Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja i ilościowe określenie czynnika von Willebranda lub tworzenia się sznurka płytkowego VWF w odpowiedzi na wydzielanie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii czynnika von Willebranda i patofizjologii ciała wawo-paliatywnego. Pomaga nam również odpowiedzieć na pytania dotyczące mutacji, które upośledzają uwalnianie czynnika von Willebranda i funkcję wiązania płytek krwi.

Główną zaletą tej techniki jest to, że podsumowuje ona interakcje in vivo między kolagenem subśródbłonkowym, komórkami endoetolialnymi VWF i płytkami krwi w wizualnym i mierzalnym systemie in vitro. Uważam, że wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna. Wymagane kroki mikroskopowe do uchwycenia tworzenia się pasma płytek krwi VWF w wielu jednoczesnych warunkach w czasie rzeczywistym mogą być trudne do opanowania za pomocą samego tekstu.

Zacznij od załadowania 0,5 mililitra buforu do kolagenowej strzykawki typu luer lock o pojemności 1 mililitra. Przekręcić koniec strzykawki na zbiornik szkiełka z komorą przepływową i powoli wciskać tłok, aż cała ścieżka zostanie pokryta, a każdy zbiornik będzie pełny. Uzupełnij zbiorniki, aby upewnić się, że każdy z nich jest pełny.

Po załadowaniu wszystkich torów inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby usunąć bufor kolagenowy. Następnie przepłucz każdą linię HBSS, odsysając sól fizjologiczną pipetą o pojemności 200 mikrolitrów.

Po odrzuceniu trzeciej rundy HBSS dodaj około trzy razy 10 do 6. komórek śródbłonka wzrostu krwi na mililitr w 100 mikrolitrach pożywki wzrostowej, uzupełnionej 10% FBS do każdego pasma komory przepływowej. Następnie umieść komorę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny, zmieniając pożywkę co osiem do 12 godzin. Aby zmontować aparat przepływowy, najpierw przymocuj jedno męskie złącze kolankowe luer do jednego końca każdego z trzech 70-centymetrowych kawałków sterylnej rurki silikonowej.

I przymocuj jeden żeński adapter luer lock do drugiego końca każdej rurki. Podłącz żeńskie adaptery luer lock do indywidualnych strzykawek o pojemności 20 mililitrów i zaprogramuj pompę strzykawkową. Załadować strzykawki do pompy i szczelnie zamocować wsporniki wokół strzykawek i tłoków.

Następnie przymocuj pojedyncze męskie luery łokciowe do obu końców trzech różnych 20-centymetrowych kawałków sterylnej silikonowej rurki i podłącz igłę o rozmiarze 18 do jednego z trzech luerów łokciowych. Następnie na mikroskopie z wirującym dyskiem wyposażonym w w pełni zautomatyzowany stolik wybierz obiektyw 20x i ustaw odpowiednie ustawienia kanału. Aby uzyskać pełny zakres danych dynamicznych, ustaw urządzenie sprzężone z ładunkiem mnożącym elektrony na wzmocnienie mnożenia elektronów wynoszące 150 przy czasie ekspozycji 200 milisekund.

Dostosuj moc lasera 491 nanometrów do 20% i użyj oprogramowania mikroskopu, aby zaznaczyć środek wszystkich trzech pasów. Ustaw zakres Z na 1,0 mikrometra, a rozmiar kroku na 0,5 mikrometra. Na koniec wybierz czas trwania i interwał, aby przechwytywać obraz co 10 sekund w 60 punktach czasowych na slajd.

Aby wywołać tworzenie się łańcuchów płytek krwi VWF, należy zastąpić pożywkę hodowlaną z trzech torów komory przepływowej, samą pożywką bezsurowicową jako kontrolą, a następnie interesujący nas stymulant rozcieńczyć w 100 mikrolitrach pożywki bez surowicy na dodatkowe pasy. Następnie inkubuj komorę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu stymulacji umyj wszystkie trzy pasy 100 do 200 mikrolitrami PBS i użyj klipsów naczyniowych, aby odwzorować komorę przepływu na stojaku do szkiełka.

Podłącz jedno męskie złącze luer od końca kawałka 70-centymetrowej rurki do każdego zbiornika komory przepływowej. I uruchom pompę strzykawkową, aby usunąć płyn do płukania PBS. Odpipetuj dodatkowe PBS do zbiornika przeciwległej komory przepływu, aby upewnić się, że pasy nie wyschną.

Po potwierdzeniu równoważnego przepływu wstrzymać pompę strzykawkową. Podłącz strzykawkę o średnicy 5 mililetów z żeńskim łącznikiem luer lock do pierwszego wolnego męskiego złącza luer. I zanurz igłę w 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki zawierającej znakowany fluorescencyjnie przemyty roztwór płytek krwi.

Powoli wciągać roztwór płytek krwi przez rurkę, aby upewnić się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. Podłącz męskiego luera do otwartego zbiornika komory przepływowej i załaduj pozostałe dwa pasy roztworem płytkowym, jak właśnie pokazano. Sprawdź konfigurację systemu przepływu, aby upewnić się, że wszystkie połączenia są bezpieczne.

Uruchom ponownie pompę strzykawkową i obserwuj przepływ płytek krwi przez 10 minut w ciemności. Następnie odłącz luer od rurki dolotowej w zbiorniku komory przepływowej. I napełnij zbiornik PBS, aby utrzymać delikatny przepływ soli fizjologicznej przez monowarstwę komórek śródbłonka.

Aby określić ilościowo tworzenie się VWF i pasma płytek krwi, należy wykonać 10 obrazów na szkiełku z każdego pasa bez nakładania się od środka szkiełka. Po uzyskaniu wszystkich obrazów otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu i kliknij obraz, regulacja i kontrast jasności. Aby dostosować jasność pierwszego obrazu, przeciągnij pasek przewijania, aż przylegające płytki krwi będą widoczne wystarczająco dobrze do określenia ilościowego.

Następnie nagraj ciąg płytek VWF, gdy zaobserwuje się trzy lub więcej wyrównanych płytek krwi i policz wszystkie ciągi na obrazie. Po zainicjowaniu warunków przepływu, nieleczone komórki wykazują bardzo mało pasm płytek krwi VWF w porównaniu z komórkami traktowanymi histaminą lub PMA. Które wykazują średnio od dwóch do trzech strun na pole widzenia.

Co więcej, histony, które aktywują płytki krwi, a także komórki śródbłonka, indukują produkcję większej liczby łańcuchów płytek VWF niż nieleczone lub kontrole stymulowane histaminą lub PMA. Próbując wykonać tę procedurę, utrzymuj płytki krwi w stanie spoczynku do czasu eksperymentu z przepływem, odrzucając pierwszą probówkę do pobierania krwi, utrzymując wszystkie odczynniki w temperaturze pokojowej i stosując delikatną technikę pipetowania. W tej procedurze można wprowadzić modyfikacje w celu oceny tworzenia się łańcucha płytek krwi VWF w obecności leukocytów, środków aktywujących płytki krwi lub rozpuszczania strun przez atom enzymu rozszczepiającego TS13.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić indukowane sekretogogą tworzenie się VWF-łańcucha płytkowego i model komory przepływu in vitro.