Name: Indukcja i diagnostyka nowotworów w nabłonku dysku wyobrażeniowego Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę indukcji nowotworów w nabłonku wyobrażeniowym Drosophila za pomocą systemu GAL4-UAS. Technika umożliwia klasyfikację zmian nowotworowych i badanie dynamiki rozwoju raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy J. Vaughenowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te zostały wsparte grantami z JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 oraz grantem badawczym Fundacji Nauki Takeda dla Y.T.

1. Krzyżówki muchowe i indukcja klonów
<ol>
	<li>Usuń wszystkie muchy z fiolki na 12 godzin przed zebraniem much pierwotnych.</li>
	<li>Znieczulić muchy w fiolce, wstrzykując gaz CO2 i umieścić muchy na podkładce na muchy CO2 .</li>
	<li>Przenieść 10-20 dziewiczych samic i 10 samców z podkładki na muchy CO2 do świeżej fiolki i inkubować przez 1 dzień w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Przenieść te muchy do świeżej fiolki i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 25 °C. 
	UWAGA: Pierwszą fiolkę należy wyrzucić, ponieważ dziewicze samice nie składają wystarczającej ilości jaj w ciągu pierwszego dnia.</li>
	<li>W przypadku linii enhancer-GAL4 należy usunąć dorosłe muchy i inkubować fiolkę w temperaturze 25 °C aż do rozwarstwienia.</li>
	<li>W celu indukcji klonów mozaiki metodą flip-out-GAL4 należy usunąć dorosłe muchy i inkubować fiolkę przez 2-4 dni w temperaturze 25 °C. Czas inkubacji przed szokiem cieplnym zależy od celu doświadczalnego. Szok cieplny 2 dni po złożeniu jaj (AED) generuje mozaikowe klony w niedojrzałym nabłonku imaginalnym drugiego stadium rozwojowego. Szok cieplny po 3 lub 4 dniach AED generuje mozaikowe klony w zróżnicowanym nabłonku imaginalnym od wczesnego do środkowego stadium rozwoju. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zbadać wpływ zmienionego czasu szoku cieplnego na fenotypy rakotwórcze.</li>
	<li>W celu indukcji klonów mozaiki metodą flip-out-GAL4, należy poddać fiolkę szokowi termicznemu przez zanurzenie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 - 45 minut, a następnie inkubować przez 2 - 3 dni w temperaturze 25 °C. 
	UWAGA: Informacje o czasie szoku cieplnego, czasie i czasie inkubacji w każdym eksperymencie są pokazane w legendach rysunków.</li>
</ol>
2. Sekcja larw
<ol>
	<li>Zebrać wędrujące larwy trzeciego stadium za pomocą drewnianego patyczka lub kleszczy, genotypować je za pomocą odpowiednich markerów fluorescencyjnych (np. EGFP) pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i umieścić w naczyniu separacyjnym z PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).</li>
	<li>Przemyć larwy w PBS, pipetując za pomocą plastikowych pipet transferowych o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Ściśnij środek larwy jednym kleszczem i rozerwij ciało na pół drugimi kleszczami.</li>
	<li>Ściśnij haczyk na usta przedniej połowy jednym kleszczem i popchnij usta w kierunku ciała drugimi kleszczami, aby wywrócić ciało na lewą stronę.</li>
	<li>Usuń zbędne materiały, takie jak gruczoły ślinowe lub ciała tłuszczowe za pomocą kleszczy.</li>
</ol>
3. Utrwalenie i barwienie przeciwciał
<ol>
	<li>Przenieś wypreparowaną przednią połowę ciała larwy (w tym wyimaginowane krążki skrzydeł) do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml i umieść w 1 ml roztworu Fix (4% formaldehydu w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z delikatnym obracaniem. 
	UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i ma potencjał rakotwórczy. Nosić rękawice i odzież ochronną, aby zapobiec kontaktowi ze skórą. 
	UWAGA: W tej części wszystkie kroki odbywają się na nutatorze w temperaturze pokojowej w ciemności, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
	<li>Usuń roztwór Fix i wyrzuć. Umyj chusteczki 1 ml PBT (0,3% Triton X-100 w PBS) trzy razy przez 15 minut każda.</li>
	<li>Usunąć PBT i dodać 1 ml PBTG (0,2% albuminy surowicy bydlęcej i 5% normalnej surowicy koziej w PBT) w celu zablokowania i nutacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć PBTG i dodać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała odpowiednio rozcieńczony PBTG (patrz tabela materiałów) i nutować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć tkanki 1 ml PBT trzy razy przez 15 minut każda.</li>
	<li>Usunąć PBT i dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała odpowiednio rozcieńczony PBTG (1:400). Nutować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć tkanki 1 ml PBT dwa razy przez 15 minut każda.</li>
	<li>Aby zabarwić F-aktynę, usuń PBT i dodaj roztwór falloidyny odpowiednio rozcieńczony w PBS (1:40). Następnie nutuj przez 20 min. Usuń roztwór falloidyny i przemyj tkanki 1 ml PBT dwa razy przez 15 minut każda.</li>
	<li>Aby przeciwdziałać barwieniu jądrowego DNA, usuń PBT i dodaj roztwór DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindolowy) (0,5 μg/ml DAPI w PBS). Następnie nutować 10 min. 
	UWAGA: DAPI ma potencjał rakotwórczy. Nosić rękawice i odzież ochronną, aby zapobiec kontaktowi ze skórą.</li>
	<li>Usuń roztwór DAPI i przemyj chusteczki 1 ml PBT dwa razy przez 15 minut każda.</li>
	<li>Płukać raz w 1 ml PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć PBS i dodać 500 μl 100 % glicerolu jako pożywkę do wstępnego montażu.</li>
