Name: Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Poznaj dwie metody CRISPR/Cas9 do generowania linii komórkowych nokaut w komórkach ssaków, wykorzystujące niehomologiczne łączenie końców i naprawę kierowaną homologią. Techniki te umożliwiają szybkie i wydajne badanie funkcji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Gissell Sanchez, Megan Lee i Jasonowi Estepowi za pomoc eksperymentalną oraz Weifeng Gu i Xuemei Chen za udostępnienie odczynników.

1. Identyfikacja regionów homologii wokół pożądanego miejsca delecji
UWAGA: Wymagane tylko w przypadku korzystania z edycji opartej na zaznaczaniu.
<ol>
	<li>Wybierz dwa regiony o początkowej długości 1,5-2 kb, położone po obu stronach pożądanego miejsca delecji, które będą służyć jako ramiona homologii w matrycy HDR (Rysunek 1A). Zidentyfikuj regiony pozbawione miejsc rozpoznawania BsaI na obu niciach (GGTCTC), aby ułatwić klonowanie. Jeśli miejsc BsaI nie da się uniknąć, użyj innego enzymu restrykcyjnego typu IIs (BsmBI, SapI, BbsI) i zmodyfikuj odpowiednie miejsca w plazmidzie biorcy (pUC19-BsaI), plazmidzie donora markera oporności (pGolden-Neo lub pGolden-Hygro) oraz w nadwiszących końcach produktów PCR ramion homologii.</li>
</ol>
2. Generowanie plazmidów ekspresyjnych Cas9-sgRNA
<ol>
	<li>Określ miejsce lub miejsca docelowe dla mutogenezy. W przypadku metody z pojedynczym cięciem, bez selekcji, celuj w egzony kodujące proksymalne względem końca 5', aby zwiększyć prawdopodobieństwo powstania mutacji niefunkcjonalnej. W przypadku metody z dwoma cięciami wybierz dwa miejsca obejmujące taką część genu, jaka jest niezbędna. 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że efektywnie tworzone są delecje o wielkości do 53 kb.</li>
	<li>Wprowadź od 200 do 300 bp sekwencji regionu docelowego do narzędzia projektowego crispr.mit.edu. W przypadku klonowania opartego na selekcji wykorzystaj 200-300 bp zidentyfikowanych regionów homologii, które są proksymalne względem miejsca delecji (Rycyna 1A). Wybierz 2-3 najwyżej ocenione sgRNA na każdy region docelowy, aby uwzględnić różnice w ich aktywności oraz wyizolować niezależne klony, które nie wykazują tych samych potencjalnych efektów off-target.</li>
	<li>Aby zaprojektować dupleksowe oligonukleotydy z odpowiednimi nawisami do insercji do plazmidu ekspresyjnego, pomiń końcową sekwencję PAM (NGG) i dodaj nawis 5'-CACC, a następnie G do oligonu nici górnej. Dla oligonu nici dolnej dodaj nawis 5'-AAAC do odwrotnej komplementarnej sekwencji docelowej, a następnie 3'-C, jak zilustrowano poniżej: 
	<img alt="Dopasowanie sekwencji edycji genów; nici sgRNA, TS, BS; schemat procesu CRISPR." src="/files/ftp_upload/55903/55903seq01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Sekwencja 1"></li>
	<li>Wprowadź syntetyczne oligonukleotydy odpowiadające sgRNA do plazmidu pSpCas9(BB), stosując klonowanie Golden Gate28 zgodnie z protokołem laboratorium Zhanga29.</li>
</ol>
3. Generowanie plazmidów matrycowych do naprawy kierowanej homologią
UWAGA: Wymagane tylko w przypadku stosowania edycji opartej na selekcji. Plazmid matrycy do naprawy sterowanej homologią składa się z kasety oporności na lek, flankowanej przez dwa regiony komplementarne do genomu, znajdujące się bezpośrednio poza dwoma miejscami docelowymi sgRNA (Rycina 1B).
<ol>
	<li>Z szerszych regionów homologii zidentyfikowanych w kroku 1.1, wybierz fragment o długości 800-1 000 bp26, znajdujący się nie dalej niż 5-10 bp od zaprojektowanych miejsc cięcia Cas9, który będzie służył jako ramiona homologii (Rysunek 1A). Należy upewnić się, że ramiona homologii nie zawierają miejsca docelowego sgRNA ani sekwencji PAM, ponieważ spowodowałoby to cięcie samego plazmidu matrycy przez CRISPR/Cas9. Jeśli ramiona homologii zawierają wewnętrzne miejsca BsaI, należy zastosować alternatywne miejsca sgRNA.</li>
	<li>Amplifikuj ramiona homologii z DNA genomowego metodą PCR, wykorzystując polimerazę DNA o wysokiej wierności, zgodnie z instrukcjami producenta, stosując primery forward i reverse z dodatkową sekwencją na końcu 5', która wprowadza miejsca BsaI (GGTCTC) oraz unikalne nawisy na obu końcach regionu homologii. Nawisy muszą zawierać odpowiednie sekwencje, aby zapewnić prawidłową kolejność i orientację montażu, jak opisano poniżej (Rysunek 1B): 
	Nawis FP lewego ramienia homologii: 5' GGGTCTCAGGCC 
	Nawis RP lewego ramienia homologii: 5' GGGTCTCTCACG 
	Nawis FP prawego ramienia homologii: 5' GGGTCTCAGTCC 
	Nawis RP prawego ramienia homologii: 5' GGGTCTCTCCAC</li>
	<li>Przed kontynuacją sprawdź poprawność amplifikacji ramion homologii za pomocą elektroforezy w żelu.</li>
	<li>Zmontuj regiony prawego i lewego ramienia homologii wraz z kasetą oporności w plazmidzie matrycy HDR za pomocą klonowania Golden Gate28. Jako źródło kaset oporności flankowanych przez loxP (loxP-PGK-Neo-pA-loxP lub loxP-PGK-Hyg-pA-loxP) wykorzystaj plazmidy pGolden-Neo lub pGolden-Hygro30. Jako wektor biorcy wykorzystaj pUC19-BsaI, zmodyfikowany plazmid pUC19 z miejscami BsaI w regionie wielokrotnego klonowania i usuniętymi miejscami BsaI w pozostałych częściach (dostępny na zapytanie). Zastosuj stosunek 1:1:1:1 dla trzech wstawek i wektora.
	<ol>
		<li>Przygotuj następującą mieszaninę reakcyjną30:
		<table>
			<tbody>
				<tr>
					<td>Produkt PCR prawego ramienia homologii</td>
					<td>0,06 pmol (30-40 ng)</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Produkt PCR lewego ramienia homologii</td>
					<td>0,06 pmol (30-40 ng)</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Plazmid pGolden-Neo (100 ng/µL)</td>
					<td>1 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Plazmid pUC19-BsaI (100 ng/µL)</td>
					<td>1 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Bufor 2x T7 DNA ligase</td>
					<td>5 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>BsaI (10 U/µL)</td>
					<td>0,75 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>T7 DNA ligase (3000 U/µL)</td>
