Name: Izolacja perycytów typu I i typu II z mięśni szkieletowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj protokół FACS do jednoczesnej izolacji perycytów typu I i II z mięśni szkieletowych myszy. Ta metoda umożliwia badanie różnic biologicznych między podpopulacjami komórek bez użycia transgenu NG2 dsRED.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez grant Fund-A-Fellow od Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) oraz Scientist Development Grant od American Heart Association (16SDG29320001).

Myszy transgeniczne typu dzikiego i Nestin-GFP były trzymane w obiekcie dla zwierząt na Uniwersytecie Minnesoty. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Minnesoty i były zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Sekcja mięśni i izolacja pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji dorosłe myszy (6-10 tygodni, zarówno samce, jak i samice) tribromoetanolem (250 mg/kg, i.p.) i wysterylizuj skórę brzucha 70% etanolem. 
	UWAGA: Tribromoetanol został tutaj użyty zamiast ketaminy do znieczulenia/eutanazji, ponieważ wiadomo, że ketamina wchodzi w interakcje z receptorami NMDA, co może potencjalnie mieć wpływ na badanie.</li>
	<li>Umieść myszy w pozycji leżącej na plecach i za pomocą skalpela wykonaj poziome nacięcie na skórze brzucha. Zdejmij skórę ręcznie, ciągnąc w przeciwnych kierunkach, aby odsłonić mięśnie kończyn tylnych.</li>
	<li>Zbierz mięśnie obu tylnych kończyn za pomocą kleszczy i nożyczek. Przechowywać je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) uzupełnionym 1% penicyliną-streptomycyną (P/S) na lodzie.</li>
	<li>Umyj wypreparowane mięśnie kończyn tylnych w lodowatym PBS uzupełnionym dwukrotnie 1% P/S i przenieś je na sterylną płytkę o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj nerwy, naczynia krwionośne i tkankę łączną z mięśni za pomocą kleszczy i nożyczek pod mikroskopem preparacyjnym przy 2-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Drobno posiekaj i zmiel mięśnie na małe kawałki (1-2 mm3) za pomocą sterylnych nożyczek i ostrzy. W razie potrzeby dodaj niewielką ilość Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aby upewnić się, że mięśnie nie są wysuszone.</li>
	<li>Mechanicznie rozbić tkankę, pipetując w górę i w dół przez 10-krotną pipetę serologiczną o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Dodać świeżo przygotowany roztwór do wytrawiania (DMEM uzupełniony 0,2% kolagenazą typu 2) do mieszanki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny z delikatnym mieszaniem przy 35 obrotach/min.</li>
	<li>Rozcierać za pomocą igły 18 G w celu homogenizacji mieszaniny. Następnie odwirować przy 500 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 0,25% trypsyny/EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Powtórz etap wirowania jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Dodać 10 ml DMEM uzupełnionego 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do roztworu i wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do lizy czerwonych krwinek (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA).</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze sortującym (20 mM HEPES, pH 7,0; 1 mM EDTA; i 1% BSA w PBS wolnym od Ca/Mg2+, pH 7,0). Przefiltrować mieszaninę przez sitko o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu sortującego.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i rozcieńcz zawiesinę jednokomórkową do 5 x 106/ml w buforze sortującym.</li>
</ol>
2. Barwienie i sortowanie komórek
<ol>
	<li>Przygotować kontrole i próbkę zgodnie z opisem w tabeli 1. Wybarwić zawiesinę jednokomórkową odpowiednimi przeciwciałami na lodzie przez 30 minut, jak opisano w Tabeli 1.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut i dwukrotnie przemyć granulki buforem sortującym.</li>
	<li>Dodać DAPI do roztworów jednokomórkowych, jak wskazano w Tabeli 1. Użyj 5 μg/ml DAPI (stężenie końcowe) dla jednokolorowej kontroli DAPI i 1 μg/ml DAPI dla kontroli PDGFRβ-PE-FMO i próbki. Utrzymuj wszystkie probówki na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Włącz sorter i oprogramowanie. Zeskanuj i włóż chip sortujący 100 μm po wyświetleniu monitu.</li>
	<li>Wykonaj automatyczną konfigurację (tj. wyrównanie chipów, kalibrację kropli, kalibrację strumienia bocznego i kalibrację opóźnienia sortowania), ładując automatyczne koraliki konfiguracyjne po wyświetleniu monitu.</li>