</ol>
4. Montaż na szkiełkach mikroskopowych
<ol>
	<li>Umieść poplamione tkanki na szkiełku mikroskopowym za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Przenieś tkanki do kropli podłoża montażowego na innym szkiełku mikroskopowym za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przytrzymaj koniec wypreparowanej tkanki jednym kleszczem, a drugimi odciągnij krążki czułków mózgowych i ocznych. 
	UWAGA: Trzymaj wypreparowane mózgi, aby umieścić je w pobliżu wyimaginowanych dysków skrzydeł. Mózg działa jak platforma, która zapobiega zmiażdżeniu przez szkiełko nakrywkowe wyimaginowanych dysków skrzydłowych.</li>
	<li>Aby wyizolować wyimaginowane dyski skrzydła, przytrzymaj koniec wypreparowanej tkanki jednym kleszczem i delikatnie podrap ścianę ciała, a drugą kleszczami oderwij krążki. 
	UWAGA: Jeśli trudno jest znaleźć dyski imaginalne skrzydeł, oderwij tchawicę od tylnej do przedniej strony. Dyski imaginalne skrzydeł przyklejają się do tchawicy.</li>
	<li>Delikatnie przykryć wyimaginowane krążki szkiełkiem nakrywkowym i zapieczętować lakierem do paznokci; przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Aby uzyskać obrazy konfokalne za pomocą mikroskopu konfokalnego, ustaw parametry akwizycji obrazu, w tym zakres długości fali emisji, intensywność lasera, wzmocnienie, przesunięcie, prędkość skanowania i rozmiar obrazu 24. 
	UWAGA: Szczegółową procedurę ustawień akwizycji obrazu można znaleźć w instrukcji obsługi dostarczonej przez każdego producenta mikroskopu.</li>
	<li>Aby uchwycić pojedyncze sekcje konfokalne całego wyimaginowanego dysku skrzydła, użyj soczewki obiektywowej 20X.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy trójwymiarowe poprzez skanowanie z-stack w kroku 0,5 - 1,0 μm przy użyciu obiektywów 40X lub 60X. 
	UWAGA: Aby analizować fenotypy komórkowe w wysokiej rozdzielczości, rozmiar obrazu powinien być większy niż 512 x 512 pikseli.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu za pomocą ImageJ
<ol>
	<li>Użyj Fiji, oprogramowania ImageJ o otwartym kodzie źródłowym skoncentrowanego na analizie obrazu biologicznego (https://fiji.sc/) 25, aby uzyskać i przeanalizować obrazy konfokalne z-stack.</li>
	<li>Aby uzyskać sekcje pionowe, otwórz obrazy stosu z w ImageJ i wybierz pozycję menu "Obraz/Stosy/Ponowne poslicenie." 
	UWAGA: Oś X-Z lub oś Y-Z można wybrać w menu Reslice. Przekrój pionowy można uzyskać również w dowolnym kierunku, rysując linię prostą lub prostokąt na obrazie z-stack</li>.
</ol>
7. Diagnoza fenotypów nowotworowych
<ol>
	<li>Otwórz pionowe sekcje (oś X-Z lub Y-Z) uzyskane z jednego zestawu obrazów z-stack i przeanalizuj fenotypy morfologiczne oraz barwienie przeciwciał.</li>
	<li>W diagnostyce fenotypów nowotworów należy skupić się głównie na następujących trzech punktach: (1) jeśli masa komórkowa, w tym klony knockdown, odbiega od głównej warstwy nabłonka, (2) jeśli subkomórkowa lokalizacja białek połączeniowych jest zmieniona w tej masie komórkowej i (3) jeśli średnica tej masy komórkowej jest większa niż 4 komórki.</li>
	<li>Kategoryzuj fenotypy nowotworów zgodnie ze schematem blokowym opisanym w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10647931">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li>
<li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li>
<li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+proliferation+control%3A+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li>
<li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+alterations+in+carcinoma%3A+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li>
<li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger%2FTNF+signaling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li>
<li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Lgl+and+Mahjong%2FVprBP+in+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422(2010).</li>
<li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li>
<li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li>
<li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li>
<li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots%2C+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537(2016).</li>
<li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li>
<li>Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li>
<li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li>
<li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li>
<li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li>
<li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC%3A+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+6%2C300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li>
<li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li>
<li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc%2C+Yorkie%2C+Wingless+and+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li>
<li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li>
<li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li>
<li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+design%3A+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li>
<li>Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li>
<li>Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li>
<li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