					<td>0,25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Woda</td>
					<td>do 10 µL</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Zastosuj następujące parametry termocyklera: 37 °C przez 5 min, 20 °C przez 5 min. Powtórz przez 30 cykli.</li>
		<li>Potraktuj produkt klonowania egzonukleazą zgodnie z instrukcjami producenta, aby strawić pozostałe liniowe DNA.</li>
		<li>Przeprowadź transformację mieszaniny reakcyjnej do kompetentnego szczepu E. coli zgodnie z protokołem dostarczonym wraz z komórkami i wysiej na szalki zawierające ampicylinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zidentyfikować klony z prawidłowo zmontowaną matrycą, przeprowadź kolonialną reakcję PCR w celu amplifikacji podregionów ramion homologii zmontowanej wstawki (ponieważ cała wstawka może być zbyt duża, aby można było ją niezawodnie amplifikować). Użyj jednego primera przyłączającego się do flankującej sekwencji plazmidu i drugiego primera komplementarnego do krawędzi kasety oporności (Rysunek 1B, sekwencja jest wspólna dla wstawek Neo i Hygro), co pozwoli uzyskać produkt zależny od montażu, który jest o około 200 bp dłuższy od zawartego ramienia homologii: 
	pUC19-Bsal-Left: 5' GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG 
	Resistance-Left: 5' AAAAGCGCCTCCCCTACCC 
	pUC19-BsaI-Right: 5' GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA 
	Resistance-Right: 5' AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG
	<ol>
		<li>Pobierz kolonie bakteryjne za pomocą sterylnych wykałaczek i zawieś bakterie w 20 µL wody. Podgrzewaj w temperaturze 95 °C przez 15 min, a następnie wiruj w wirówce stołowej z maksymalną prędkością przez 5 min. Natychmiast umieść na lodzie.</li>
		<li>Przygotuj następującą mieszaninę PCR31:
		<table>
			<tbody>
				<tr>
					<td>Rozcieńczona matryca kolonialna</td>
					<td>1,25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Bufor reakcyjny 10x Taq</td>
					<td>1,25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20 mM dNTPs</td>
					<td>0,25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Primer Forward 10 µM</td>
					<td>0,25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Primer Reverse 10 µM</td>
					<td>0,25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Polimeraza Taq</td>
					<td>0,25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Woda</td>
					<td>9 µL</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Zastosuj następujące parametry termocyklera: 95 °C przez 30 s, (95 °C przez 30 s, 61 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min/kb), powtórz przez 25 cykli, 72 °C przez 2 min.</li>
		<li>Sprawdź wielkość produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.</li>
		<li>Opcjonalnie przeprowadź miniprep DNA plazmidowego z poszczególnych kolonii o prawidłowej wielkości wstawki i zsekwencjonuj regiony ramion homologii metodą sekwencjonowania Sangera, używając wspomnianych wyżej primerów amplifikacyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Transfekcja komponentów CRISPR do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Przed transfekcją: hodować komórki T-REx293 w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Wysiać komórki na płytki 6-dołkowe i hodować do uzyskania około 70% konfluencji. Wyznaczyć dołek dla kontroli nietransfekowanej.</li>
	<li>Przetransfekować komórki łącznie 2,5 µg plazmidu zgodnie z komercyjnym protokołem transfekcji. Równolegle prowadzić kontrolę nietransfekowaną. 
	UWAGA: Metoda i wydajność transfekcji różnią się w zależności od typu komórek. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy dobrać odpowiednią metodę transfekcji dla danego układu.
	<ol>
		<li>W przypadku transfekcji komórek z selekcją, użyć 0,75 µg Cas9-sgRNA 1 (cięcie lewe), 0,75 µg Cas9-sgRNA 2 (cięcie prawe) oraz 1,0 µg matrycy do rekombinacji homologicznej.</li>
		<li>W przypadku transfekcji komórek bez selekcji, użyć 2,5 µg plazmidu Cas9-sgRNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wybór leku
<ol>
	<li>48 h po transfekcji potraktuj komórki odpowiednim lekiem (neomycyną/higromycyną). Prowadź selekcję do momentu, aż wszystkie komórki w niepoddanej transfekcji kontroli obumrą (zazwyczaj 3-5 dni dla Neo, 7-14 dni dla Hygro). 
	UWAGA: Dla komórek T-REx293 stosuj stężenia odpowiednio 500 µg/mL dla neomycyny oraz 10 µg/mL dla higromycyny. W przypadku innych typów komórek pomocne może być wcześniejsze przeprowadzenie miareczkowania leku na komórkach niepoddanych transfekcji w celu określenia stężenia efektywnego.</li>
</ol>
6. Izolacja populacji klonalnych
<ol>
	<li>Po selekcji hodować komórki do 100% konfluencji w oryginalnej studzience. Wysiać komórki na płytki 96-dołkowe z gęstością 0,33 komórki na studzienkę. 
	UWAGA: Wysianie trzech płytek 96-dołkowych jest dobrym punktem wyjścia, aby zapewnić izolację więcej niż jednego poprawnego klonu, jednak może być potrzebna większa lub mniejsza liczba płytek w zależności od wydajności sgRNA i HDR.</li>
	<li>Obserwować kolonie przez okres od 2 do 4 tygodni, aż staną się widoczne gołym okiem. Pobrać widoczne kolonie za pomocą sterylnego końcówki pipety i przesiać do nowych studzienek, aby wspomóc wzrost monowarstwy. W przypadku komórek w zawiesinie można zastosować jeszcze niższą gęstość siewu, aby zapewnić większy odsetek studzienek z pojedynczą kolonią.</li>
</ol>
7. Przesiewanie kandydatów
<ol>
	<li>Przesiewanie kandydatów bez użycia selekcji: dot blot
	<ol>
		<li>Hodować poszczególne klony do 50-100% konfluencji. Oddzielić monowarstwę komórek poprzez pipetowanie wewnątrz dołka.</li>
		<li>Przenieść 90 µL z całkowitej objętości 100 µL do czystej probówki do mikrocentryfugi. Wirować przy 6000 rpm przez 5 min, usunąć medium i lizować osad komórkowy w 10 µL 1x buforu do lizy lub 1x buforu do ładowania SDS (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6.8, 8% SDS, 0.1% błękitu bromofenolowego, 40% glicerolu, 100 mM DTT). Do pozostałych komórek w dołku dodać 90 µL świeżego medium, aby kontynuować namnażanie.</li>
