Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest efektywne przeprowadzenie immunoprecypitacji chromatyny w liniach komórek T myszy z wysoką powtarzalnością w rozsądnym czasie, w celu zbadania rozkładu modyfikacji histonowych w konkretnych regionach genomowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii chromatyny, ze szczególnym uwzględnieniem komórek T, takie jak sposób regulacji struktury chromatyny podczas podziału lub aktywacji komórek T. Główną zaletą tej techniki jest efektywne i wysoce powtarzalne fragmentowanie chromatyny.

Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ warunki ścinania chromatyny są trudne do ustalenia, a etapy z użyciem fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego mogą być problematyczne. Procedurę zaprezentuje Francesca Ferrante, doktorantka w naszym laboratorium. Pierwszego dnia przenieś limfocyty T myszy z płytki sześciodołkowej do probówki o pojemności 50 ml.

Następnie odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 24 °C przy przyspieszeniu około 271 ×g. Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w 30 ml pożywki do hodowli komórek IMDM, policz komórki za pomocą komory Neubauera. Przenieś alikwoty zawierające 20 milionów komórek do nowych probówek o pojemności 50 ml. Następnie dodaj formaldehyd do stężenia końcowego 1% bezpośrednio do pożywki hodowlanej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.

Następnie dodaj 1/8 objętości roztworu glicyny 1 M o pH 7,5 i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 24 °C przy przyspieszeniu około 271 ×g. Następnie przemyj komórki, resuspendując osad komórkowy w 10 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i powtarzając wirowanie. Przemyj komórki ponownie 1 ml PBS.

Przeniesienie resuspenderowanych komórek do probówek o pojemności 1,5 ml przed wirowaniem. Ścinanie chromatyny jest najbardziej krytycznym etapem, ponieważ zależy od liczby komórek, rodzaju probówek do ścinania, urządzenia i buforu do lizy, a także od parametrów ścinania. Po przemyciu resuspenderować osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy SGS i inkubować na lodzie.

Po 10 minutach przenieś każdą próbkę do probówki do sonikacji. Następnie przeprowadź ścinanie za pomocą sonikatora skupionego zgodnie z ustawieniami wskazanymi w protokole tekstowym. Po ścinaniu przenieś próbki do probówek o pojemności 1,5 mililitra.

Wirować przez 10 minut w temperaturze 4°C przy przyspieszeniu około 18 000 ×g. Następnie przenieść supernatant do nowych probówek. Odobrać 50 µL w celu oznaczenia wydajności ścinania, a ścięty lizat zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie. Przechowywać lizat w jednorazowych aliquotach w temperaturze -80°C.

Aby określić wydajność ścinania, najpierw należy dodać 50 µL buforu elucyjnego do 50 µL każdego ścinanego lizatu. Mieszaniny inkubować w temperaturze 65 °C przez noc z wytrząsaniem. Drugiego dnia do próbek dodać 100 µL buforu TE oraz 4 µL RNazy A o stężeniu 10 mg/mL.

Wymieszać próbki i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Następnie do każdej próbki dodać 2 µL proteinazy K o stężeniu 20 mg/mL, a następnie inkubować przez dwie godziny w temperaturze 55 °C z wytrząsaniem. Następnie przenieść każdą próbkę do probówki z żelem odpowiedniej do ekstrakcji fenol-chloroform-alkohol izoamylowy.

Postępuj z probówkami zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj 200 µL fenolo-chloroformu i alkoholu izoamylowego, a następnie potrząśnij probówkami. Po wirowaniu przenieś górną fazę do nowych probówek.

Powtórz ten proces raz. Oczyść DNA, używając kolumn oczyszczających zgodnie z instrukcjami producenta, z wyjątkiem etapu płukania membrany, którą należy przepłukać dwukrotnie. Po ostatnim płukaniu pozostaw otwartą probówkę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby odparować pozostały etanol.

W celu elucji należy dodać do kolumny 50 µL wody i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Następnie należy odwirować probówkę przez jedną sekundę, aby odpowiednio zwilżyć membranę. Przed elucją DNA metodą odśrodkowania membranę należy inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Ilościowo określ zawartość oczyszczonego DNA za pomocą fluorometru, stosując zestaw o wysokiej czułości zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie przeanalizuj około 500 nanogramów oczyszczonego DNA na żelu agarozy 1,8%. Około jednego nanograma oczyszczonego DNA przeanalizuj w systemie elektroforezy, wykorzystując zestaw o wysokiej czułości.

W trzecim dniu rozcieńczyć jedną objętość ścinanego lizatu pięcioma objętościami buforu do rozcieńczania. Przeprowadzić wstępne oczyszczanie rozcieńczonego lizatu przy użyciu kulek agarozowych z białkiem A w ilości 30 µL na 1 mL lizatu przez 30 minut w rotatorze w pomieszczeniu chłodniczym. Próbki odwirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy przyspieszeniu około 750 ×g. Pobrać 10% oczyszczonego lizatu jako próbki wejściowe i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Następnie przelej odpowiednią ilość oczyszczonego lizatu do nowych probówek. Do każdej probówki dodaj wybrane przeciwciała i inkubuj w rotatorze przez noc w temperaturze 4 °C. Czwartego dnia dodaj 40 µL kulek z białkiem A.

Mieszaninę inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 4°C przy jednoczesnym obracaniu. Kuleczki przemyć 1 mL buforu o niskiej zawartości soli, inkubując przez pięć minut w temperaturze 4°C przy obracaniu. Następnie odwirować przez trzy minuty w temperaturze 4°C przy przyspieszeniu około 950 ×g. Powtórzyć proces płukania, używając kolejno buforu o wysokiej zawartości soli, buforu z chlorkiem litu oraz buforu TE.

Następnie dodaj 110 µL buforu elucyjnego do próbek. Inkubuj je przez 15 minut w temperaturze pokojowej, mieszając próbki na wirówce typu vortex co dwie minuty. Po ponownym odwirowaniu przenieś 100 µL supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.

Powtórz elucję, używając 100 µL buforu do elucji, a następnie połącz eluaty. W międzyczasie dodaj bufor do elucji do wcześniej zebranych próbek wejściowych, aby uzyskać końcową objętość 200 µL. Wszystkie próbki inkubuj przez noc w temperaturze 65 °C z wytrząsaniem.

Piątego dnia do każdego eluatu należy dodać 200 µL buforu TE oraz 8 µL RNazy A w stężeniu 10 mg/mL. Próbki należy wymieszać przed inkubacją przez dwie godziny w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym wstrząsaniu. Następnie do każdego eluatu dodaje się 4 µL proteinazy K w stężeniu 20 mg/mL przed inkubacją przez dwie godziny w temperaturze 55 °C przy wstrząsaniu. Kolejno każdą próbkę przenosi się do probówki żelowej odpowiedniej do ekstrakcji fenol-chloroform-izoamylokoholowej.

Dodaj 400 µL fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego, a następnie wymieszaj zawartość probówek. Po odwirowaniu probówek przenieś górną fazę do nowych probówek i powtórz ten proces raz. Na koniec oczyść DNA, korzystając z kolumn do oczyszczania, jak wcześniej.

Ten reprezentatywny wynik ścinania linii komórkowych limfocytów T myszy wykazuje efektywną fragmentację chromatyny. Przedstawiono tutaj reprezentatywny eksperyment immunoprecypitacji chromatyny w liniach komórkowych limfocytów T myszy. Promotor genu konstytutywnego dehydrogenazy glikolowej 3-fosforanu gliceraldehydu jest silnie wzbogacony w trymetylację lizyny czwartej w histonie trzech.

Oraz acetylacja lizyny 27 histony 3. Jednak nie w przypadku monometylacji lizyny 4 histony 3. Odwrotnie, enhancer nieaktywnego genu deltex-1 jest silnie wzbogacony o monometylację lizyny 4 histony 3.

Jednakże uzyskano słabe wzbogacenie wyjątkowo dla trimetylacji lizyny 4 histony 3 oraz acetylacji lizyny 27 histony 3. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o rozpuszczeniu osadów SGS przed poddaniem próbek ścinaniu.

Pomysł na tę metodę pojawił się podczas badania regulacji genów w limfocytach T. Wybraliśmy limfocyty T, ponieważ mają one duże znaczenie dla zastosowań medycznych i stanowią jeden z najlepiej opisanych systemów modelowych do badania ekspresji genów u eukariontów wyższych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii chromatyny do zgłębiania regulacji chromatyny w systemach ssaków.

Zastosowania tej techniki obejmują terapię chorób związanych z limfocytami T, ponieważ pozwala ona na analizę tworzenia i regulacji programów ekspresji genów w tych komórkach. Należy pamiętać, że praca z formaldehydem, fenolem, chloroformem i alkoholem izoamylowym wiąże się z dużym ryzykiem, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem i stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego. Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o regulacji chromatyny w limfocytach T myszy, można ją również zastosować w innych układach, takich jak linie komórkowe śródbłonka i komórki płuc.