	<li>Po zakończeniu automatycznej konfiguracji przejdź do zakładki "Eksperyment", kliknij "Nowy" i wybierz "Pusty szablon" z "Szablonów publicznych".</li>
	<li>W sekcji "Ustawienia pomiaru" wpisz "DAPI" dla "FL1", "Nestin-GFP" dla "FL2" i "PDGFRβ" dla "FL3". Odznacz pola "FL4"-"FL6".</li>
	<li>Zaznacz pola, aby aktywować lasery 405, 488 i 561 i kliknij "Utwórz nowy eksperyment".</li>
	<li>Wybierz opcję "Uruchom Kreatora Rekompensat" i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania "Kreator odszkodowań", aby skonfigurować rekompensatę.
	<ol>
		<li>Załaduj niezabarwioną kontrolkę i kliknij "Start". Kliknij "Ustawienia detektora i progu" i dostosuj wzmocnienie czujnika detektorów FSC i BSC, aby umieścić populację na wadze.</li>
		<li>Dostosuj poziomy wzmocnienia kanałów fluorescencyjnych FL1-FL3, aby umieścić populacje ujemne po lewej stronie histogramów. Kliknij przycisk "Nagraj", aby zapisać dane.</li>
		<li>Wczytuj jednokolorowe elementy sterujące pojedynczo po wyświetleniu monitu. Kliknij "Start i nagrywaj", aby zapisać dane. Dostosuj bramki dla dodatnich populacji na histogramach. Kliknij "Dalej".</li>
		<li>Przejdź do "Oblicz matrycę" w zakładce "Odszkodowanie" i kliknij "Oblicz" w panelu "Oblicz ustawienia rekompensaty", aby dokonać kompensacji. Kliknij "Zakończ", aby wyjść z "Kreatora wynagrodzeń".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj kontrolkę PDGFRβ-PE-FMO i kliknij "Start". Narysuj bramkę wielokątną (bramę A) wokół interesujących komórek na wykresie "Wszystkie zdarzenia".</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie wewnątrz bramki A, aby utworzyć działkę podrzędną. Zmień oś Y na DAPI i narysuj bramkę wielokątną (bramka B) wokół aktywnych (DAPI niskich) komórek. Kliknij dwukrotnie wewnątrz bramki B, aby utworzyć działkę podrzędną. Zmień oś X na FSC-H, a oś Y na FSC-W i narysuj bramkę wielokątną (bramkę C) wokół podkoszulków, aby wyeliminować dublety.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie wewnątrz bramki C, aby utworzyć działkę podrzędną. Zmień oś X na Nestin-GFP, a oś Y na PDGFRβ-PE. Kliknij przycisk "Nagraj", aby zapisać dane.</li>
	<li>Załadować próbkę i powtórzyć kroki 2.11-2.12. Po nagraniu kliknij "Pauza", aby zachować próbkę.</li>
	<li>Zdefiniuj granice bramkowania dla komórek PDGFRβ+ i Nestin-GFP+ w oparciu o kontrolę PDGFRβ-PE-FMO. Bramki rysunkowe dla populacji PDGFRβ+Nestin-GFP- i PDGFRβ+Nestin-GFP+.</li>
	<li>W sekcji "Metoda sortowania" wybierz "Probówki 2-kierunkowe" i przypisz komórki "PDGFRβ+Nestin-GFP-" i "PDGFRβ+Nestin-GFP+" odpowiednio do lewej i prawej probówki zbiorczej. Zamontuj wypełnione buforem sortującym probówki zbiorcze o pojemności 15 ml na stoliku odbioru i kliknij przycisk "Załaduj odbiór".</li>
	<li>Kliknij przycisk "Wznów", aby kontynuować działanie próbki. Kliknij "Rozpocznij sortowanie", aby zebrać komórki PDGFRβ+Nestin-GFP- (perycyty typu I) i PDGFRβ+Nestin-GFP+ (perycyty typu II).</li>
</ol>
3. Analizy po sortowaniu
<ol>
	<li>Odwirować posortowane komórki w ilości 500 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki dla perycytów (patrz tabela materiałów) i policzyć gęstość komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Perycyty nasienne typu I i typu II na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną (PDL) przy ~1 x 104 komórkach/cm2. Rosnąć w pożywce perycytowej przez 3 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>W 3 dniu zbadaj morfologię perycytów (w kontraście fazowym) i endogenną ekspresję Nestin-GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (laser wzbudzający: 488 nm, filtr wzbudzenia: 470/40 nm i filtr emisyjny: 515/30 nm). Rób zdjęcia pod obiektywem 20x (0,45 NA).</li>
	<li>Zastąp pożywkę perycytów pożywką adipogenną (mysie podłoże bazowe MSC + adipogenny suplement stymulujący) i miogenną (DMEM + 2% surowicy końskiej), aby zainicjować odpowiednio różnicowanie adipogenne i miogenne, jak opisano wcześniej20. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.</li>
	<li>Utrwal komórki w 17 dniu (14 dni po różnicowaniu adipogennym/miogennym) w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA, PFA jest czynnikiem rakotwórczym.</li>