		<li>Nanieść 1 µL lizatu komórkowego na suchą membranę nitrocelulozową, tworząc kropkę. Wykonać dot blot dla każdej próbki dwukrotnie na dwóch oddzielnych membranach, tworząc dwa identyczne układy próbek.</li>
		<li>Blokować membrany w 5% roztworze mleka w TBST (Tris Buffered Saline + 0.01% Tween 20: 8 g NaCl, 0.2g KCl, 3 g zasady Tris, uzupełnić wodą destylowaną do 1 L, pH 7.4)31 przez 1 h w temperaturze pokojowej (z wytrząsaniem, tutaj i w dalszej części procedury).</li>
		<li>Inkubować membrany z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko białku docelowemu na jednej membranie oraz przeciwciałem pierwszorzędowym dla białka kontrolnego (tubuliny, GAPDH lub innego białka, którego nie oczekuje się, że ulegnie zmianie) na drugiej. Stosować zalecane rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (0.2 µg/mL dla ELAVL1 i 0.1 µg/mL dla Pum2 w tym przypadku) w TBST + 5% mleka. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemywać 3 razy w TBST przez 5 min.</li>
		<li>Inkubować każdą membranę z odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP w TBST + 5% mleka przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemywać 3 razy w TBST przez 5 min.</li>
		<li>Nanieść roztwór substratu do chemiluminescencji (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i obrazować membranę na cyfrowym imagerze do chemiluminescencji.</li>
		<li>Ilościowo określić intensywność kropki dla białek docelowych i kontrolnych za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
		<li>Odrzucić kandydatów z niskim sygnałem białka kontrolnego i obliczyć stosunki intensywności białka docelowego do kontrolnego po odjęciu tła dla pozostałych kandydatów. Wybrać kandydatów z najniższymi stosunkami do pasażowania i dalszej walidacji za pomocą western blot.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesiewanie kandydatów z użyciem selekcji: colony PCR
	<ol>
		<li>Zebrać lizat komórkowy przy użyciu zestawu do preparatyki DNA (patrz Tabela materiałów).
		<ol>
			<li>Przenieść poszczególne kolonie do nowej płytki 96-dołkowej i hodować do 100% konfluencji.</li>
			<li>Usunąć medium z jednego zestawu klonów i resuspendować komórki w 30 µL buforu do ekstrakcji z zestawu. Przenieść do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL.</li>
			<li>Podgrzać roztwór do 96 °C przez 15 min i pozwolić mu ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
			<li>Dodać 30 µL buforu stabilizującego z zestawu. Dokładnie wymieszać.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zidentyfikować linie typu dzikiego oraz mutanty monoalleliczne/bialleliczne za pomocą colony PCR.
		<ol>
			<li>Zaprojektować dwa oddzielne zestawy starterów PCR (dla lewej i prawej strony docelowego locus), aby amplifikować regiony wokół ramion homologii w zależności od pomyślnej lub niepomyślnej integracji kasety oporności (Rysunek 2C). Po każdej stronie zastosować wspólny starter (czerwony), który hybrydyzuje poza ramieniem homologii. Użyć go w parze z odpowiadającym mu starterem komplementarnym do sekwencji endogennej, obejmującym region homologii (niebieski), aby przetestować obecność allelu typu dzikiego. Użyć innego startera parzystego, komplementarnego do wstawionej kasety oporności (patrz startery w sekcji 2.3), aby przetestować pożądaną mutację.</li>
			<li>(Zalecane) Zwalidować zestawy starterów, używając lizatu komórkowego z oryginalnej wyselekcjonowanej populacji komórek zbiorczych, ponieważ będzie ona zawierać mieszankę alleli WT i mutantów (Rysunek 2D).</li>
			<li>Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną:
			<table>
				<tbody>
					<tr>
						<td>Lizat komórkowy</td>
						<td>0.5 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>10x bufor KOD</td>
						<td>1.25 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>25mM MgSO4</td>
						<td>0.75 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2 mM dNTPs</td>
						<td>1.25 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>10 µM starter Forward</td>
						<td>0.375 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>10 µM starter Reverse</td>
						<td>0.375 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Polimeraza KOD</td>
						<td>0.25 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Woda</td>
						<td>7.75 µL</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</li>
			<li>Zastosować następujące warunki termocyklera: 95 °C przez 2 min, (95 °C przez 20 s, Tm startera przez 10 s, 70 °C przez 20 s/kb) powtórzyć przez 25 cykli.</li>
			<li>Wizualizować produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórzyć testy colony PCR dla każdej strony przewidywanej integracji. Wybrać i namnożyć kandydatów, u których stwierdzono obecność integracji i brak produktu sekwencji endogennej dla regionu usuniętego.</li>
		<li>Zwalidować pozytywne kandydaty za pomocą western blot i/lub RT-qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Weryfikacja mutacji genomicznej poprzez sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Wyizolować DNA genomiczne z mutantowych linii komórkowych metodą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej31.</li>
	<li>Przeprowadzić amplifikację PCR regionu docelowego sgRNA, stosując primery z nadmiarowymi końcami 5', które dodają miejsca restrykcyjne BsaI na obu końcach. 
	UWAGA: W przypadku klonów edytowanych metodą HDR, gdzie oba allele mogą być identyczne, produkt PCR można sekwencjonować bezpośrednio.</li>
	<li>Sklonować amplifikowany region do wektora pUC19-BsaI za pomocą klonowania Golden Gate.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę reakcyjną do kompetentnego szczepu E. coli poprzez transformację.</li>
	<li>Wykonać miniprep DNA plazmidowego z 6-10 pojedynczych kolonii i zsekwencjonować sklonowany region metodą sekwencjonowania Sangera.</li>
</ol>

