Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Celem tej procedury jest wyizolowanie i zidentyfikowanie klonalnych linii komórkowych nokautujących generowanych przez dwa typy edycji genomu za pośrednictwem CRIPSR/Cas9. Jedna metoda wykrywa nokaut białka spowodowany niehomologicznym łączeniem końców, podczas gdy druga wykrywa zaburzenia genomowe generowane przez naprawę ukierunkowaną na homologię. Metoda ta jest szczególnie przydatna w dziedzinie biologii molekularnej, gdzie generowanie linii komórkowych z zaburzeniami genetycznymi jest ważnym narzędziem w analizie funkcji genów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybka i stosunkowo wysokoprzepustowa metoda, którą można łatwo wykonać przy użyciu podstawowych technik biologii molekularnej. Niehomologiczne łączenie końców wprowadza małe delecje lub insercje i jest oceniane przez immunoblot kropkowy, podczas gdy naprawa ukierunkowana na homologię pozwala na większe i bardziej precyzyjne perturbacje i jest oceniane przez PCR kolonii. W tym eksperymencie wykorzystano komórki T-REx-293 hodowane w pożywkach DMEM, uzupełnione 10% FBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Przed transwekcją umieść komórki na płytkach sześciodołkowych i dołącz studzienkę, aby uzyskać nietransfekowaną kontrolę. Wyhoduj komórki do około 70% zbieżności. Transwekować komórki za pomocą 2,5 mikrograma całkowitego plazmidu przy użyciu komercyjnego protokołu transwekcji.

Do transwekcji komórek bez selekcji użyj 2,5 mikrograma plazmidu Cas9-sgRNA. Do transwekcji komórek z selekcją użyj 0,75 mikrograma Cas9-sgRNA1, 0,75 mikrograma Cas9-sgRNA2 i jednego mikrograma matrycy rekombinacji homologicznej. Inkubować transfekcyjne komórki i nietransfekowaną kontrolę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin.

W przypadku komórek transfekcyjnych z selekcją należy rozpocząć selekcję leku od potraktowania komórek odpowiednim lekiem, którym w tym przypadku jest neomycyna. Włożyć sześciodołkową płytkę z powrotem do inkubatora. Obserwuj leczone komórki raz dziennie, aby sprawdzić tempo śmierci komórek, aż wszystkie komórki w nietransfekcyjnej kontroli umrą.

Aby wyizolować populacje klonów, najpierw wyhoduj komórki do 100% zbieżności w pierwotnym dołku po selekcji. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia komórek i policz komórki. Ponieważ prawidłowe wytwarzanie kolonii monoklonalnych jest kluczem do uzyskania pełnego nokautu, należy zadbać o określenie prawidłowego rozcieńczenia komórek w celu osadzenia komórek o pożądanej gęstości.

Po ustaleniu prawidłowego rozcieńczenia umieścić komórki w 96-dołkowych płytkach o gęstości 0,33 komórki na dołek. Umieszczenie trzech płytek 96=well jest dobrym punktem wyjścia, aby zapewnić izolację więcej niż jednego prawidłowego klonu. Przez okres od dwóch do czterech tygodni obserwuj kolonie, aż będą widoczne dla oka.

Te reprezentatywne obrazy pokazują kolonie na różnych etapach wzrostu. Pojedyncza komórka w pozycji siedzącej, komórki w piątym dniu i dobrze ugruntowana kolonia w 10 dniu. Używając sterylnej końcówki pipety, ostrożnie i precyzyjnie wybierz widoczne kolonie, a następnie ponownie umieść je w nowych studzienkach, aby pobudzić wzrost jednowarstwowy.

Kontynuuj wzrost komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Kandydaci do nokautu bez selekcji są poddawani badaniom przesiewowym za pomocą immunoblot punktowego w celu oceny produktu białkowego w sposób wysokoprzepustowy. Po wyhodowaniu pojedynczych klonów do 50 do 100% konfluencji, usuń monowarstwę komórek, pipetując do studzienki.

Porcjować 90 mikrolitrów ze 100 mikrolitrów całkowitej objętości z każdej studzienki do czystej probówki mikrowirówkowej. Na potrzeby tego filmu zostaną przetworzone tylko dwie próbki. Wiruj z prędkością 6 000 obr./min przez pięć minut, wyjmij nośnik i zlizuj paletę ogniw w 10 mikrolitrach bufora ładującego 1X SDS.

Dodaj 90 mikrolitrów nowej pożywki do pozostałych komórek w studzience i włóż płytkę z powrotem do inkubatora, aby kontynuować rozmnażanie komórek. Odpipetuj jeden mikrolitr lizatu komórkowego na suchą membranę nitrocelulozową, aby utworzyć kropkę. Osusz każdą próbkę dwukrotnie na dwóch oddzielnych błonach, tworząc dwa identyczne wzory próbek.

Zablokuj błony w 5% mleku w TBST w temperaturze pokojowej, z kołysaniem, przez godzinę. Po godzinie osuszyć błony przeciwciałami pierwszorzędowymi w zalecanym rozcieńczeniu przeciwciał pierwszorzędowych i TBST plus 5% mleka. Na jednej błonie użyj pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku docelowemu, ELAVL1 w tym eksperymencie.

Na drugiej błonie użyj przeciwciała pierwszorzędowego dla białka kontrolnego, które nie powinno się zmienić, stosuje się tutaj PUM2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z każdej plamy, dodaj TBST i inkubuj przez pięć minut.

W ten sposób umyj plamy trzykrotnie za pomocą TBST. Następnie dodaj do każdej błony odpowiednie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP i osuszaj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po godzinie przemyj membrany trzykrotnie TBST przez pięć minut za każdym razem.

Nałóż roztwór substratu chemiluminescencyjnego na plamy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, i zobrazuj osuszone błony na cyfrowym obrazie chemiluminescencyjnym. Na koniec określ ilościowo intensywność kropek dla białek docelowych i kontrolnych za pomocą odpowiedniego oprogramowania i przeanalizuj wyniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Kandydaci z wybieralnym markerem oporności są poddawani badaniom przesiewowym metodą PCR kolonii.

Rozpocznij tę procedurę od zduplikowania pojedynczych kolonii na nowej 96-dołkowej płytce i wyhodowania ich do 100% zbiegu w celu przygotowania lizatów komórkowych. Usuń pożywkę z jednego zestawu klonów, ponownie zawieś komórki z każdej studzienki w 30 mikrolitrach buforu ekstrakcyjnego z komercyjnego zestawu do przygotowywania DNA i przenieś do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Podgrzej roztwór do 96 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie ostudź do temperatury pokojowej.

Dodaj 30 mikrolitrów buforu stabilizacyjnego do każdej probówki mikrowirówki i dobrze wymieszaj. Aby zidentyfikować zmutowane linie typu dzikiego i monoallelicznego lub biallelicznego przez PCR kolonii, zaprojektuj dwa oddzielne zestawy starterów PCR do amplifikacji regionów wokół ramion homologii w oparciu o udaną lub nieudaną integrację kasety odpornościowej. Z każdej strony użyj wspólnego podkładu, który wyżarza się na zewnątrz ramienia homologii.

Aby przetestować allel typu dzikiego, użyj wspólnego startera z odpowiednim sparowanym starterem, który jest komplementarny do endogennej sekwencji obejmującej region homologii. Aby przetestować pożądaną mutację, użyj wspólnego startera z innym sparowanym starterem, komplementarnym do wstawionej kasety oporowej. Dla każdej badanej próbki należy przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą następujące elementy: 0,5 mikrolitra lizatu komórkowego, 1,25 mikrolitra buforu 10X KOD, 0,75 mikrolitra 25 milimolowego siarczanu magnezu, 1,25 mikrolitra dwóch milimolowych dNTP, 0,375 mikrolitra startera przedniego, 0,375 mikrolitra startera odwrotnego, 0,25 mikrolitra polimerazy KOD i 7,75 mikrolitra wody.

Wykonaj PCR w następujących warunkach: 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie 25 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 20 sekund, temperatura topnienia startera przez 10 sekund i 70 stopni Celsjusza przez 20 sekund na KB. Następnie zwizualizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Przeprowadzono edycję genomu przy użyciu niehomologicznego łączenia końców w celu wygenerowania linii nokautujących ELAVL1, a następnie immunoblot kropkowy, sondując ELAVL1 i PUM2. Klony, które wykazywały niewielki sygnał sterujący, były oznaczane znakiem X i wykluczane z dalszej analizy.

Klony o niskich sygnałach ELAVL1 były dalej testowane za pomocą western blot. Potwierdzeni kandydaci są oznaczeni kolorem zielonym, a kandydaci unieważnieni są oznaczeni kolorem szarym. Ta grafika przedstawia proporcje ELAVL1 do sterowania sygnałem białkowym w kolejności rosnącej.

W większości przypadków populacje klonalne z najniższym względnym sygnałem ELAVL1 zostały poprawnie zidentyfikowane jako nokauty. Kandydaci wygenerowani metodą naprawy ukierunkowanej homologii zostali przebadani za pomocą PCR kolonii, a produkty PCR uwidocznione za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Pokazano przykładowe wyniki z użyciem starterów obejmujących złącze integracji upstream przy użyciu endogennych starterów wewnętrznych i knockout inside starterów.

Startery zostały najpierw zweryfikowane zarówno w komórkach rodzicielskich, jak i w wybranych komórkach zbiorczych. Wyniki z 24 indywidualnych klonów kandydujących są pokazane wraz z oczekiwanymi wzorami pasm dla klonów typu dzikiego, nokautującego i monoallelicznego z delecją. Czarne strzałki wskazują prawidłowe produkty amplifikacji, gwiazdki oznaczają bialleliczne klony nokautujące.

Bialleliczne linie mutantów zostały następnie potwierdzone przez western blot. Niehomologiczne łączenie końcówek wykorzystuje pojedyncze cięcie Cas9 i niezależne od selekcji przesiewanie, co wymaga niewielkiego przygotowania z góry, a badanie przesiewowe w kierunku klonów z nokautem za pomocą plam punktowych może szybko określić, czy generacja nokautu zakończyła się sukcesem. Badania przesiewowe oparte na PCR dokładnie wykrywają właściwych kandydatów z dużymi zaburzeniami genomowymi generowanymi przez naprawę ukierunkowaną na homologię.

Techniki te umożliwiają naukowcom zajmującym się biologią molekularną łatwą i skuteczną identyfikację nokautów, co pozwala im badać normalne lub dysfunkcyjne procesy komórkowe za pomocą linii komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i identyfikować klonalne linie komórkowe nokautujące generowane przez edycję genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9.