System GAL4-UAS jest jednym z najpotężniejszych narzędzi genetycznych do ukierunkowanej ekspresji genów u Drosophila 26 i znacznie ułatwia indukcję i analizę komórek nowotworowych in vivo4. System ten umożliwia generowanie klonów z nokautem genów supresorowych nowotworów lub nadekspresją onkogenów w tkance nabłonkowej typu dzikiego, co jest sytuacją bardzo podobną do początkowych stadiów raka u ludzi, gdzie przekształcone komórki pronowotworowe są otoczone...

Tkanki nabłonkowe to wysoce zorganizowane systemy, które mają niezwykłą zdolność homeostazy do utrzymywania swojej organizacji poprzez rozwój i obrót komórek. Ten solidny, samoorganizujący się system jest jednak stopniowo zakłócany podczas rozwoju guza. Na początku rozwoju nowotworu w warstwie nabłonka pojawiają się pojedyncze zmutowane komórki powstające w wyniku aktywacji onkogenu lub inaktywacji genu supresorowego nowotworu. Kiedy ta przekształcona "komórka pronowotworowa" unika środowiska tłumiącego, zakłóca organizację nabłonka i rozpoczyna niekontrolowaną proliferację, następuje nowotworzenie 1. W ciągu ostatnich kilku dekad wybitny postęp technologiczny w genetyce i biologii molekularnej poczynił niezwykłe postępy w badaniach nad rakiem. W szczególności ostatnie badania z wykorzystaniem narzędzi do analizy mozaiki genetycznej u Drosophila melanogaster, takich jak FLP-FRT (rekombinaza flippazy/cel rekombinazy flippazy) rekombinacja mitotyczna 2 i flip-out-GAL4-UAS (upstream activating sequence) 3, znacznie przyczyniły się do lepszego zrozumienia mechanizmów genetycznych zaangażowanych w powstawanie i przerzuty nowotworów 4,5,6.
Badania grupy konserwatywnych genów supresorowych nowotworów Drosophila, lethal giant larvae (lgl), discs large (dlg) i scribble (scrib), podkreśliły krytyczny związek między utratą organizacji nabłonka a rozwojem nowotworu, ponieważ te geny odgrywają kluczową rolę w regulacji polaryzacji komórek wierzchołkowo-podstawnych i proliferacji komórek w tkankach nabłonkowych 7. Podczas gdy wyimaginowane krążki Drosophila są zwykle nabłonkiem jednowarstwowym, homozygotyczne mutacje w którymkolwiek z tych trzech genów powodują, że komórki tracą strukturę i polarność, nie różnicują się, nadmiernie się namnażają i ostatecznie tworzą wielowarstwowe amorficzne masy, które łączą się z sąsiednimi tkankami 7. Podobnie, zaburzenie tych genów u ssaków jest zaangażowane w rozwój nowotworów złośliwych 8,9. Fenotypy nowotworowe wykazywane przez zmutowane tkanki doprowadziły do sklasyfikowania tych trzech genów jako konserwatywnych, nowotworowych genów supresorowych nowotworów (nTSG) 7,8. Jednakże, gdy homozygotyczne zmutowane komórki nTSG są sporadycznie generowane w rozwijających się dyskach imaginalnych typu dzikiego przy użyciu rekombinacji mitotycznej za