<ol><li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).</li>
<li>Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+Fok+I+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).</li>
<li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+homologous+recombination+through+targeted+cleavage+by+chimeric+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases.</a> Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+mediated+by+adeno-associated+virus+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks.</a> Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).</li>
<li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+effectors%3A+customizable+proteins+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Christian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+double-strand+breaks+with+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).</li>
<li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas%3A+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Karginov, F. V., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+system%3A+small+RNA-guided+defense+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea.</a> Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).</li>
<li>Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+genetic+silencing+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.</a> Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).</li>
<li>Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+of+regularly+spaced+prokaryotic+repeats+derive+from+foreign+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements.</a> J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).</li>
<li>Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+elements+in+Yersinia+pestis+acquire+new+repeats+by+preferential+uptake+of+bacteriophage+DNA%2C+and+provide+additional+tools+for+evolutionary+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies.</a> Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).</li>
<li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li>
<li>Deltcheva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNA+maturation+by+trans-encoded+small+RNA+and+host+factor+RNase+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.</a> Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).</li>
<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
<li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).</li>
<li>Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-crRNA+ribonucleoprotein+complex+mediates+specific+DNA+cleavage+for+adaptive+immunity+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Davis, A. J., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double+strand+break+repair+via+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA double strand break repair via non-homologous end-joining.</a> Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).</li>
<li>Guirouilh-Barbat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+KU80+pathway+on+NHEJ-induced+genome+rearrangements+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells.</a> Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).</li>
<li>Moore, J. K., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+and+genetic+requirements+of+two+pathways+of+nonhomologous+end-joining+repair+of+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).</li>
<li>Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-directed+repair+is+a+major+double-strand+break+repair+pathway+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).</li>
<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+and+efficient+CRISPR%2FCas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+rAAV-based+gene+targeting+vectors+by+Golden+Gate+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning.</a> Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