	<li>Wykonaj immunocytochemię przeciwko perylipinie (markerowi adipocytów) i S-miozynie (dojrzałemu markerowi miotuby/włókien mięśniowych), zgodnie z opisem w poprzednich publikacjach19,20.
	<ol>
		<li>Umyj utrwalone komórki 3 razy w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać bufor blokujący (PBS uzupełniony 5% surowicą osła, 3% BSA i 0,3% Triton X-100) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Inkubować komórki z przeciwciałami przeciwko perylipinie (2 μg/ml) i/lub anty-S-miozynie (2 μg/ml) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Umyj komórki 3 razy w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować komórki z przeciwciałami przeciwko królikom Alexa 555 (4 μg/ml) i/lub Alexa555 przeciwko mysom (4 μg/ml) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj komórki 3 razy w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zamontuj komórki wybarwione immunologicznie pożywką montażową zawierającą DAPI (patrz tabela materiałów). Zbadaj ekspresję perylipidyny i S-miozyny za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (laser wzbudzający: 543 nm; wzbudzenie 540/45 nm i emisja 600/50 nm) i rób zdjęcia pod obiektywem 40X (0,60 NA).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+recruitment+after+injury%3A+lessons+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine.</a> Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Relaix, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+are+essential+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+the+cell+on+the+edge+returns+centre+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage.</a> Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).</li>
<li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Pax7+and+Pax3+in+adult+regenerative+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis.</a> J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+migration+of+myogenic+cells+injected+into+pre-irradiated+muscles+of+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice.</a> J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+myoblast+transfer%3A+a+possible+therapy+for+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies.</a> Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Tamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+CD34%2B%2F45-+and+CD34-%2F45-+stem+cells+are+situated+hierarchically+upstream+of+Pax7%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat Commun. 2, 499(2011).</li>
<li>Mitchell, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+non-satellite+cell+muscle+resident+progenitor+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development.</a> Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).</li>
<li>Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+skeletal+muscle+resident+progenitors+and+their+cell+fate+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials.</a> Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).</li>
<li>Kostallari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+the+myovascular+niche+promote+post-natal+myofiber+growth+and+satellite+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence.</a> Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li>
<li>Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+regulates+PDGFRbeta%28%2B%29+cell+stemness+and+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development.</a> Nat Commun. 7, 11415(2016).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+pluripotent+cells+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier.</a> Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+microvascular+pericytes+exhibit+multipotential+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
<li>Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28(2017).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+multitasking+cells+in+the+regeneration+of+injured%2C+diseased%2C+and+aged+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle.</a> Front Aging Neurosci. 6, 245(2014).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Perycyty to multipotencjalne komórki okołonaczyniowe 22,23 zlokalizowane na abluminalnej powierzchni naczyń włosowatych 21,26. W mięśniach szkieletowych perycyty są zdolne do różnicowania się wzdłuż szlaków adipogennych i/lub miogennych 19,20,24. Ostatnie badania ujawniły dwie subpopulacje perycytów, o różnej eks...