pośrednictwem FLP-FRT, zmutowane komórki są eliminowane z tkanki przez apoptozę zależną od kinazy N-końcowej c-Jun (JNK) 10,11,12,13,14, ekstruzja 15,16, czyli pochłonięcie i fagocytoza przez sąsiadów 17. W tym genetycznie mozaikowym nabłonku apoptoza jest najczęściej wykrywana w zmutowanych komórkach nTSG znajdujących się na granicy klonu, co sugeruje, że sąsiednie normalne komórki wywołują apoptozę zmutowanych komórek nTSG 10,11,12,18. Ostatnie badania na komórkach ssaków potwierdziły, że ta zależna od konkurencji komórkowej eliminacja komórek pronowotworowych jest ewolucyjnie zachowanym nabłonkowym mechanizmem samoobrony przed rakiem 19,20,21,22,23.
Niedawne badanie na dyskach wyobrażonych Drosophila wykazało jednak, że mozaikowe klony nTSG-knockdown indukują guzy nowotworowe w określonych obszarach dysków imaginalnych skrzydeł 16. Początkowe tworzenie się guza zawsze znajdowało się w obwodowym obszarze "zawiasowym" i nigdy nie obserwowano w centralnym obszarze "torebki" nabłonka dysku skrzydła, co sugeruje, że potencjał rakotwórczy komórek nokautujących nTSG zależy od lokalnego środowiska. Centralny obszar torebki funkcjonuje jako "zimny punkt guza", w którym komórki pronowotworowe nie wykazują dysplastycznego przerostu, podczas gdy obwodowy obszar zawiasu zachowuje się jak "hotspot guza" 16. W regionach woreczków "zimnego punktu" komórki nokautujące nTSG rozwarstwiają się od strony podstawy i ulegają apoptozie. W przeciwieństwie do tego, ponieważ "gorące" komórki zawiasowe posiadają sieć solidnych struktur cytoszkieletu po swoich podstawowych stronach, komórki nokautujące nTSG rozwarstwiają się od wierzchołkowej strony nabłonka i inicjują przerost rakotwórczy 16. W związku z tym analiza fenotypów nowotworów w dyskach wyobrażeniowych wymaga starannego rozważenia specyficznej dla regionu podatności na bodźce nowotworowe.
Tutaj opisujemy protokół indukowania powstawania guza nowotworowego w dyskach wyobrażonych skrzydeł Drosophila, wykorzystując system GAL4-UAS-RNAi, za pomocą którego komórki nTSG-knockdown są generowane w normalnym nabłonku dysku skrzydłowego. Chociaż te systemy eksperymentalne są przydatne do badania wczesnych stadiów raka, jasna metoda klasyfikacji do oceny etapów progresji guza w nabłonku dysku wyobrażeniowego nie została wcześniej jasno opisana. Dlatego proponujemy również metodę diagnostyczną pozwalającą sklasyfikować pronowotworowe fenotypy klonalne indukowane w nabłonku dysku skrzydła na trzy kategorie: hiperplazja (nagromadzenie nadmiernej liczby normalnie wyglądających komórek ze zwiększoną proliferacją), dysplazja (tkanka przednowotworowa złożona z nieprawidłowo wyglądających komórek) i neoplazja (łagodny lub złośliwy guz złożony z komórek o nieprawidłowym wyglądzie i nieprawidłowym wzorcu proliferacji).