System CRISPR/Cas9 pozwolił na efektywne generowanie stabilnych modyfikacji genomu, które stanowią bardziej spójną alternatywę dla innych metod manipulacji w stanach nieustalonych. W tym miejscu przedstawiliśmy dwie metody szybkiej identyfikacji nokautów genów CRISPR/Cas9 w liniach komórkowych ssaków. Obie metody wymagają niewielkiej ilości materiału komórkowego, więc testy można przeprowadzić we wczesnych stadiach hodowli klonalnej, oszczędzając czas i odczynniki. Aby zwiększyć skuteczność obu metod, zalecamy testowanie...

Stabilne zmiany genetyczne dają przewagę nad przejściowymi metodami perturbacji komórkowych, które mogą być zmienne pod względem skuteczności i czasu trwania. Edycja genomu staje się coraz bardziej powszechna w ostatnich latach ze względu na rozwój docelowych nukleaz, takich jak nukleazy palców cynkowych1,2,3,4,5, aktywatory transkrypcji podobne do efektorów nukleazy (TALENs)6,7,8,9 i nukleazy sterowane RNA pochodzące z systemu CRISPR (clustered, regularly interspaced short palindromic repeats)10.
Maszyneria edycji CRISPR/Cas9 jest zaadaptowana z układu odpornościowego, którego bakterie i archeony używają do obrony przed infekcjami wirusowymi11,12,13. W tym procesie krótkie, 20-30 nt fragmenty inwazyjnej sekwencji wirusa są włączane do locus genomu jako "przekładki" otoczone powtarzającymi się jednostkami14,15. Późniejsza transkrypcja i przetwarzanie RNA generuje małe RNA związane z CRISPR16 (crRNAs), które wraz z transaktywującym crRNA17 (tracrRNA) łączą się z endonukleazą efektorową Cas9. W ten sposób crRNA zapewniają specyficzność dla celowania w Cas9, kierując kompleks do rozszczepienia komplementarnych sekwencji wirusowego DNA i zapobiegając dalszym infekcjom18,19. Każda sekwencja "protospacer" w docelowym DNA może służyć jako źródło crRNA, o ile znajduje się bezpośrednio 5' do krótkiego motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM), NGG w przypadku S. pyogenes Cas920. Brak sekwencji PAM w pobliżu przekładki w locus CRISPR gospodarza rozróżnia siebie i nie-siebie, zapobiegając namierzaniu gospodarza. Ze względu na swoją uniwersalność i elastyczność, ten system biologiczny został silnie przystosowany do edycji genomu, tak że prawie każde miejsce DNA sąsiadujące z PAM może być celowane. W tej wersji dalsza modyfikacja połączyła crRNA i tracrRNA w pojedynczy składnik przewodnika RNA (sgRNA), który jest ładowany do białka Cas921.
Po ekspresji Cas9 i sgRNA w komórkach eukariotycznych, białko Cas9 rozszczepia obie nici DNA w docelowym locus. W przypadku braku odpowiedniego regionu sekwencji homologicznej, komórka naprawia to przerwanie poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ)22,23,24, co zwykle wprowadza małe delecje lub, rzadko, insercje. W przypadku celowania w otwartą ramkę odczytu, naprawa prawdopodobnie prowadzi do translacyjnego przesunięcia ramki, które wytwarza niefunkcjonalny produkt białkowy. W przeciwieństwie do tego, gdy komórka jest wyposażona w egzogeniczny szablon z dużymi obszarami homologii, może naprawić pęknięcie podwójnej nici przez naprawę skierowaną do homologii25,26. Ta trasa pozwala na bardziej precyzyjne delecje, wymiany lub insercje w genomie, w połączeniu z wprowadzeniem markerów selekcyjnych podlegających akcyzie27.
Tutaj prezentujemy protokoły generowania linii komórkowych knockout za pomocą jednej z tych dwóch metod CRISPR/Cas9 (Rysunek 1A). Podejście NHEJ wykorzystuje pojedyncze miejsce cięcia sgRNA i niezależne od selekcji badania przesiewowe, a zatem wymaga niewielkiego wcześniejszego przygotowania. Stosując tę metodę, należy zaprojektować prowadzące RNA komplementarne do eksonów w pobliżu końca 5' transkryptu, które z największym prawdopodobieństwem wytworzą nokaut. Ponieważ modyfikacje genomu w tym przypadku są niewielkie, badania przesiewowe w kierunku klonów nokautujących opierają się na plamach punktowych, w których produkt białkowy jest oceniany w sposób wysokoprzepustowy. Jako przykładu używamy generowania linii nokautujących białka ELAV-podobnego do 1 (ELAVL1). Drugie podejście opiera się na naprawie kierowanej homologią (HDR) i wykorzystuje dwa miejsca cięcia sgRNA, które obejmują gen lub region zainteresowania, co pozwala na delecje dziesiątek kb. Plazmid z dwoma regionami homologii, które flankują miejsca rozszczepienia, zapewnia zastępczy szablon (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B), wprowadzając wybieralny marker oporu, który zwiększa efektywność generowania nokautu. Metoda ta może być również zaadaptowana do wprowadzania modyfikacji genów za pomocą odpowiednio zaprojektowanych ramion homologicznych. W tym przypadku integracja nowego fragmentu DNA pozwala na badanie przesiewowe oparte na PCR (<silna klasa = "xfig" >Figura 1C). Tutaj jako przykładu używamy generacji linii nokautujących członka rodziny wiązania RNA Pumilio 2 (PUM2).