Dystrofia mięśniowa to zaburzenie zwyrodnieniowe mięśni, które jak dotąd nie ma skutecznego leczenia. Rozwój terapii wspomagających regenerację tkanek zawsze cieszył się dużym zainteresowaniem. Regeneracja i naprawa tkanek po uszkodzeniu zależy od rezydentnych komórek macierzystych/komórek progenitorowych1. Komórki satelitarne są zaangażowanymi miogennymi komórkami prekursorowymi, które przyczyniają się do regeneracji mięśni2,3,4,5,6,7. Ich zastosowanie kliniczne jest jednak utrudnione ze względu na ich ograniczoną migrację i niski wskaźnik przeżywalności po wstrzyknięciu, a także przez zmniejszoną zdolność różnicowania po amplifikacji in vitro8,9,10,11. Oprócz komórek satelitarnych, mięśnie szkieletowe zawierają również wiele innych populacji komórek o potencjale miogennym12,13,14,15,16, takie jak komórki śródmiąższowe dodatnie pod względem receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego beta (PDGFRβ). Istnieją dowody wskazujące, że komórki PDGFRβ+ pochodzące z mięśni są w stanie różnicować się w komórki miogenne oraz poprawiać patologię i funkcję mięśni14,17,18,19,20. PDGFRβ głównie oznacza perycyty21, które są komórkami okołonaczyniowymi o pluripotencji22,23. Oprócz PDGFRβ wiele innych markerów, w tym Neuron-Glial 2 (NG2) i CD146, jest również używanych do identyfikacji perycytów21. Należy jednak zauważyć, że żaden z tych markerów nie jest specyficzny dla pericytów21. Ostatnie badania ujawniły dwa podtypy perycytów mięśniowych, zwane typem I i typem II, które wyrażają różne markery molekularne i pełnią różne funkcje19,24,25. Biochemicznie perycyty typu I to NG2+Nestin-, podczas gdy perycyty typu II to NG2+Nestin+19,24. Funkcjonalnie perycyty typu I mogą ulegać różnicowaniu adipogennemu, przyczyniając się do akumulacji tłuszczu i/lub zwłóknienia, podczas gdy perycyty typu II mogą różnicować się wzdłuż szlaku miogennego, przyczyniając się do regeneracji mięśni19,24,25. Wyniki te pokazują, że: (1) perycyty typu I mogą być celem leczenia stłuszczeniowych zaburzeń zwyrodnieniowych/zwłóknienia oraz (2) perycyty typu II mają ogromny potencjał terapeutyczny w dystrofii mięśniowej. Dalsze badania i charakterystyka tych populacji wymagają protokołu izolacji, który umożliwia oddzielenie perycytów typu I i typu II przy wysokim poziomie czystości.
Obecnie, izolacja subpopulacji pericytów opiera się na podwójnie transgenicznych myszach NG2-DsRed i Nestin-GFP19,24. Dostępność myszy NG2-DsRed i jakość większości przeciwciał NG2 ograniczają powszechne stosowanie tej metody. Biorąc pod uwagę, że wszystkie perycyty NG2+ również wyrażają PDGFRβ w mięśniach szkieletowych19,20,24, stawiamy hipotezę, że NG2 można zastąpić PDGFRβ w celu izolacji perycytów i ich subpopulacji. W tej pracy opisano protokół oparty na FACS, który wykorzystuje barwienie PDGFRβ i sygnał Nestin-GFP. Metoda ta jest mniej wymagająca dla badaczy, ponieważ: (1) nie wymaga tła NG2-DsRed oraz (2) wykorzystuje komercyjnie dostępne przeciwciała PDGFRβ, które są dobrze scharakteryzowane. Ponadto umożliwia jednoczesną izolację perycytów typu I i typu II o wysokiej czystości, co pozwala na dalsze badania nad potencjałem biologicznym i terapeutycznym tych subpopulacji perycytów. Po oczyszczeniu komórki te można hodować w hodowli, a ich morfologię można uwidocznić. Praca ta pokazuje również, że perycyty typu I i typu II wyizolowane tą metodą, podobnie jak te oczyszczone z myszy podwójnie transgenicznych, są odpowiednio adipogenne i miogenne.