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica kozia Sigma</td><td></td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>podłoże montażowe, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mysz-anty-Dlg 4F3</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>4F3 anty-dyski duże, RRID:AB_528203</td><td>rozcieńczone w PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mysz-anty-MMP1</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 zmieszane 1:1:1 i rozcieńczone w PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mysz-anty-MMP1</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 mieszane 1:1:1 i rozcieńczone w PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mysi-anty-MMP1</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 mieszane 1:1:1 i rozcieńczone w PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-atubulina</td><td>Rozwojowy Studia: Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>rozcieńczony w PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Sondy molekularne</td><td>A22283</td><td>rozcieńczone w PBS, 1:40</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie IgG, Alexa Fluor 546</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11030</td><td>rozcieńczone w PBTG, 1:400</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Fly szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>ponownie połączone z UAS-EGFP</td></tr><tr><td>upd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>ponownie połączone z UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-lgl-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>UAS-scrib-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>UAS-RasV12</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Yki3SA</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>hsFLP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>ponownie połączone z UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>Chromosom X</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>trzeci chromosom</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>drugi chromosom</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>trzeci chromosom</td></tr><tr><td>vkg-GFP</td><td>Morin i wsp. 2001</td><td></td><td>Pułapka białkowa GFP</td></tr></tbody></table>

indukcja i diagnostyka nowotworów w nabłonku dysku wyobrażeniowego drosophila

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

We wczesnych stadiach raka, przekształcone zmutowane komórki wykazują nieprawidłowości cytologiczne, rozpoczynają niekontrolowany przerost i stopniowo zakłócają organizację tkanek. Drosophila melanogaster stała się popularnym eksperymentalnym systemem modelowym w biologii nowotworów do badania genetycznych i komórkowych mechanizmów nowotworzenia. W szczególności narzędzia genetyczne dla dysków imaginalnych Drosophila (rozwijającego się nabłonka u larw) umożliwiają tworzenie przekształconych komórek pronowotworowych w normalnej tkance nabłonkowej, co jest sytuacją podobną do początkowych stadiów raka u ludzi. Niedawne badania nad nowotworzeniem dysków imaginalnych skrzydeł Drosophila wykazały jednak, że inicjacja guza zależy od wewnętrznej w tkance cytoarchitektury i lokalnego mikrośrodowiska, co sugeruje, że ważne jest, aby wziąć pod uwagę specyficzną dla regionu podatność na bodźce rakotwórcze w ocenie fenotypów guza w dyskach wyobrażeniowych. Aby ułatwić analizę fenotypową progresji guza w dyskach wyobrażeniowych, opisujemy tutaj protokół eksperymentów genetycznych z wykorzystaniem systemu GAL4-UAS do indukcji guzów nowotworowych w dyskach wyobrażonych skrzydeł. Następnie wprowadzamy metodę diagnostyczną w celu sklasyfikowania fenotypów zmian klonalnych indukowanych w nabłonku wyobrażeniowym, ponieważ jasna metoda klasyfikacji do rozróżniania różnych etapów progresji guza (takich jak hiperplazja, dysplazja lub nowotwór) nie została wcześniej opisana. Metody te mogą mieć szerokie zastosowanie w analizie klonalnej fenotypów nowotworów w różnych narządach u Drosophila.

Aby eksperymentalnie wykazać tworzenie się nowotworowych guzów indukowanych poprzez wyciszenie nTSG za pomocą RNAi w tarczach imaginalnych skrzydła Drosophila, zastosowano trzy różne sterowniki GAL4 do ekspresji UAS-RNAi dla lgl lub scrib: (1) sd-GAL4, który wywołuje silną ekspresję UAS w worku skrzydłowym i łagodną ekspresję w obszarach zawiasowych (Rycina 2 oraz Rycina 3A); ...

Analiza klonów mozaiki w nabłonku dysku imaginalnego Drosophila to potężny system modelowy do badania genetycznych i komórkowych mechanizmów nowotworzenia. W tym miejscu opisujemy protokół indukcji guzów w dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila za pomocą systemu GAL4-UAS i wprowadzamy metodę diagnozy w celu klasyfikacji fenotypów guza.

Indukcja i diagnostyka nowotworów w nabłonku dysku wyobrażeniowego Drosophila

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie nowotworowych klonów mozaikowych w rozwijających się dyskach imaginalnych Drosophila, a następnie zaklasyfikowanie zmian klonalnych do różnych stadiów rozwoju nowotworu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w modelowaniu raka, takie jak sposób spójnego indukowania nowotworów oraz metoda klasyfikacji stopnia ich progresji.Głównymi zaletami tej techniki są fakt, że wstrzyknięcie guza do dysków imaginalnych skrzydeł Drosophila jest realizowane przy użyciu prostych mechanizmów genetycznych muchy, oraz to, że klasyfikacja etapów rozwoju guza opiera się na prostej diagnostyce. Wraz z Kentą Morimoto, który zaprezentuje procedurę, wystąpi Kimiko Morimoto, technik z mojego laboratorium. Rozpocznijmy od przygotowania krzyżówki genetycznej.Na 12 godzin przed pobraniem dziewic do krzyżowania należy usunąć wszystkie dorosłe muchy z fiolek zawierających dojrzałe pocławki. Następnego dnia należy przeprowadzić krzyżowanie w celu uzyskania potomstwa z mozaiką genetyczną. Przenieś od 12 do 20 dziewic oraz 10 samców do świeżej fiolki i inkubuj je przez jeden dzień w temperaturze 25 °C.Po 24 godzinach przenieś muchy do nowej fiolki, a pie

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół przedstawia technikę sekcji stosowaną do izolacji tarcz imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym. Metody utrwalania tkanki po wycięciu i usunięciu tarcz skrzydłowych, odnóży oraz oka są zaprezentowane bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym w celu ich późniejszej wizualizacji.

Wypreparowanie tarczek imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Podczas barwienia wyimaginowanych krążków Drosophila, często przeprowadza się zgrubną sekcję, podczas której dyski są odsłonięte, ale pozostają przyczepione do ciała. Po zabarwieniu interesujące dyski są izolowane i montowane. Przykładowy protokół demonstruje procedurę wyimaginowanego rozwarstwienia i montażu dysku skrzydłowego.

Drosophila Wyimaginowana sekcja dysku larwy: metoda obserwacji rozwijającego się nabłonka

Współpraca między aktywowanym onkogenem, takim jak RASV12, a mutacjami w genach polaryzacji komórek, takimi jak bazgroły, powoduje wzrost guza u Drosophila, gdzie komórki nowotworowe również wykazują inwazyjne zachowania. W tym miejscu przedstawiono prosty protokół indukcji i obserwacji nowotworów łagodnych i inwazyjnych.

Protokół genetycznej indukcji i wizualizacji łagodnych i inwazyjnych nowotworów w kompleksach głowowych Drosophila melanogaster

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Tutaj opisujemy procedurę przechwytywania na żywo obrazów gastrulacji Drosophila. Umożliwiło nam to lepsze zrozumienie zwężenia wierzchołkowego związanego z wczesnym rozwojem i dalszą analizę mechanizmów rządzących ruchami komórek podczas modyfikacji struktury tkanki.

Obrazowanie zmiany kształtu komórki i ruchu komórek w gastrulacji Drosophila przy użyciu transgenicznych much reporterowych DE-kadheryny

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Poznaj metodę indukcji nowotworów w nabłonku wyobrażeniowym Drosophila za pomocą systemu GAL4-UAS. Technika umożliwia klasyfikację zmian nowotworowych i badanie dynamiki rozwoju raka.

Indukcja i diagnostyka nowotworów w nabłonku dysku wyobrażeniowego Drosophila

Przeglądaj więcej filmów