Name: Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj zintegrowany potok do projektowania i analizy mikromacierzy peptydowych w celu profilowania swoistości przeciwciał histonowych. Ta metoda poprawia kontrolę jakości w badaniach epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez Instytut Badawczy Van Andel oraz grant badawczy z National Institutes of Health (CA181343) dla S.B.R.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niezawodność przeciwciał w zastosowaniach badań biomedycznych jest najważniejsza 46,47. Jest to szczególnie prawdziwe w biochemii chromatyny, biorąc pod uwagę pozycję przeciwciał jako kluczowych narzędzi dla większości technik opracowanych w celu scharakteryzowania obfitości i dystrybucji histonów PTM. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowany proces projektowania, wytwarzania i stosowania mikromacierzy peptydowych do analizy swoistości prz...

Kwas DNA genomowy jest w elegancki sposób upakowany w jądrze komórkowym eukariotów wraz z białkami histonowymi, tworząc chromatynę. Powtarzającą się podjednostką chromatyny jest nukleosom, który składa się ze 147 par zasad DNA owiniętych wokół rdzenia oktamerowego białek histonowych – H2A, H2B, H3 oraz H41. Chromatyna jest ogólnie zorganizowana w luźno upakowane domeny euchromatyny oraz gęsto upakowane domeny heterochromatyny. Stopień kondensacji chromatyny reguluje zakres, w jakim aparaty białkowe mogą uzyskać dostęp do leżącego u podstawy DNA, aby przeprowadzić fundamentalne procesy matrycowe DNA, takie jak replikacja, transkrypcja i naprawa.
Kluczowymi regulatorami dostępności genomu w kontekście chromatyny są PTM w obrębie nieustrukturyzowanych ogonów oraz domen rdzeniowych białek histonowych2,3. PTM histonów działają bezpośrednio, wpływając na strukturę chromatyny4, oraz pośrednio poprzez rekrutację białek czytających (reader proteins) i powiązanych z nimi kompleksów makromolekularnych o aktywnościach remodelujących chromatynę, enzymatycznych i rusztowaniowych5. Badania nad funkcją PTM histonów prowadzone w ciągu ostatnich dwóch dekad w przeważającej mierze sugerują, że modyfikacje te odgrywają kluczową rolę w regulacji losu komórek, rozwoju organizmu oraz inicjacji i progresji chorób. Dzięki postępom w technologiach proteomicznych opartych na spektrometrii mas odkryto ponad 20 unikalnych PTM histonów w ponad 80 różnych resztach histonowych6. Co istotne, modyfikacje te często występują w kombinacjach, a zgodnie z hipotezą „kodu histonowego”, liczne badania sugerują, że białka czytające są kierowane do konkretnych regionów chromatyny poprzez rozpoznawanie specyficznych kombinacji PTM histonów7,8,9. Kluczowym wyzwaniem na przyszłość będzie przypisanie funkcji rosnącej liście PTM histonów oraz określenie, w jaki sposób specyficzne kombinacje tych modyfikacji koordynują dynamiczne funkcje związane z chromatyną.
Przeciwciała są kluczowymi odczynnikami w detekcji PTM histonów. W związku z tym komercyjnie opracowano ponad 1000 przeciwciał specyficznych dla PTM histonów do zastosowań w badaniach nad biochemią chromatyny. Dzięki szybkiemu rozwojowi technologii wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA, odczynniki te są szeroko wykorzystywane przez poszczególnych badaczy oraz w ramach wielkoskalowych inicjatyw „mapowania” epigenomiki (np. ENCODE i BLUEPRINT) w potokach analiz ChIP-seq (immunoprecypitacja chromatyny połączona z sekwencjonowaniem nowej generacji) w celu generowania wysokorozdzielczych map przestrzennych rozkładu PTM histonów w całym genomie10,11. Jednakże niedawne badania wykazały, że specyficzność przeciwciał przeciwko PTM histonów może być bardzo zmienna, a odczynniki te wykazują niepożądane właściwości, takie jak rozpoznawanie epitopów pozacelowych, silny wpływ dodatni i ujemny sąsiednich PTM oraz trudność w rozróżnianiu stopnia modyfikacji konkretnego reszty (np. mono-, di- lub tri-metylolizyny)12,13,14,15,16,17,18. Dlatego konieczna jest rygorystyczna kontrola jakości przeciwciał specyficznych dla PTM histonów, aby dokładnie interpretować dane generowane za pomocą tych cennych odczynników.
Technologia mikromacierzy umożliwia jednoczesną analizę tysięcy oddziaływań makromolekularnych w formacie wysokoprzepustowym, powtarzalnym i zminiaturyzowanym. Z tego powodu stworzono różnorodne platformy mikromacierzy do analizy oddziaływań białko-DNA19,20, białko-białko 21 oraz białko-peptyd22. W szczególności mikromacierze peptydów histonowych stały się informacyjną platformą odkrywczą w badaniach nad biochemią chromatyny, umożliwiając wysokoprzepustowe profilowanie enzymów zapisujących (writers), usuwających (erasers) i odczytujących (readers) PTM histonów15,23,24, a także analizę swoistości przeciwciał antyhistonowych17,25. Poza zastosowaniem w badaniach nad chromatyną i epigenetyką, macierze peptydów histonowych wykazują potencjalną użyteczność jako test diagnostyczny/prognostyczny w toczniu układowym i innych chorobach autoimmunologicznych, w których powstają autoprzeciwciała przeciwko chromatynie26,27.