<table><tbody><tr><td>Kompetentny E. Zestaw</td> do przygotowania plazmidu <td></td><td></td><td></td>komórek em</tr><tr><td>plazmid pSpCas9 (BB)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>Ran et al. 2013, klonowanie sgRNA</td></tr><tr><td>Enzym BbsI</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td>Ran et al. 2013, klonowanie sgRNA</td></tr><tr><td></td> Ligaza DNA T7 NEB M0318L <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Ran et al. 2013, klonowanie sgRNAs</td></tr><tr><td>Tango Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>BY5</td><td>Ran et al. 2013, klonowanie sgRNAs</td></tr><tr><td>PlasmidSafe egzonukleaza</td><td>Epicentrum</td><td>E3105K</td><td>Ran et al. 2013, klonowanie sgRNAs</td></tr><tr><td>Q5 gorący start polimeraza wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0494A</td><td>HA amplifikacja</td></tr><tr><td>pUC19-BsaI</td><td></td><td></td><td>Zmodyfikowany plazmid pUC19, zmutowany istniejący obszar BsaI i wstawiony dwa skierowane na zewnątrz miejsca BsaI po trawieniu BamHI/EcoRI</td></tr><tr><td>Kaseta rezystancyjna</td><td>pGolden-Neo</td><td>Addgene</td><td>51422</td></tr><tr><td>pGolden-Hygro</td><td>Addgene</td><td>51423</td><td>Kaseta rezystancyjna</td></tr><tr><td>BsaI</td> enzym <td>NEB</td><td>R3535S</td><td>Budowa ramienia homologicznego</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T7</td><td>NEB</td><td>M0318L</td><td></td></tr><tr><td>PlasmidSafe egzonukleaza</td><td>Epicentrum</td><td>E3105K</td><td></td></tr><tr><td>Wykałaczki</td><td></td><td></td><td>bakteryjne PCR</td></tr><tr><td>Taq polimeraza</td><td></td><td></td><td>kolonia bakteryjna</td></tr><tr><td>PCR HEK293 komórki</td><td></td><td></td><td></td>ludzkie</tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Strep (opcjonalnie)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>BioLite</td><td>12556004</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji TransIT-LTI</td><td>Mirus</td><td>MIR2300</td><td>tylko do lipofekcji</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td>tylko do lipofekcji</td></tr><tr><td>G418 (neomycyna)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720-5G</td><td></td></tr><tr><td>Higromycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3274-250MG</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>ThermoFisher</td><td>12556008</td><td></td></tr><tr><td>Pasywny bufor do lizy, 5x</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x receptura bufora</td><td></td><td></td> ładującego SDS <td>opisana w protokole</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Receptura TBST</td><td></td><td></td><td>opisana w protokole</td></tr><tr><td>Mleko suszone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrat SuperSignal West Dura o wydłużonym czasie trwania</td><td>ThermoFisher</td><td>34075</td><td>do przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP</td></tr><tr><td>Przygotowanie Extracta DNA do PCR</td><td>Quantabio</td><td>95091-025</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza KOD</td><td>Novagen</td><td>71316</td><td></td></tr></tbody></table>

zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem crispr/cas9 w komórkach ssaków

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

System inżynierii genomu CRISPR/Cas9 zrewolucjonizował biologię, umożliwiając precyzyjną edycję genomu przy niewielkim wysiłku. Kierując się pojedynczym przewodnikiem RNA (sgRNA), który nadaje specyficzność, białko Cas9 rozszczepia obie nici DNA w docelowym locus. Pęknięcie DNA może wywołać niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR). NHEJ może wprowadzać małe delecje lub insercje, które prowadzą do mutacji z przesunięciem ramki, podczas gdy HDR pozwala na większe i bardziej precyzyjne perturbacje. W tym miejscu przedstawiamy protokoły generowania linii komórkowych z nokautem poprzez sprzężenie ustalonych metod CRISPR/Cas9 z dwiema opcjami dalszej selekcji/badań przesiewowych. Podejście NHEJ wykorzystuje pojedyncze miejsce cięcia sgRNA i niezależne od selekcji badania przesiewowe, w których produkcja białka jest oceniana za pomocą immunoblot kropkowego w sposób wysokoprzepustowy. Podejście HDR wykorzystuje dwa miejsca cięcia sgRNA, które obejmują gen będący przedmiotem zainteresowania. Wraz z dostarczonym szablonem HDR, metoda ta może osiągnąć usunięcie dziesiątek kb, wspomagane przez wstawiony znacznik oporu do wyboru. Omówiono odpowiednie zastosowania i zalety każdej z metod.

Do wygenerowania linii z nokautem ELAVL1 dostępnym było skuteczne przeciwciało, dlatego edycję przeprowadzono z użyciem pojedynczych sgRNA (Rycina 1A, po lewej) przeprowadzono, a następnie wykonano dot immunoblot. W celu porównania wydajności oraz wykluczenia efektów poza celowych w otrzymanych klonach, niezależnie przetransfekowano trzy sgRNA. Po zebraniu lizatów komórkowych z populacji klonalnych i naniesieniu ich na dwie membrany nitrocelulozowe, bloty pod...