<table><tbody><tr><td>Sortownik komórek</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki automatycznej konfiguracji</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu perycytów</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Basal Medium (mysz)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenny suplement stymulujący (mysz)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna/EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;-PE Przeciwciało</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało perylopiny</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało S-Myozyny</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-przeciwciało anty-królicze& nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-przeciwciało przeciw myszom</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G Igła</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serologiczna</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp</td><td>eBeads eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja perycytów typu i i typu ii z mięśni szkieletowych myszy

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Perycyty to okołonaczyniowe komórki multipotencjalne, które wykazują niejednorodność w różnych organach lub nawet w tej samej tkance. W mięśniach szkieletowych istnieją co najmniej dwie subpopulacje perycytów (zwane typem I i typem II), które wyrażają różne markery molekularne i mają wyraźne zdolności różnicowania. Używając podwójnie transgenicznych myszy NG2-DsRed i Nestin-GFP, udało się wyizolować perycyty typu I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) i typu II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+). Jednak dostępność tych podwójnie transgenicznych myszy uniemożliwia powszechne stosowanie tej metody oczyszczania. W pracy opisano alternatywny protokół, który pozwala na łatwą i jednoczesną izolację perycytów typu I i typu II od mięśni szkieletowych. Protokół ten wykorzystuje technikę sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i jest ukierunkowany na PDGFRβ, a nie NG2, wraz z sygnałem Nestin-GFP. Po izolacji perycyty typu I i typu II wykazują odrębną morfologię. Ponadto perycyty typu I i typu II wyizolowane tą nową metodą, podobnie jak te wyizolowane od myszy podwójnie transgenicznych, są odpowiednio adipogenne i miogenne. Wyniki te sugerują, że protokół ten może być stosowany do izolowania subpopulacji perycytów od mięśni szkieletowych i ewentualnie od innych tkanek.

Parametry FACS, w tym intensywność lasera i kompensacja kanałów, są korygowane na podstawie wyników kontroli niebarwionej oraz kontroli jednobarwnych. Kontrola PDGFRβ-PE-FMO służy do ustawienia bramkowania dla populacji PDGFRβ-PE+ (Rysunek 1A). Wśród komórek PDGFRβ-PE- wyraźnie oddzielone są dwie populacje reprezentujące komórki Nestin-GFP+ oraz Nestin-GFP- (Rysunek 1A). Granice bramkow...

Ta praca opisuje protokół oparty na FACS, który pozwala na łatwą i jednoczesną izolację perycytów typu I i II od mięśni szkieletowych.

Izolacja perycytów typu I i typu II z mięśni szkieletowych myszy

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja subpopulacji pericytów z mięśni szkieletowych przy użyciu metody FACS. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii pericytów, takie jak: jaka jest różnica biologiczna między pericytami typu I a pericytami typu II? Główną zaletą tego protokołu jest możliwość jednoczesnej izolacji pericytów typu I i typu II bez konieczności stosowania transgenu NG2 dsRED.Zastosowania niniejszego protokołu nie ograniczają się do mięśni szkieletowych. Można go również wykorzystać do izolacji perycytów z innych organów, takich jak mózg. W celu rozpoczęcia procedury należy najpierw pobrać pożądaną tkankę z transgenicznej myszy nestin-GFP, a następnie dwukrotnie przemyć tkankę lodowatym PBS zawierającym antybiotyki.Następnie przenieś próbki na sterylną płytkę 10-centymetrową. Potem, używając sterylnych nożyczek i ostrzy, potnij mięśnie na drobne kawałki o rozmiarach od jednego do dwóch milimetrów sześciennych. W razie potrzeby dodaj niewielką ilość DMEM, aby zapobiec wysychaniu tkanki.Pobieraj i wydmuchuj tkankę za pomocą pipety serologicznej 10 mm, aby rozbić ją mechanicznie. Następnie do mieszaniny dodaj świeży roztwór trawien

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje metodę izolowania perycytów mózgowych od mózgu myszy. Wyizolowane komórki są hodowane w pożywkach specyficznych dla perycytów w celu promowania proliferacji perycytów.

Izolowanie i hodowla perycytów mózgowych myszy

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Opracowaliśmy nowatorską i powtarzalną technikę izolowania pierwotnych kultur komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej (PASMC) od myszy w wieku P7, umożliwiając tym samym lepsze badanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w skurcz i rozluźnienie komórek mięśni gładkich noworodków.

Izolacja komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej od nowonarodzonych myszy

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Przedstawiamy protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych. Protokół ten, oparty na ekstrakcji perycytów zorientowanej na wzbogacanie bez antybiotyków, jest cennym narzędziem do badań in vitro, zapewniając wysoką czystość i wysoką wydajność, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.

Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Aby uzyskać perycyte kory mózgowej myszy spełniające wymagania scRNA-seq, przedstawiamy krytycznie zoptymalizowany protokół FACS oparty na selekcji CD13⁺/CD31⁻. Nasze kluczowe udoskonalenia znacząco poprawiają żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając niezawodne profilowanie transkryptomowe.

Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj protokół FACS do jednoczesnej izolacji perycytów typu I i II z mięśni szkieletowych myszy. Ta metoda umożliwia badanie różnic biologicznych między podpopulacjami komórek bez użycia transgenu NG2 dsRED.

Izolacja perycytów typu I i typu II z mięśni szkieletowych myszy

Przeglądaj więcej filmów