W niniejszej pracy opisujemy zintegrowany schemat postępowania, który opracowaliśmy w celu projektowania, wytwarzania i badania mikromacierzy peptydów histonowych, aby generować profile specyficzności przeciwciał rozpoznających histony oraz ich modyfikacje potranslacyjne (PTM). Proces ten jest wspierany przez ArrayNinja — opracowaną przez nas niedawno, interaktywną aplikację otwartoźródłową, która integruje etapy projektowania i analizy eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy28. ArrayNinja działa najlepiej w przeglądarce Google Chrome. W skrócie, zrobotyzowany drukarka mikromacierzy kontaktowej jest wykorzystywana do nanoszenia biblioteki biotynylowanych peptydów histonowych w określonych pozycjach na szklanych przedmiotach mikroskopowych powlekanych streptawidyną. Macierze mogą być następnie wykorzystywane w formacie testów konkurencyjnych i równoległych do badania oddziaływań przeciwciało-epitop (Rycina 1). Biblioteka peptydów składa się z setek unikalnych syntetycznych peptydów zawierających PTM (acetylację lizyny, metylację lizyny/argininy oraz fosforylację seryny/treoniny) pojedynczo oraz w odpowiednich kombinacjach, w dużej mierze pochodzących z zestawów danych proteomicznych. Metody syntezy i walidacji peptydów zostały szczegółowo opisane w innej publikacji23. Dane generowane z naszych bieżących wysiłków w zakresie przesiewania przeciwciał przeciwko PTM histonów z wykorzystaniem tej platformy macierzowej są archiwizowane w publicznym zasobie internetowym, bazie danych Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Co istotne, mikromacierze peptydów histonowych wytworzone z zastosowaniem wariantów tego protokołu były również szeroko wykorzystywane do charakterystyki aktywności domen odczytujących PTM histonów8,29,30,31,32,33,34,35,36,37, a ostatnio do profilowania aktywności enzymów zapisujących (writer) i usuwających (eraser) PTM histonów24.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie etapowej procedury przesiewania przeciwciał na mikrotablicy peptydów histonowych. Biotynilowane peptydy histonowe posiadające określone modyfikacje potranslacyjne (czerwone i niebieskie kółka) są współdrukowane z biotyna-fluoresceiną na szkle pokrytym streptawidyną. Pozytywne interakcje są wizualizowane jako czerwona fluorescencja. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Drukowanie Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe powlekane streptawidyną</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>polipropylen 384 dołkowa</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-fluoresceina</td><td>Kontaktowa</td> drukarka mikromatrycowa Sigma <td>53608</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Drukarka mikrotablicowa</td></tr><tr><td>Kontaktowa drukarka mikrotablicowa</td><td>Gene Machines</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Drukarka mikrotablicowa</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Blokująca</td><td>tablica</td> buforowa <td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowy długopis woskowy</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge Hydrofobowa bariera PAP Pen</td></tr><tr><td>Silikon Uszczelka</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hybrydyzacyjne</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>lub podobne naczynie</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (anty-królik)</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (anty-mysie)</td></tr><tr><td>Wosk Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Skaner mikromacierzy</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>lub równoważny skaner mikromacierzy</td></tr><tr><td>EipTitan Histone Peptide</td><td>Microarray Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified Histone Peptide Array</td><td>Active Motif</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Histone Code Mikrotablice peptydowe</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>Wax</td><td>Royal Oak</td><td>GulfWax</td><td>do drukarki woskowej</td></tr><tr><td>Nawilżana komora hybrydyzacyjna Microarray Slide</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>Wysokoprzepustowa komora do mycia szkiełek mikroskopowych</td><td>Mikroskop ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td> wirówka szkiełkowa</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 2</td><td>Milipory</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany peptyd histonowy</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>Przykładowy peptyd. Podobne peptydy z różnymi modyfikacjami są dostępne w kilku komercyjnych źródłach.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek histonowych są szeroko badane pod kątem ich roli w regulacji struktury chromatyny i ekspresji genów. Masowa produkcja i dystrybucja przeciwciał specyficznych dla histonów PTM znacznie ułatwiła badania nad tymi znakami. Ponieważ przeciwciała histonowe PTM są kluczowymi odczynnikami do wielu zastosowań biochemii chromatyny, rygorystyczna analiza swoistości przeciwciał jest niezbędna do dokładnej interpretacji danych i dalszego postępu w tej dziedzinie. Protokół ten opisuje zintegrowany proces projektowania, wytwarzania i stosowania mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał histonowych. Aspekty projektowania i analizy tej procedury są ułatwione przez ArrayNinja, interaktywny pakiet oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym, który niedawno opracowaliśmy w celu usprawnienia dostosowywania formatów drukowania mikrotablic. Rurociąg ten został wykorzystany do badań przesiewowych dużej liczby komercyjnie dostępnych i szeroko stosowanych przeciwciał histonowych PTM, a dane wygenerowane z tych eksperymentów są swobodnie dostępne za pośrednictwem internetowej i rozszerzającej się bazy danych swoistości przeciwciał histonowych. Poza histonami, ogólna metodologia opisana w niniejszym dokumencie może być szeroko stosowana do analizy przeciwciał specyficznych dla PTM.