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Celem niniejszej procedury jest izolacja i identyfikacja klonalnych linii komórkowych z nokautem, wygenerowanych za pomocą dwóch typów edycji genomu za pośrednictwem systemu CRISPR/Cas9. Jedna metoda wykrywa nokaut białka spowodowany niehomologicznym łączeniem końców (nonhomologous end joining), natomiast druga wykrywa perturbacje genomiczne powstałe w wyniku naprawy kierowanej homologią (homology-directed repair). Metoda ta jest szczególnie użyteczna w dziedzinie biologii molekularnej, gdzie generowanie linii komórkowych z perturbacjami genetycznymi stanowi istotne narzędzie w badaniu funkcji genów.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybka i względnie wysokoprzepustowa metoda, którą można łatwo przeprowadzić przy użyciu podstawowych technik biologii molekularnej. Niehomologiczne łączenie końców wprowadza niewielkie delecje lub insercje, które są oceniane za pomocą immunoblottingu kropelkowego (dot immunoblot), natomiast naprawa sterowana homologią umożliwia większe i bardziej precyzyjne perturbacje, oceniane za pomocą PCR kolonii. W tym doświadczeniu wykorzystano komórki T-REx-293 hodowane w pożywce DMEM, uzupełnionej o 10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide.Przed transfekcją wysiej komórki na płytki sześciodołkowe, uwzględniając dołek dla kontroli nietransfekowanej. Hoduj komórki do uzyskania około 70% konfluencji. Przeprowadź transfekcję komórek przy użyciu 2,5 micrograms całkowitej ilości plazmidu, stosując komercyjny protokół transfekcji.W przypadku transfekcji komórek bez selekcji należy użyć 2,5 µg plazmidu Cas9-sgRNA. W przypadku transfekcji komórek z selekcją należy użyć 0,75 µg Cas9-sgRNA1, 0,75 µg Cas9-sgRNA2 oraz 1 µg matrycy do rekombinacji homologicznej. Inkubować transfekowane komórki oraz nietransfekowaną kontrolę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.W przypadku komórek przetransfekowanych w celu selekcji, rozpocznij selekcję lekową, traktując komórki odpowiednim lekiem, którym w tym przypadku jest neomycyna. Umieść płytkę sześciodołkową z powrotem w inkubatorze. Obserwuj traktowane komórki raz dziennie, aby monitorować tempo obumierania komórek, aż do momentu, gdy wszystkie komórki w kontroli nietransfekowanej zginą.Aby wyizolować populacje klonalne, najpierw należy doprowadzić komórki do 100% konfluencji w oryginalnej studzience po selekcji. Następnie należy wykonać rozcieńczenia seryjne komórek i przeprowadzić ich zliczenie. Ponieważ prawidłowe generowanie kolonii monoklonalnych jest kluczowe dla uzyskania pełnego knockoutu, należy zachować szczególną ostrożność przy określaniu właściwego rozcieńczenia w celu wysiania komórek z pożądaną gęstością.Po ustaleniu prawidłowego rozcieńczenia, wysiej komórki na płytki 96-dołkowe z gęstością 0,33 komórki na dołek. Wysianie trzech płytek 96-dołkowych jest dobrym punktem wyjścia, aby zapewnić izolację więcej niż jednego prawidłowego klonu. Przez okres od dwóch do czterech tygodni obserwuj kolonie, aż staną się widoczne gołym okiem.Te reprezentatywne obrazy przedstawiają kolonie na różnych etapach wzrostu. Pojedynczą komórkę w momencie osadzania, komórki w piątym dniu oraz dobrze ukształtowaną kolonię w dziesiątym dniu. Używając sterylnego końcówki do pipety, ostrożnie i precyzyjnie przenieś widoczne kolonie i osadź je w nowych dołkach, aby wspomóc wzrost w monowarstwie.Kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Kandydaci do knockoutu bez selekcji są przesiewani za pomocą dot immunoblotu w celu wysokoprzepustowej oceny produktu białkowego. Po wyhodowaniu poszczególnych klonów do 50–100% konfluencji, ododerwij monowarstwę komórek poprzez pipetowanie wewnątrz dołka.Przenieś 90 µL z całkowitej objętości 100 µL z każdej studni do czystej probówki do mikrocentryfugi. Na potrzeby tego filmu zostaną przetworzone tylko dwie próbki. Wirować z prędkością 6 000 RPM przez pięć minut, usunąć medium i zlizować osad komórkowy w 10 µL 1X buforu do ładowania SDS.Do pozostałych komórek w dołku dodać 90 µL świeżej pożywki, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w celu kontynuowania namnażania komórek. Nanieść pipetą 1 µL lizatu komórkowego na suchą membranę nitrocelulozową, tworząc kropkę. Każdą próbkę nanieść dwukrotnie na dwie osobne membrany, tworząc dwa identyczne układy próbek.Blokować membrany w 5% mleku w TBST w temperaturze pokojowej, z kołysaniem, przez jedną godzinę. Po godzinie inkubować membrany z przeciwciałami pierwszorzędowymi w zalecanym rozcieńczeniu, w TBST z dodatkiem 5% mleka. Na jednej membranie należy zastosować przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko białku docelowemu, którym w tym doświadczeniu jest ELAVL1.Na drugiej membranie należy zastosować przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko białku kontrolnemu, którego nie oczekuje się, że ulegnie zmianie; w tym przypadku użyto PUM2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych z każdego transferu, dodać TBST i inkubować przez pięć minut.W ten sposób należy trzykrotnie przemyć membrany roztworem TBST. Następnie na każdą membranę należy nanieść odpowiednie przeciwciało wtórne sprzężone z HRP i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po godzinie membrany należy trzykrotnie przemyć roztworem TBST, przez pięć minut podczas każdego etapu.Nanieś roztwór substratu chemiluminescencyjnego na bloty zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie wykonaj obrazowanie membran na cyfrowym imagerze chemiluminescencyjnym. Na koniec określ ilościowo intensywność plamek dla białek docelowych i kontrolnych przy użyciu odpowiedniego oprogramowania i przeanalizuj wyniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Kandydaty posiadające selekcyjny marker oporności są przesiewane za pomocą metody colony PCR.Procedurę należy rozpocząć od przesiewania pojedynczych kolonii do nowej płytki 96-dołkowej i hodowania ich do 100% konfluencji w celu przygotowania lizatów komórkowych. Z jednego zestawu klonów należy usunąć medium, a komórki z każdego dołka zawiesić w 30 µL buforu do ekstrakcji z komercyjnego zestawu do izolacji DNA, a następnie przenieść do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Roztwór należy podgrzać do 96 °C przez 15 minut, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.Do każdej probówki do mikrocentryfugi należy dodać 30 µL buforu stabilizującego i dokładnie wymieszać. W celu zidentyfikowania linii typu dzikiego oraz mutantów monoallelicznych lub biallelicznych za pomocą kolonialnej reakcji PCR, należy zaprojektować dwa osobne zestawy starterów PCR do amplifikacji regionów wokół ramion homologii, w zależności od tego, czy integracja kasety oporności przebiegła pomyślnie, czy nie. Po każdej stronie należy zastosować wspólny starter, który wiąże się poza ramieniem homologii.Aby przetestować obecność allelu typu dzikiego, należy użyć wspólnego primera wraz z odpowiadającym mu primerem sparowanym, który jest komplementarny do sekwencji endogennej obejmującej region homologii. Aby przetestować obecność pożądanej mutacji, należy użyć wspólnego primera z innym primerem sparowanym, komplementarnym do wstawionej kasety oporności. Dla każdej próbki do analizy należy przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą: 0.5 µL lizatu komórkowego, 1.25 µL buforu KOD 10X, 0.75 µL 25 mM siarczanu magnezu, 1.25 µL 2 mM dNTPs, 0.375 µL primera forward, 0.375 µL primera reverse, 0.25 µL polimerazy KOD oraz 7.75 µL wody.Przeprowadź reakcję PCR stosując następujące warunki: 95 °C przez dwie minuty, a następnie 25 cykli obejmujących 95 °C przez 20 sekund, temperaturę topnienia starterów przez 10 sekund oraz 70 °C przez 20 sekund na każdy kb. Następnie zwizualizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Edycję genomu z wykorzystaniem niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) przeprowadzono w celu wygenerowania linii z nokautem ELAVL1, po czym wykonano dot immunoblot z użyciem przeciwciał przeciwko ELAVL1 i PUM2. Klony, które wykazały słaby sygnał kontrolny, oznaczono symbolem X i wykluczono z dalszych analiz.Klony z niskim sygnałem ELAVL1 zostały poddane dalszym badaniom metodą western blot. Potwierdzeni kandydaci są zaznaczeni na zielono, a kandydaci odrzuceni na szaro. Grafika przedstawia stosunki sygnału ELAVL1 do sygnału białka kontrolnego w kolejności rosnącej.W większości przypadków populacje klonalne z najniższym względnym sygnałem ELAVL1 zostały prawidłowo zidentyfikowane jako nokauty. Kandydaty wygenerowane metodą naprawy kierowanej homologią zostały przebadane za pomocą kolonialnej reakcji PCR, a produkty PCR zwizualizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Przedstawiono przykładowe wyniki z wykorzystaniem starterów obejmujących górny złącz punktu integracji, przy użyciu endogennych starterów wewnętrznych oraz starterów wewnętrznych dla nokautu.Startery zostały najpierw zwalidowane zarówno w komórkach rodzicielskich, jak i w masowo wyselekcjonowanych komórkach. Wyniki z 24 pojedynczych klonów kandydackich przedstawiono wraz z oczekiwanymi wzorami prążków dla klonów typu dzikiego, nokautowych oraz z delecją monoalleliczną. Czarne strzałki wskazują prawidłowe produkty amplifikacji, a gwiazdki oznaczają klony z nokautem biallelicznym.Linie mutantów biallelicznych zostały dodatkowo zweryfikowane za pomocą techniki western blot. Niehomologiczne łączenie końców wykorzystuje pojedyncze cięcie Cas9 oraz przesiew niezależny od selekcji, co wymaga niewielkich przygotowań wstępnych, a przesiew klonów z nokautem za pomocą dot blot pozwala szybko ustalić, czy generowanie nokautu zakończyło się sukcesem. Przesiew oparty na metodzie PCR precyzyjnie wykrywa odpowiednich kandydatów z dużymi perturbacjami genomicznymi powstałymi w wyniku naprawy kierowanej homologią.Techniki te umożliwiają badaczom w dziedzinie biologii molekularnej łatwą i wydajną identyfikację knockoutów, co pozwala na badanie prawidłowych lub zaburzonych procesów komórkowych z wykorzystaniem linii komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować i identyfikować klonalne linie komórkowe z knockoutem, wygenerowane za pomocą edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9.

