć komórki w ciągu 24 godzin. Fragmentacja mitochondriów i wczesna sygnalizacja apoptozy zachodzi 2-3 godziny po dodaniu kamptotecyny w tym stężeniu (patrz Jahani-Asl i wsp.<klasa sup="odnośnik">18)</li>
	<li>Aby wywołać apoptozę neuronalną indukowaną niskim K+ w CGN, zmień pożywkę zawierającą 25 mM K+ na pożywkę o niskiej zawartości potasu na 5 mM K+ po 7 dniach in vitro.</li>
</ol>

<ol><li>Goldowitz, D., Hamre, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+molecules+that+make+a+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The cells and molecules that make a cerebellum.</a> Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).</li>
<li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li>
<li>Bilimoria, P. M., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultures+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cultures of cerebellar granule neurons.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li>
<li>Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+neurobiology+of+neuronal+development%3A+the+cerebellar+granule+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell.</a> Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).</li>
<li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).</li>
<li>Evans, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+signalling+in+cerebellar+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic signalling in cerebellar plasticity.</a> Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).</li>
<li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors%3A+mechanisms+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).</li>
<li>Arundine, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+calcium-dependent+neurodegeneration+in+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity.</a> Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).</li>
<li>Szydlowska, K., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+ischemia+and+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium, ischemia and excitotoxicity.</a> Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).</li>
<li>Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+joining+forces+to+thwart+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: joining forces to thwart cell death.</a> Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).</li>
<li>Rego, A. C., Oliveira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+reactive+oxygen+species+in+excitotoxicity+and+apoptosis%3A+implications+for+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).</li>
<li>Wei, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+BAX+and+BAK%3A+a+requisite+gateway+to+mitochondrial+dysfunction+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death.</a> Science. 292 (5517), 727-730 (2001).</li>
<li>Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).</li>
<li>Coyle, J. T., Puttfarcken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+glutamate%2C+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders.</a> Science. 262 (5134), 689-695 (1993).</li>
<li>Cole, K., Perez-Polo, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+trauma+model%3A+in+search+of+Thanatos%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal trauma model: in search of Thanatos.</a> Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).</li>
<li>Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death.</a> Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+protects+cerebellar+granule+neurons+against+injury-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death.</a> J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).</li>
<li>Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+depolarization+in+the+survival+and+differentiation+of+cerebellar+granule+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture.</a> J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).</li>
<li>Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+deletion+further+orders+the+cell+death+pathway+in+cerebellar+granule+cells+and+suggests+a+caspase-independent+pathway+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death.</a> J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).</li>
<li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium%2Fserum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li>
<li>Piccioli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activation+induces+apoptosis+in+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells.</a> J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).</li>
<li>D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+in+cerebellar+granule+neurons+by+low+potassium%3A+inhibition+of+death+by+insulin-like+growth+factor+I+and+cAMP%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).</li>
<li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).</li>
<li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK5+phosphorylates+DRP1+and+drives+mitochondrial+defects+in+NMDA-induced+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death.</a> Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+inner+membrane+GTPase%2C+optic+atrophy+1+%28Opa1%29%2C+restores+mitochondrial+morphology+and+promotes+neuronal+survival+following+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity.</a> J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. (32), (2009).</li>
<li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li>
<li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych móżdżku (CGN), badań nad utratą i zyskiem funkcji oraz modelowania różnych mechanizmów śmierci komórki. Na odtwarzalność wyników przy użyciu tej procedury wpływa kilka czynników, które wymagają ścisłego monitorowania. Należą do nich czystość hodowli, w tym eliminacja komórek glejowych w hodowli, zbieg kultury i utrzymanie zdrowych komórek. Wprowadzenie zmienności tych czynników może zniekształcić wyniki i podważyć odtwarzalność. Pon...

Neurony ziarniste móżdżku (CGN) są dobrze scharakteryzowane w kulturze i posłużyły jako skuteczny model do badania śmierci i rozwoju neuronów 1,2,3,4,5,6. Wczesna ekspresja receptorów N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) w hodowlach CGN in vitro czyni je atrakcyjnym modelem do badania sygnalizacji indukowanej przez NMDA. Aktywacja tych receptorów za pomocą NMDA w połączeniu z depolaryzacją błony jest wykorzystywana do modelowania fizjologicznej stymulacji aktywności neuronalnej i pozwoliła na badania nad mechanizmami plastyczności synaptycznej 7,8. Wręcz przeciwnie, nadmierna stymulacja tych receptorów przez ligand NMDA może być wykorzystana do modelowania ekscytotoksyczności, głównego mechanizmu utraty neuronów w ostrym uszkodzeniu mózgu i chorobach neurodegeneracyjnych 9. Jednym z mechanizmów indukcji ekscytotoksyczności jest głód ATP ze zmniejszoną ilością tlenu, co obserwuje się w przypadku ostrego uszkodzenia neuronów. Powoduje to depolaryzację błony i podwyższony poziom uwalniania glutaminianu w synapsie. Późniejsza nadmierna stymulacja receptora NMDA przez podwyższony poziom glutaminianu powoduje nadmierny napływ Ca2 + przez te receptory, co z kolei aktywuje kilka szlaków, w tym proteazy aktywowane przez Ca2 +, fosfolipazy i endonukleazy, co skutkuje niekontrolowaną degradacją krytycznych składników komórkowych i śmiercią komórki. Dodatkowo, wysoki wewnątrzkomórkowy Ca2+ prowadzi do generowania wolnych rodników tlenowych i uszkodzeń mitochondriów 10,11.
Chociaż większość utraty neuronów w wyniku ekscytotoksyczności neuronalnej wywołanej przez NMDA jest spowodowana napływem wapnia i jest niezależna od Bax/Bak, inne mechanizmy śmierci komórki nie mogą być wyłączone z tego modelu. Pojawienie się zarówno nekrotycznej, jak i apoptotycznej śmierci komórek z powodu ekscytotoksyczności jest częściowo spowodowane wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (ROS) i uszkodzeniem DNA spowodowanym wysokimi wewnątrzkomórkowymi poziomami Ca2+ 12. Uszkodzenie DNA powoduje śmierć neuronów poprzez mechanizmy apoptotyczne, co jest skorelowane z cechami charakterystycznymi apoptotycznej śmierci komórki, takimi jak pojawienie się mas chromatyny i ciał apoptotycznych. Indukcja apoptozy odbywa się za pośrednictwem uwalniania cytochromu c z mitochondriów i wykazano, że jest zależna od oligomeryzacji Bax/Bak 13. Oligomeryzacja Bax/Bak sprzyja tworzeniu się porów w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, powodując uwalnianie cytochromu c i aktywację regulatorów proapoptotycznych, co widać w przypadku łagodnego uszkodzenia niedokrwiennego <klasa sup = "xref">14.
Generowanie ROS jest poważnym problemem w mózgu ze względu na niski endogenny poziom przeciwutleniaczy, w połączeniu z dużym zapotrzebowaniem na tlen dla funkcjonowania neuronów 15. Pod wpływem zdarzenia niedokrwiennego syntaza tlenku azotu jest regulowana w górę, wytwarzając tlenek azotu i zwiększając reaktywne formy tlenu 14. Zwiększone stężenie rodników tlenowych może skutkować uszkodzeniem DNA i pośrednio powodować głód energii. Wysoki poziom dwuniciowych pęknięć DNA jest korygowany przez aktywację polimerazy poli ADP-rybozy-1 (PARP-1), białka związanego z chromatyną eukariotyczną odpowiedzialnego za katalizowanie transferu jednostek ADP-rybozy z NAD+, proces integralny z naprawą DNA 16. Jednak przy nadmiernych uszkodzeniach spowodowanych stresem oksydacyjnym, aktywacja PARP-1 może powodować głód energii z powodu zwiększonego drenażu NAD +, niezbędnego substratu do produkcji ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. Ostatecznie stres oksydacyjny wywoła apoptozę w sposób zależny od Bax/Bak, prowadząc do uwolnienia mitochondrialnego cytochromu c i wykazano, że indukuje przebudowę mitochondriów w CGN 17.
Na koniec, zmiany stężenia chlorku potasu (KCl) w kulturach CGN mogą być wykorzystane do modelowania apoptozy za pośrednictwem niskiego poziomu potasu/depolaryzacji 18,19,20. Pod wpływem niskich poziomów K+, CGN ulegają wyraźnym zmianom fizjologicznym, co skutkuje zmniejszeniem zarówno oddychania mitochondrialnego, jak i glikolizy, przypisywanym zmniejszonemu zapotrzebowaniu komórkowemu 21, a także zmniejszeniu poziomu czynnika jądrowego-κB (NFκB), który reguluje działania, w tym stan zapalny i transmisję synaptyczną 22. Model ten jest szczególnie interesujący dla badań nad śmiercią komórki podczas rozwoju neuronów. Środowisko o niskim współczynniku K+ bardziej przypomina warunki fizjologiczne i powoduje oznaki śmierci komórki widoczne podczas rozwoju neuronów 23.
Podsumowując, CGN-y dostarczają długotrwałego modelu do badania leżących u podstaw molekularnych mechanizmów śmierci i degeneracji neuronów. Poniższy protokół pozwoli na izolację i hodowlę CGN, ekspresję lub represję określonego szlaku genetycznego za pomocą wirusów oraz indukcję śmierci neuronów poprzez różne mechanizmy reprezentujące uszkodzenie i zwyrodnienie neuronów.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do miareczkowania qPCR lentivitral kit&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV900</td><td></td></tr><tr><td>szybkie rozwiązanie do oczyszczania wirusów&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV999</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VS.VG</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#15230162</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#25030081</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynia do kultur Nunc</td><td>Gibco</td><td>#174913</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR green master mix</td><td>life technologies</td><td>#A25742</td><td></td></tr><tr><td>BSA V Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A-8412</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-7902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-9911</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny białka jaja kurzego&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna beta-D-Arabino Furanozyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-1768</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-7528</td><td></td></tr><tr><td>DNase1&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Eagle-minimal essential medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2279</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-5417</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie dializowana płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#F-0392</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Hepes&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#H-0887</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#216763</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Gentamycyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-1397</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-metylo-D-asparaginowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-3262</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T-4549</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>P3000 odczynnik wzmacniający</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana surowica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>#CABDH9258 <tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>#CABDH9286 <tr><td>NaH2PO4H2O&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>#CABDH9298 <tr><td>Poly D-lizyna&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#89134-858</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Żubr</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Żubr</td><td>#080-450</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Neurony ziarniste móżdżku (CGN) są powszechnie używanym modelem neuronalnym, tworzącym obfitą, jednorodną populację w móżdżku. W świetle ich rozwoju pourodzeniowego, obfitości i dostępności, CGN są idealnym modelem do badania procesów neuronalnych, w tym rozwoju neuronów, migracji neuronów i stymulacji fizjologicznej aktywności neuronalnej. Ponadto hodowle CGN stanowią doskonały model do badania różnych sposobów śmierci komórki, w tym ekscytotoksyczności i apoptozy. W ciągu tygodnia w hodowli CGN wyrażają receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDA), specyficzny jonotropowy receptor glutaminianu o wielu krytycznych funkcjach w zdrowiu i chorobie neuronów. Dodanie niskich stężeń NMDA w połączeniu z depolaryzacją błony do pierwotnych kultur CGN gryzoni zostało wykorzystane do modelowania fizjologicznej stymulacji aktywności neuronalnej, podczas gdy dodanie wysokich stężeń NMDA można zastosować do modelowania ekscytotoksycznego uszkodzenia neuronów. Opisano tu metodę izolacji i hodowli CGN od 6-dniowych szczeniąt, a także manipulację genetyczną CGN przez adenowirusy i lentiwirusy. Przedstawiamy również zoptymalizowane protokoły dotyczące stymulowania ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA, apoptozy wywołanej niskim poziomem potasu, stresu oksydacyjnego i uszkodzenia DNA po transdukcji tych neuronów.

Dzięki starannej sekcji nienaruszony mózg powinien zostać usunięty przy minimalnych uszkodzeniach, jak pokazano na Rysunku 1A-B. Należy dołożyć wszelkich starań, aby zminimalizować uszkodzenia mózgu podczas usuwania, w szczególności uszkodzenia móżdżku. Uszkodzenie móżdżku utrudnia identyfikację i całkowite usunięcie opon mózgowych oraz zwiększa prawdopodobieństwo kontaminacji hodowli neuronalnej. Po usunięciu opon mózgowych móżdżek można wyc...

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie zdrowych, czystych populacji neuronów ziarnistych móżdżku, ich manipulacja genetyczna oraz modelowanie różnych mechanizmów uszkodzeń neuronów w pierwotnej kulturze in vitro. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie uszkodzeń neuronów. Stosujemy ten protokół do badania podstawowych mechanizmów molekularnych uszkodzeń neurologicznych następujących po ostrym uszkodzeniu mózgu oraz w chorobach neurodegeneracyjnych.Główną zaletą niniejszego protokołu jest możliwość modelowania różnych mechanizmów śmierci komórkowej, takich jak ekscytotoksyczność, stres oksydacyjny, uszkodzenia DNA oraz zdarzenia rozwojowe, przy użyciu tego systemu hodowli. Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o uszkodzeniach neuronów, może być ona również stosowana w przypadku neuronów móżdżku szczura do badania aktywności neuronalnej i morfogenezy w odpowiedzi na czynniki wzrostu oraz zdarzenia poboczne. Aby wyekstrahować mózg myszy w wieku od sześciu do siedmiu dni, należy użyć pęsety do uchwycenia głowy, a następnie za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych naciąć skórę w kierunku przednim w stronę głowy.Odsunąć skórę, aby odsłonić czaszkę. Następnie przebić czaszkę końcem nożyczek i przeciąć ją w kierunku przednim oraz bocznym. Uważając, aby nie uszkodzić móżdżku i ułatwiając identyfikację oraz usunięcie opon mózgowych, użyć pęsety do odchylenia czaszki w celu odsłonięcia mózgu.Za pomocą pęsety lub szpatułki delikatnie wyjmij mózg do schłodzonego roztworu sekcyjnego. Aby wyizolować móżdżek, umieść mózg w roztworze sekcyjnym uzupełnionym o siarczan magnezu i trzymaj roztwór oraz mózg na lodzie. Pod mikroskopem sekcyjnym usuń opony mózgowe za pomocą precyzyjnej pęsety, a następnie wypreparuj móżdżek z mózgu w roztworze sekcyjnym uzupełnionym o siarczan magnezu.Ułatwia to oddzielenie pozostałych opon mózgowych i umożliwia przedostanie się między warstwy w celu oczyszczenia zakładów móżdżku. Obecność opon w kulturze neuronów prowadzi do powstania niezdrowych komórek i ich ostatecznej śmierci. W związku z tym przed przystąpieniem do hodowli ważne jest zapewnienie całkowitego usunięcia opon mózgowych.Następnie odwróć móżdżek stroną brzuszną i upewnij się, że splot naczyniowy został usunięty. Potem przełóż móżdżki do naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego jeden mililitr roztworu do sekcji z dodatkiem siarczanu magnezu. Posiekaj tkanki na małe kawałki i przelej je do probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 30 mililitrów buforowanego roztworu do sekcji z siarczanem magnezu.Na tym etapie należy odwirować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą posiekaną tkankę mózgu przez pięć minut przy 644 ×g i temperaturze 4 °C. Następnie należy usunąć nadsącz i dodać 10 ml roztworu trypsyny do dysekcji. Po tym wstrząsać na wytrząsarce z wysoką prędkością przez 15 minut w temperaturze 37 °C.Do probówki dodaj 2 ml roztworu inhibitora trypsyny nr 1 i delikatnie mieszaj przez 2 minuty. Następnie wiruj probówkę przez 5 minut przy 644 ×g w temperaturze 4 °C. Po 5 minutach odlej supernatant, dodaj 2 ml roztworu inhibitora trypsyny nr 2, a następnie przenieś zawartość do probówki o pojemności 15 ml.Następnie utrzeć tkankę w probówce o pojemności 15 ml, aż roztwór stanie się mętny. Pozostawić do odstania przez pięć minut. Następnie usunąć klarowny supernatant i przenieść go do nowej probówki zawierającej 1 ml roztworu do sekcji uzupełnionego o chlorek wapnia.Dodaj kolejne 2 ml roztworu inhibitora trypsyny dwa na dno probówki zawierającej osad. Ponownie go utrzyturuj i pozostaw na pięć minut do sedymentacji. Odlej supernatant i dodaj go do probówki zawierającej supernatant z poprzedniego kroku.Powtarzaj ten proces, aż większość tkanki zostanie rozdzielona mechanicznie. Do zebranego nadsączu dodaj 0,3 mililitra roztworu do sekcji z dodatkiem chlorku wapnia na każdy mililitr nadsączu. Wymieszaj zawartość probówki, a następnie wiruj przez pięć minut przy 644 ×g w temperaturze pokojowej.Następnie usuń supernatant. Do osadu dodaj 10 ml świeżej pożywki i wymieszaj. Następnie policz żywe komórki i rozcieńcz je do stężenia 1,5 × 10⁶ komórek na ml.Wysiej komórki na wcześniej przygotowane płytki z poli-D-lizyną. W przypadku płytek czterodołkowych wysiej 0,5 ml próbki, co zapewni 7,5 × 10⁵ komórek na dołek. W przypadku naczyń 35 mm wysiej 4 ml próbki, co zapewni 6 × 10⁶ komórek na naczynie.W przypadku szkiełek podstawkowych, nanieś 0,5 ml zawiesiny, co daje 7,5 × 10⁵ komórek na dołek. Po 24 godzinach dodaj do płytek AraC w celu zmniejszenia kontaminacji komórkami glejowymi. Jeśli komórki mają być utrzymywane przez siedem do ośmiu dni, powtórz tę procedurę w trzeciej dobie i inkubuj hodowle w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.W przypadku kultur utrzymywanych przez więcej niż pięć dni, od piątego dnia należy dostarczać do kultury glukozę co dwa dni. Aby wywołać ekscytotoksyczność neuronalną za pomocą NMDA, po siedmiu dniach in vitro, należy potraktować neurony ziarniste móżdżku 100 µM NMDA i 10 µM glicyny przez jedną godzinę. Następnie należy wymienić medium na medium warunkujące z równoległych kultur niepoddanych działaniu czynnika.Stężenie to powoduje śmierć 50% komórek w 24 godzinach po zastosowaniu preparatu. Aby wywołać śmierć komórek indukowaną przez ROS, należy traktować neurony nadtlenkiem wodoru w stężeniu od 75 do 100 µM przez pięć minut. Po pięciu minutach należy zmienić medium na medium warunkowane z hodowli równoległych.Ze względu na niestabilność nadtlenku wodoru, jego stężenie musi zostać zoptymalizowane do poziomu wywołującego od 50 do 70% śmierci komórek po 24 godzinach. Stężenie to zazwyczaj mieści się w przedziale od 75 do 100 micromolar. Aby wywołać śmierć komórek poprzez uszkodzenie DNA, należy potraktować neurony ziarniste móżdżku 10 micromolar kamptotecyną, co indukuje śmierć ponad 50% komórek w ciągu 24 godzin.W celu indukowania apoptozy neuronalnej indukowanej niskim poziomem potasu w neuronach ziarnistych móżdżku, po siedmiu dniach in vitro należy zmienić medium zawierające 25 millimolar potassium na medium z niską zawartością potasu o stężeniu five millimolar potassium. Neurony zostały transdukowane lentiwirusem dla RFP przy MOI wynoszącym trzy w momencie wysiewania. Utrwalenie i barwienie przeprowadzono w siódmym dniu in vitro.Współkolokalizacja sygnału RFP, MAP2 oraz Hoechst została przedstawiona w celu wykazania zdrowych neuronów w pełni transdukowanych przez lentiwirusy. Przedstawione tutaj obrazy reprezentują analizy testu żywotności (live-dead assay) neuronów zainfekowanych adenowirusami o różnych wartościach MOI w celu pomiaru toksyczności. Neurony ziarniste móżdżku zainfekowane adenowirusami wykazującymi ekspresję LacZ przy MOI w zakresie od 25 do 50 pozwalają na osiągnięcie maksymalnej wydajności przy zachowaniu minimalnej toksyczności.Przy infekcji z zastosowaniem tej MOI obserwuje się różnicę w przeżywalności komórek mniejszą niż 1% w porównaniu z grupą kontrolną. Ryciny te przedstawiają barwienie Hoechstem kontrolnych neuronów ziarnistych móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku poddanych działaniu NMDA w celu indukowania śmierci komórek. Zwróć uwagę na powstawanie jąder piknotycznych po zastosowaniu NMDA.Jest to oznaka śmierci komórek, którą można zaobserwować w około 50% kultury 24 godziny po zastosowaniu 100 µM NMDA oraz 10 µM glicyny. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w dwie i pół godziny dla sześciu preparatów z myszy, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest stosowanie zasad aseptyki oraz sterylizowanych narzędzi chirurgicznych, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji kultury.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do studiowania rozwoju oraz uszkodzeń neuronów w pierwotnych kulturach neuronów mysich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie hodować neurony ziarniste móżdżku, manipulować nimi genetycznie przy użyciu wirusów oraz indukować różne mechanizmy uszkodzeń neuronów. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunofluorescencja lub testy żywotności komórek, aby odpowiedzieć na pytania, na przykład czy interesujący nas gen zwiększa przeżywalność komórek w odpowiedzi na ekscytotoksyczność, stres oksydacyjny lub uszkodzenia DNA.

modeling-neuronal-death-degeneration-mouse-primary-cerebellar-granule

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli progenitorowych komórek ziarnistych neuronów móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku z myszy w okresie postnatalnym. <br...

Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku myszy. Komórki są traktowane antymetabolitem w celu wyeliminowania proliferujących komórek glejowych i wytworzenia czystej kultury neuronów ziarnistych móżdżku.

Izolacja i hodowla pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku myszy

Ten film demonstruje generowanie modelu uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy. Przedstawiono w nim etapy związane z indukcją uszkodzenia neuronów za pomocą NMDA, agonisty receptora neuroprzekaźnika pobudzającego i glicyny, koagonisty. NMDA i glicyna wiążą się ze specyficznymi receptorami neuronalnymi, powodując ich nadmierną stymulację i powodując masowy wewnątrzkomórkowy napływ wapnia, co prowadzi do uszkodzenia i śmierci komórek neuronalnych.

Modelowanie uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Ten film przedstawia generowanie modelu uszkodzenia neuronów przy użyciu reaktywnych form tlenu (ROS) w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy. Szczegółowo opisuje proces wywoływania stresu oksydacyjnego poprzez dodawanie wysokich stężeń nadtlenku wodoru. Narażenie na ROS powoduje pęknięcia nici DNA i niestabilność genomu. Dodatkowo utlenianie białek komórkowych upośledza ich funkcje, podczas gdy peroksydacja lipidów narusza integralność błony. Ta kaskada prowadzi do uwalniania...

Modelowanie śmierci neuronalnej wywołanej reaktywnymi gatunkami tlenu w neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Źródło: Chan, U., et al., wykorzystując elektroporację poporodową in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistości móżdżku i rozwoju synaps.J. Vis. Exp. (2021).Ten film przedstawia analizę rozwoju neuronów ziarnistości móżdżku poprzez obrazowanie wstępnie ustalonych wycinków tkanki mózgowej od myszy znakowanych białkiem fluorescencyjnym, Przechwytywanie obrazów stosu Z o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopu konfokalnego i pomiar parametrów strukturalnych, w tym długości neurytów,...

Wizualizacja synaptogenezy neuronów ziarnistych móżdżku na różnych etapach rozwoju

Morfogeneza i migracja neuronów są kluczowymi wydarzeniami leżącymi u podstaw prawidłowego rozwoju mózgu. W tym miejscu opisujemy metody genetycznej manipulacji hodowanymi neuronami ziarnistymi móżdżku i rozwijającym się móżdżkiem w celu oceny morfologii i cech migracyjnych neuronów.

Manipulacja genetyczna neuronów ziarnistych móżdżku in vitro i in vivo w celu zbadania morfologii i migracji neuronów

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Ten protokół opisuje, jak dokładnie mierzyć żywotność neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny (FDA) i jodku propidyny (PI) w hodowanych ziarnistych neuronach móżdżku, pierwotnej hodowli neuronalnej używanej jako model in vitro w badaniach neurologicznych i neurofarmakologicznych.

Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji synaptogenezy ziarnistych neuronów w móżdżku myszy w trakcie poporodowego rozwoju mózgu, kiedy te komórki udoskonalają swoje struktury synaptyczne i tworzą synapsy, aby zintegrować się z ogólnym obwodem mózgu.

Wykorzystanie elektroporacji poporodowej in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistych móżdżku i rozwoju synaps

Poznaj metodę izolacji pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku myszy do modelowania śmierci komórkowej, stresu oksydacyjnego i uszkodzeń DNA w badaniach neurobiologicznych.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Przeglądaj więcej filmów