Niniejszy protokół został wykorzystany do zaprojektowania i wykonania platformy mikromacierzy peptydowej służącej do analizy specyficzności przeciwciał przeciwko PTM histonów. Macierz analizuje bibliotekę ponad 300 unikalnych cech peptydowych (o długości od 20 do 40 reszt), reprezentujących wiele znanych kombinacji PTM występujących w rdzeniowych i wariantowych białkach histonowych38. Ten schemat postępowania stanowił podstawowe narzędzie do przesiewania wielu pows...

Ten manuskrypt opisuje metody zastosowania technologii mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających histony i ich potranslacyjne modyfikacje.

Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Celem niniejszego filmu jest opis zintegrowanego procesu projektowania, wytwarzania i stosowania mikrotablic peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał przeciwko histonom. Przeciwciała rozpoznające histony oraz ich różnorodne modyfikacje potranslacyjne są kluczowymi odczynnikami w badaniach nad biochemia chromatyny. Opieramy się na tych narzędziach, aby pogłębić naszą wiedzę na temat funkcji modyfikacji histonów.Niedawne badania ujawniają niespójności w działaniu przeciwciał przeciwko histonom. Ponieważ wybór przeciwciała jest najkrytyczniejszym elementem eksperymentów epigenetycznych, wymagane są rygorystyczne i kompleksowe środki kontroli jakości dla tych odczynników. W niniejszej pracy prezentujemy opracowany przez nas zintegrowany schemat projektowania, wytwarzania i analizy mikrociągów peptydowych w celu generowania profili specyficzności przeciwciał rozpoznających histony oraz ich modyfikacje potranslacyjne.Proces ten jest wspierany przez Array Ninja, opracowaną przez nas interaktywną aplikację programistyczną o otwartym kodzie źródłowym, która integruje etapy projektowania i analizy eksperymentów z macierzyjami mikroarray. Aby rozpocząć projektowanie płytki z mac

analysis-of-histone-antibody-specificity-with-peptide-microarrays

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.

Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

Tablice peptydowe syntetyzowane metodą SPOT mogą być używane do analizy specyficzności substratowej metylotransferaz lizynowych białek (PKMT) oraz do zdefiniowania spektrum substratów PKMT, aby zrozumieć ich biologiczną rolę. Protokół ten opisuje, jak syntetyzować macierze peptydowe, metylować je za pomocą PKMT i analizować wyniki.

Analiza swoistości metylotransferaz lizyny białkowej przy użyciu macierzy peptydowych SPOT

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Niezgodności w sekwencjach ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) między parami dawców i biorców narządów są główną przyczyną odrzucenia przeszczepu narządów za pośrednictwem przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niestandardowych macierzy antygenowych, które są oparte na sekwencjach HLA poszczególnych dawców, do badania alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcom u biorców narządów.

Spersonalizowane macierze peptydowe do wykrywania alloprzeciwciał HLA w przeszczepach narządów

W tym protokole opisujemy technikę wykrywania peptydów diagnostycznych specyficznych dla wirusa Zika za pomocą mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości. Protokół ten można łatwo dostosować do innych pojawiających się chorób zakaźnych.

Odkrycie epitopu diagnostycznego specyficznego dla wirusa Zika

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Warianty genetyczne u członka rodziny Spindlin 4 (SPIN4) zostały niedawno zidentyfikowane u pacjentów z przerostem kości, co jest nowym zaburzeniem rozwojowym. Przedstawiono protokół oraz nowe wyniki opisujące biochemiczną identyfikację zmodyfikowanych histonów w kontekście nukleosomów jako substratów wiążących SPIN4.

Identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (SPIN4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów

Poznaj zintegrowany potok do projektowania i analizy mikromacierzy peptydowych w celu profilowania swoistości przeciwciał histonowych. Ta metoda poprawia kontrolę jakości w badaniach epigenetycznych.

Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi

Przeglądaj więcej filmów