selection-dependent-independent-generation-crisprcas9-mediated-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Ten protokół opisuje kroki klonowania wielu pojedynczych przewodnikowych RNA do jednego wektora konkategorującego RNA przewodnika, co jest szczególnie przydatne w tworzeniu wielogenowych nokautów przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. Wytwarzanie podwójnych nokautów w organoidach jelitowych przedstawiono jako możliwe zastosowanie tej metody.

Protokół wielokrotnego nokautu genów w organoidach jelita cienkiego myszy przy użyciu konkategomera CRISPR

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

W miarę jak protokoły związane z CRISPR stają się coraz bardziej użyteczne i dostępne, w określonych warunkach eksperymentalnych nadal mogą pojawić się komplikacje i przeszkody. Protokół ten przedstawia w zarysie tworzenie wchodzącej w interakcję z receptorem ludzkiej linii komórkowej kinazy serynowo-treoninowej 1 (RIPK1/RIP1) przy użyciu CRISPR/Cas9 i podkreśla potencjalne wyzwania napotkane podczas tego procesu.

Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Poznaj dwie metody CRISPR/Cas9 do generowania linii komórkowych nokaut w komórkach ssaków, wykorzystujące niehomologiczne łączenie końców i naprawę kierowaną homologią. Techniki te umożliwiają szybkie i wydajne badanie funkcji genów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów