Name: Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę badania uwalniania czynnika von Willebranda i tworzenia się sznurków płytkowych pod wpływem naprężenia ścinającego w układzie komory przepływowej in vitro. Technika ta pozwala wizualizować i ilościowo oceniać interakcje VWF z płytkami krwi w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alison Michels jest laureatką stypendium Fredericka Bantinga i Charlesa Besta dla absolwentów Kanady od Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR). Laura L. Swystun jest laureatką stypendium CIHR. David Lillicrap jest laureatem Kanadyjskiej Katedry Badawczej w dziedzinie Hemostazy Molekularnej. Badanie to zostało częściowo sfinansowane z grantu operacyjnego CIHR (MOP-97849).

Te badania zostały zatwierdzone przez Radę Etyki Badań Queen's University w Kanadzie.
1. Stymulacja komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Pokryj kolagenem 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej.
	<ol>
		<li>24 godziny wcześniej pokryć 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C 1 ml buforu kolagenowego (50 μg/ml kolagenu typu 1 z ogona szczura z 0,02 M lodowatym kwasem octowym).</li>
		<li>Umyj studzienki dwukrotnie 2 ml Zbilansowanego Roztworu Soli Hanka (HBSS). 
		UWAGA: Talerze można zawijać w folię aluminiową i przechowywać w hermetycznej plastikowej torbie w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewać komórki śródbłonka o gęstości 1 x 106 komórek na studzienkę w 2 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C (5% CO2 ). 
	UWAGA: W tym przypadku wykorzystano komórki śródbłonka wyrostka krwi (BOEC) między pasażami 5 i 15. BOEC wyizolowano od zdrowych ochotników z sekwencją VWF typu dzikiego przy użyciu metody, do której odwołują się Starke i wsp.22 w sposób podobny do wcześniej opisanego przez JoVE23.</li>
	<li>Po 24 godzinach usunąć pożywkę i umyć komórki HBSS.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki bez surowicy (minimalna niezbędna pożywka wzrostowa bez FBS) zawierającej 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA; 100 nM), niefrakcjonowany histon (UH) i HK lub HR (wszystkie w stężeniu 25 μg/ml) do komórek przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (5% CO2). 
	UWAGA: To stężenie histonu zostało oparte na wcześniejszych raportach cytotoksyczności in vitro autorstwa Xu i wsp.24 oraz Abrams et al. 25, który używał 50 μg/ml.</li>
	<li>Po 2 godzinach zebrać pożywkę i przechowywać ją w temperaturze -20 °C do czasu analizy.</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja VWF za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)
<ol>
	<li>Pokryć mikropłytkę 100 μl buforu powlekającego (10 mM dwuzasadowego fosforanu sodu i 145 mM chlorku sodu, pH 7,2) zawierającego 10 μg/ml poliklonalnego przeciwciała anty-VWF przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć płytkę trzykrotnie 250 μl buforu do przemywania (10 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu i 0,1% Tween 20, pH 7,2).</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki podłoża w stosunku 1:2 i 1:4 buforem do przemywania i użyć normalnej plazmy referencyjnej dla krzywej wzorcowej, zaczynając od rozcieńczenia 1:10.</li>
	<li>Płytkę 100 μl rozcieńczonych próbek i wzorców przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj płytkę trzykrotnie 250 μl buforu do mycia.</li>
	<li>Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-VWF, sprzężonego z HRP (1,1 μg/μL w buforze do płukania) do płytki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć płytkę i inkubować przez 10 minut z odczynnikiem Dichlorowodorek O-fenylenodiaminy (OPD), zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję za pomocą 100 μL 1 M H2SO4 i odczytać płytkę przy 492 nm.</li>
</ol>
3. Test wiązania histonów VWF w fazie stałej
<ol>
	<li>Pokryć mikropłytkę histonami rozcieńczonymi w 0,5% deoksycholanie sodu 50 mM buforu węglanowym (pH 9,6) do 10 μg/ml przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj płytkę trzykrotnie 250 μl PBS uzupełnionego 0,1% Tween 20, inkubując przez 10 minut między praniami.</li>
	<li>Zablokować płytkę 200 μl PBS uzupełnionego 0,1% Tween 20 i 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczać ludzki kompleks VWF/czynnik VIII pochodzący z osocza od 200 mU/ml do 25 mU/ml w buforze soli fizjologicznej (10 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu i 0,1% Tween 20, pH 7,2). Dodaj 100 μL do płytki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Wykryć wiązanie VWF z unieruchomionym histonem za pomocą 100 μl roztworu zawierającego PBS-0,1% Tween 20 i 1:1,000 królicze poliklonalne przeciwciało anty-VWF sprzężone z HRP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 30 minut ze 100 μl odczynnika OPD i zatrzymać reakcję ze 100 μl 1 M H2SO4. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 492 nm.</li>
</ol>
4. Wysiewanie komórek śródbłonka do komór przepływowych
<ol>
	<li>Załadować 0,5 ml buforu powlekającego kolagen (opisanego w kroku 2.1) do strzykawki Luer-lock o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przekręcić końcówkę strzykawki typu Luer-lock na zbiornik szkiełka z komorą przepływową.</li>
	<li>Naciskać tłok powoli, aż cała ścieżka zostanie pokryta, a każdy zbiornik będzie pełny. Powtórzyć dla każdego toru i inkubować komorę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Odessać bufor powlekający kolagen za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Załadować do kolejnej strzykawki 1 ml HBSS i powoli naciskać tłok, aby umyć każdą linię komory przepływowej. Odessać popłuczynę pipetą o pojemności 200 μl umieszczoną na przeciwległym końcu komory przepływowej. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Odpipetować około 100 μl roztworu komórek śródbłonka 3 x 106 komórek/ml (BOEC) w pożywce wzrostowej z 10% FBS do toru komory przepływowej. 
	UWAGA: Gęstość wysiewu komórek śródbłonka przekracza pojemność komory. Ma to na celu zapewnienie maksymalnego pokrycia kanału; Nieprzylegające komórki są usuwane w kolejnym etapie mycia.</li>
	<li>Inkubować w komorze w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Zmieniać podłoże co 8-12 godzin za pomocą strzykawek typu Luer-lock (jak w kroku 4.4). Upewnij się, że na pasach ruchu nie ma widocznych bąbelków.</li>
</ol>
5. Izolowanie płytek krwi od ludzkiej krwi pełnej
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego z igłą 30 G dodać 300 μl buforu dekstrozy kwasowo-cytrynianowego (85 mM cytrynianu trisodowego, 111 mM D-glukozy i 71 mM kwasu cytrynowego, pH 4,5) do wolnego od dodatków wakutainera do pobierania krwi o pojemności 3 ml.</li>
	<li>Pobieraj pełną krew od zdrowych ochotników (wolną od leków przeciwpłytkowych i niesteroidowych leków przeciwzapalnych przez siedem dni) przez nakłucie żyły (trzy probówki po 3 ml każda), zgodnie z protokołem podobnym do tego opublikowanego przez Bernardo i wsp26.</li>
	<li>Wyrzuć pierwszą rurkę, ponieważ początkowe uszkodzenie tkanki związane z nakłuciem dożylnym może spowodować spontaniczną aktywację płytek krwi.</li>
	<li>Delikatnie odwróć wakutainery trzy razy, aby wymieszać krew z antykoagulantem.</li>
	<li>Odwirować urządzenia próżniowe przy 150 x g przez 15 minut w temperaturze 24 °C (temperatura pokojowa).</li>
	<li>Powoli usunąć osocze bogatopłytkowe (supernatant) za pomocą pipety w komorze bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przenieś bogatą w płytki krwi objętość każdego urządzenia do utrzyżenia do pojedynczej stożkowej probówki, aby uniknąć potencjalnej aktywacji krzyżowej. 
	UWAGA: Izolacja płytek krwi powinna być wykonywana w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu i potencjalnej aktywacji sztucznych płytek krwi i/lub śródbłonka.</li>
	<li>Odwirować stożkowe probówki o sile 900 x g przez 10 minut w temperaturze 24 °C (temperatura pokojowa) w celu osadzenia płytek krwi.</li>
	<li>Odpipetować i wyrzucić supernatant ubogi w płytki krwi.</li>
	<li>Ostrożnie przepłukać osad 1 ml buforu cytrynianowo-glukozowo-sodowego (CGS) (13 mM cytrynian sodu, 30 mM D-glukozy i 120 mM chlorek sodu, pH 7,0). 
	UWAGA: Płytki krwi pojawią się w formacjach przypominających ogniki po dodaniu buforu CGS i delikatnym ponownym zawieszeniu osadu. W próbkach zanieczyszczonych aktywacją płytek krwi płytki krwi nie ulegają łatwemu zawieszeniu i wydają się grudkowate.</li>
	<li>Po całkowitym ponownym zawieszeniu próbki należy odwirowywać przy masie 900 x g przez 10 minut w temperaturze 24 °C (temperatura pokojowa).</li>
	<li>Usunąć bufor płuczący CGS i ponownie zawiesić osad w 3 ml buforu Tyrode'a (138 mM chlorku sodu, 5,5 mM D-glukozy, 12 mM wodorowęglanu sodu, 2,9 mM chlorku potasu i 0,36 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, pH 7,4). Zapewnić całkowite ponowne zawieszenie płytek krwi i, jeśli zaobserwowane są skupiska, odrzucić próbkę.</li>
	<li>Dodać 1,5 μl z 20 mM roztworu podstawowego DiOC6 (rozpuścić 57,25 mg w 5 ml metanolu) do każdej stożkowej probówki o pojemności 3 ml z przemytymi płytkami krwi, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM, 
	UWAGA: DIOC6 to zielony fluorescencyjny barwnik mitochondrialny używany w tym eksperymencie do znakowania płytek krwi.</li>
	<li>Podwielokrotność 1 ml przemytego roztworu płytek krwi do trzech probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Objętość płytek krwi wymagana w tym eksperymencie jest obliczana na podstawie wielkości komory przepływowej, pożądanego naprężenia ścinającego i długości eksperymentu (krok 6.5). Protokół ten można dostosować w miarę zmiany warunków, aby zapewnić wystarczającą objętość dla przepływu płynu.</li>
	<li>Umyte płytki krwi należy zużyć w ciągu 2 godzin od izolacji.</li>
</ol>
6. Zespół aparatury przepływowej
<ol>
	<li>Podłącz 70-centymetrowy kawałek sterylnej silikonowej rurki (średnica wewnętrzna 1.6 mm) do męskiego łącznika kolankowego Luer na jednym końcu i żeńskiego adaptera Luer lock na drugim.</li>
	<li>Podłącz żeński adapter Luer lock podłączony do rurki do strzykawki o pojemności 20 ml.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.1 i 6.2 dwukrotnie, aby wygenerować trzy identyczne połączenia rurki strzykawki.</li>
	<li>Użyj pompy strzykawkowej, aby wytworzyć przepływ płynu. Wprowadź następujące ustawienia do pompy strzykawki: średnicę wewnętrzną strzykawki i natężenie przepływu. 
	UWAGA: Strzykawka o pojemności 20 ml ma średnicę wewnętrzną 19,55 mm. Natężenie przepływu jest obliczane na podstawie żądanej szybkości ścinania/naprężenia ścinającego i wymiarów komory przepływowej. Dla komory przepływowej zastosowanej w niniejszym badaniu, aby osiągnąć 1 dyn/cm2 (obserwowane przy niskim ścinaniu żylnym), wymagane jest natężenie przepływu 9,37 μl/min. Ze względu na dowody łączące histony z zakrzepicą żylną, wybiera się umiarkowane ścinanie żylne 4,45 dyn/cm2. Opiera się to również na założeniu, że bufor ma podobną lepkość do wody. Natężenie przepływu wynosi wtedy 41,7 μl/min. Równania używane do obliczania natężenia przepływu dla różnych wymiarów komory przepływowej można znaleźć pod adresem:
	<ol>
		<li>Ustaw pompę tak, aby pobierała płyn za pomocą przycisku na pompie strzykawkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załadować trzy strzykawki podłączone do rurki na pompie strzykawkowej i mocno zamocować wsporniki wokół strzykawek i tłoków.</li>
	<li>Przymocuj męski łokieć Luer do obu końców drugiego 20-centymetrowego kawałka sterylnej silikonowej rurki.</li>
	<li>Podłącz jeden łokieć Luer do igły o rozmiarze 18.</li>
	<li>Powtórz dwukrotnie, tworząc trzy identyczne układy dolotowe dla trzech torów komory przepływowej. 
	UWAGA: Rurki silikonowe i Luers można umyć 10% wybielaczem, a następnie wodą destylowaną przed ponownym użyciem. Nie zaleca się ponownego użycia komór przepływowych.</li>
</ol>
7. Ustawienia mikroskopu
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu z wirującym dyskiem wyposażonego w w pełni zautomatyzowany stolik. Wykonuj oświetlenie za pomocą wystrzeliwania laserowego, które zapewnia linie laserowe o długości fali 405, 458, 491, 543 i 633 nm. Uchwyć wszystkie obrazy za pomocą obiektywu 20X. Dostosuj wszystkie parametry za pomocą oprogramowania analitycznego (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).</li>
	<li>Wybierz ustawienia kanału (filtr emisyjny: 520/35), ze wzbudzeniem przy 491 nm, do akwizycji. Ustaw urządzenie sprzężone z ładunkiem zwielokrotniającym elektrony na wzmocnienie zwielokrotniające elektrony wynoszące 150, z czasem ekspozycji 200 ms, aby uzyskać pełny zakres danych dynamicznych. 
	UWAGA: Płytki krwi są znakowane zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, DiOC6, z maksimum długości fali (wzbudzenie, 482 nm; emisja, 504 nm).</li>
	<li>Dostosuj moc lasera 491 nm do 20%.</li>
	<li>Zaznacz środek wszystkich trzech pasów ruchu i wybierz 1 μm dla zakresu z i 0,5 μm dla rozmiaru kroku. Wybierz liczbę punktów czasowych (tj. czas trwania) i czas między obrazami (tj. interwał), aby przechwytywać obraz co 10 s; Wybierz "60 punktów czasowych" na slajd. Ustaw mikroskop tak, aby przechwytywał obrazy z trzech torów i zapisywał je w wyznaczonym folderze eksperymentu. 
	UWAGA: Ponieważ komora przepływowa ma trzy pasy, mikroskop będzie musiał przełączać się między trzema pozycjami, aby uchwycić obrazy.</li>
</ol>
8. Formacja łańcucha płytek VWF
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komory przepływowej (z kroku 4) stosując tę samą technikę, co w kroku 4.4.</li>
	<li>Dodać 100 μl histaminy (25 μM), PMA (100 nM), UH, HK lub HR (wszystko w stężeniu 25 μg/ml) rozcieńczonych w podłożu bez surowicy (jak w kroku 1.4), aby stymulować monowarstwę BOEC przez 15 minut w temperaturze pokojowej i temperaturze otoczenia O2/CO2, 
	UWAGA: Chociaż nie jest to konieczne do uwolnienia VWF, wykonanie tej stymulacji w temperaturze 37 °C poprawi egzocytozę VWF27.</li>
	<li>Upewnić się, że jeden z trzech oddzielnych torów komory przepływowej pozostaje nietraktowany jako kontrola doświadczalna.</li>
	<li>Usunąć pożywkę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i zastąpić ją 100 - 200 μl PBS, aby zmyć wydzieliny z monowarstwy śródbłonka.</li>
	<li>Zamontuj komorę przepływową na stojaku do slajdów za pomocą klipsów naczyniowych, aby zabezpieczyć komorę na miejscu.</li>
	<li>Podłącz dostępne męskie złącze Luer na końcu rurki o długości 70 cm (podłączonej do strzykawki) do zbiornika komory przepływowej. Powtórz tę czynność dla dwóch pozostałych torów komory przepływowej.</li>
	<li>Uruchomić pompę strzykawkową, aby usunąć płyn do płukania PBS. Odpipetuj dodatkowe PBS do zbiornika przeciwległej komory przepływu, aby upewnić się, że pasy nie wyschną.</li>
	<li>Obserwować układ przepływu pod kątem równoważnego przepływu na wszystkich trzech torach, a następnie wstrzymać pompę strzykawkową.</li>
	<li>Wybierz obszar, aby przechwycić obrazy mniej więcej w środku każdego pasa, mniej więcej w tym samym obszarze między eksperymentami. 
	UWAGA: Osoba obsługująca mikroskop może być ślepa na warunki eksperymentalne. Ten krok zapewnia, że mikroskop jest ustawiony przed wypływem płytek krwi (patrz krok 7).</li>
	<li>Podłączyć żeński łącznik luer<a> </a>do strzykawki o pojemności 5 ml, a następnie do wolnego męskiego łącznika luer (krok 6.8) i zanurzyć stępioną igłę w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej przemyty roztwór płytek krwi (krok 5.13). Powoli przeciągnąć roztwór płytek krwi przez rurkę, aby upewnić się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę o pojemności 5 ml i podłączyć męski Luer do otwartego zbiornika komory przepływowej. Powtórz dla trzech pasów.</li>
	<li>Uruchom ponownie pompę strzykawkową i rejestruj obrazy podczas przepływu płytek krwi za pomocą mikroskopu i ustawień protokołu z kroku 7 przez 10 minut w ciemności.</li>
	<li>Po 10 minutach odłącz Luer od rurki dolotowej w zbiorniku komory przepływowej i napełnij zbiornik PBS, aby utrzymać przepływ przez monowarstwę śródbłonka.</li>
</ol>
9. Kwantyfikacja ciągu płytek VWF
UWAGA: Ciągły przepływ PBS jest wymagany do utrzymania wydłużenia pasma płytek VWF do analizy obrazu. Zatrzymanie przepływu spowoduje, że VWF stanie się kulisty i upośledza oznaczanie ilościowe VWF – pasma płytkowego. Konieczne jest uzupełnienie każdego zbiornika PBS podczas robienia zdjęć. HBSS może zastąpić PBS, jeśli na tym etapie zaobserwuje się kurczenie lub odklejanie komórek.
<ol>
	<li>Zaczynając od pierwszego pasa, uchwyć 10 obrazów na slajd bez nakładania się, używając soczewki obiektywowej 20X mniej więcej na środku slajdu. Powtórz tę czynność dla każdego pasa ruchu. 
	UWAGA: Należy unikać obszarów otaczających zbiorniki ze względu na turbulentne naprężenia ścinające.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazu, dostosuj jasność, klikając "Obraz", "Dostosuj" i "Jasność/Kontrast". Przeciągnij pasek przewijania, aż przylegające płytki krwi będą mogły być wystarczająco dobrze widoczne do określenia ilościowego.</li>
	<li>Nagraj ciąg płytek VWF, gdy na obrazie zaobserwowane są trzy lub więcej wyrównanych płytek krwi. Policz wszystkie ciągi płytek VWF na obrazie. Powtórz te czynności dla wszystkich 10 obrazów i uśrednij dla eksperymentu. 
	UWAGA: Osoba dokonująca kwantyfikacji może być ślepa na warunki eksperymentalne. Nie jest konieczne współbarwienie dla VWF, ponieważ zostało to potwierdzone przez niezależne badania8,28,29.</li>
	<li>Powtórz eksperyment co najmniej trzy razy, aby ocenić każdą sekretagogę.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Chociaż fizjologiczne znaczenie łańcuchów płytek krwi VWF pozostaje kontrowersyjne ze względu na ich szybkie rozpuszczanie w obecności proteazy rozszczepiającej VWF ADAMTS13, służą one jako ilościowy model in vitro rekrutacji płytek krwi przez VWF do miejsca, w którym może tworzyć się skrzeplina w obecności miejscowego wzrostu poziomu histonów5. Co więcej, w patologiach pozbawionych ADAMTS13 aktywności - takich jak zakrzepowa plamica małopłytkowa (TTP) - lub w mikrośrodowiskach zapalnych ...

Zakrzepica jest główną przyczyną śmiertelności na całym świecie1 i może rozwinąć się w odpowiedzi na rozregulowaną aktywację płytek krwi i wytwarzanie trombiny zarówno w żyłach, jak i tętnicach. Poziomy VWF w osoczu są kluczowym regulatorem krzepnięcia krwi, przy czym niski poziom (<50%) powoduje zaburzenie krzepnięcia znane jako choroba von Willebranda (VWD)2, a wysoki poziom (>150%) wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy żylnej3 i arterial4 zakrzepicy.
VWF to multimeryczna glikoproteina syntetyzowana przez megakariocyty i komórki śródbłonka i przechowywana odpowiednio w α-granulkach płytek krwi i WPB. Po prowokacji hemostatycznej, VWF może zostać uwolniony ze śródbłonkowych WPB w celu przywiązania krążących płytek krwi do aktywowanych komórek śródbłonka5 lub odsłonięty kolagen na ścianie naczynia6. Wykazano, że w zakotwiczeniu VWF w komórkach śródbłonka pośredniczy P-selectin7 i integryna αvβ38. Późniejsze uwolnienie zapasów płytek krwi α granulek może dodatkowo zwiększyć miejscowe stężenia VWF w celu ustabilizowania interakcji płytki-płytki krwi w celu tworzenia czopów płytkowych, rusztowania potrzebnego do propagacji kaskady krzepnięcia i odkładania fibryny. Aktywność wiązania płytek krwi VWF jest regulowana przez jego strukturę multimeryczną, przy czym multimery o dużej masie cząsteczkowej mają większą aktywność hemostatyczną9,10. W obiegu VWF działa również jako nośnik czynnika krzepnięcia VIII.
Naprężenie ścinające płynu jest podstawowym regulatorem fizjologii VWF. W przypadku braku naprężeń ścinających, VWF występuje w postaci kulistej, ukrywając domeny wiążące dla adhezji glikoproteiny Ib z glikoproteiną płytkową11. Gdy występuje naprężenie ścinające, odsłania się miejsce rozszczepienia metaloproteazy, dezintegryny A i metaloproteazy z motywem trombospondyny (ADAMTS13). ADAMTS13 rozszczepia nagie i ozdobione płytkami VWF struny VWF, aby regulować rozmiar multimera, zmniejszając w ten sposób jego aktywność hemostatyczną12.
VWF jest białkiem ostrej fazy, a liczne bodźce, w tym niedotlenienie13, infection14 i cytokiny prozapalne, okazały się pośredniczyć w uwalnianiu VWF z komórek śródbłonka. Podobnie jak inne czynniki zapalne, wykazano również, że histony zewnątrzkomórkowe indukują ogólnoustrojowe uwalnianie VWF u myszy15,16 i aktywację płytek krwi in vitro17,18,19. Wykazano, że jest to zależne od podtypu histonu, ponieważ różnice w zawartości lizyny i argininy mogą wpływać na function15. Nasze badanie ma na celu ustanowienie modelu komory przepływowej w celu zbadania wpływu podtypów histonów bogatych w lizynę (HK) i argininę (HR) oraz sekretagogów na śródbłonkowe uwalnianie VWF i wychwytywanie płytek krwi w czasie rzeczywistym, potencjalne wczesne zdarzenia w zakrzepicy wywołanej stanem zapalnym.
Ta metodologia komory przepływowej podsumowuje interakcje in vivo między kolagenem podśródbłonkowym, komórkami śródbłonka, VWF i płytkami krwi w systemie in vitro, który jest wizualny, powtarzalny i policzalny. Pozwala na ocenę w czasie rzeczywistym wszystkich aspektów szlaku, który reguluje interakcje VWF-płytki krwi, w tym wydzielanie WPB, aktywację płytek krwi i proteolizę VWF. Badania VWF w warunkach kontrolowanego naprężenia ścinającego zostały wykorzystane do oceny mutacji VWD, które upośledzają uwalnianie VWF i funkcję wiązania płytek krwi20, WPB physiology21, oraz rozszczepienie VWF według ADAMTS135. Używamy tej metodologii do ilościowego określenia powstawania sznurka płytek krwi VWF w wyniku bodźca zapalnego: histonów zewnątrzkomórkowych.

<table><tbody><tr><td>Niefrakcjonowane histony cielęco-grasicowate (UH)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>HLY</td><td>Rozpuszczony w pożywce o obniżonej surowicy (5 mg/ml)</td></tr><tr><td>Histony bogate w lizynę cielęcej i grasicy (HK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5505</td><td>rozpuszczony w pożywce o obniżonej surowicy (5 mg/ml)</td></tr><tr><td>Histony bogate w argininę cielęcej grasicy (HR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td><td>Rozpuszczony w pożywce o obniżonej surowicy (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Rozpuszczony w DMSO (20 mM)</td></tr><tr><td>Histamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125-1G</td><td>Rozpuszczony w wodzie (50 mg / ml)</td></tr><tr><td>3,3' Jodek diheksyloksakarbocyjaniny (DiOC6)</td><td>Invitrogen</td><td>D273</td><td>Rozpuszczony w metanolu (20 mM)</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało powlekające anty-VWF</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Dla VWF ELISA</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało detekcyjne anty-VWF, sprzężone z HRP</td><td>DAKO</td><td>P0026</td><td>Do testu wiązania VWF ELISA i histon-VWF</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 96-dołkowe mikropłytki płaskodenne</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td><td>Do testu wiązania histon-VWF</td></tr><tr><td>Immulon 4 HBX Płaskie dno Microtiter 96-dołkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td>Do VWF ELISA</td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>Ludzki kompleks czynnika von Willebranda/czynnika VIII pochodzenia osocza</td></tr><tr><td>Normalna referencyjna precyzja plazmy</td><td>BioLogic</td><td>CCNRP-05</td><td>Do krzywej wzorcowej VWF ELISA</td></tr><tr><td>Odczynnik dichlorowodorku O-fenylenodiaminy (OPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>Równoważny produkt dostępny za pośrednictwem ThermoFisher Scientific (numer katalogowy: 34006)</td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Do hodowli i początkowej wysiew BOEC</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu 1 ze szczurzego ogona</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Do stymulacji komórek śródbłonka</td></tr><tr><td>Mikroskopia METAMORPH Oprogramowanie do automatyzacji i analizy obrazu</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi BD Vacutainer, bez dodatku</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&mikro;-Slide III 0.1 (komory przepływowe)</td><td>Ibidi</td><td></td><td>Ten produkt został wycofany z produkcji. Sugerujemy użycie &micro;-Slide VI 0.1 (#80661) lub 0.4 (# 80601) i ponowne obliczenie natężenia przepływu i objętości płytek krwi potrzebnych do utrzymania naprężenia ścinającego 4.45 dyn/cm2</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa 1.6 mm ID: 5 m, sterylizowana</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Connector Żeńska: naturalny polipropylen, sterylizowany</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Złącze kolankowe Luer Męskie: białe Polipropylen, sterylizowane</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>igła 18G</td><td>Strzykawki BD Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td> Mikroskop z wirującym dyskiem WaveFX-4X1 <td></td></tr><tr><td></td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie patofizjologii czynnika von willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von willebranda i sznurka płytkowego

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Czynnik von Willebranda (VWF) jest multimerycznym czynnikiem krzepnięcia glikoproteiny, który pośredniczy w adhezji i agregacji płytek krwi w miejscach uszkodzenia śródbłonka i który przenosi czynnik VIII w krążeniu. VWF jest syntetyzowany przez komórki śródbłonka i jest albo uwalniany konstytutywnie do osocza, albo jest przechowywany w wyspecjalizowanych organellach, zwanych ciałami Weibela-Palade'a (WPB), do uwalniania na żądanie w odpowiedzi na prowokację hemostatyczną. Bodźce prokoagulacyjne i prozapalne mogą szybko indukować egzocytozę WPB i uwalnianie VWF. Większość VWF uwalniana przez komórki śródbłonka krąży w osoczu; jednak część VWF jest zakotwiczona na powierzchni komórek śródbłonka. W warunkach fizjologicznego ścinania, VWF zakotwiczony w śródbłonku może wiązać się z płytkami krwi, tworząc ciąg płytek VWF, który może reprezentować nidus tworzenia się skrzepliny. System komór przepływowych może być używany do wizualnej obserwacji uwalniania VWF z komórek śródbłonka i późniejszego wychwytywania płytek krwi w sposób, który jest powtarzalny i istotny dla patofizjologii tworzenia się skrzepliny za pośrednictwem VWF. Korzystając z tej metodologii, komórki śródbłonka są hodowane w komorze przepływowej, a następnie stymulowane za pomocą wydzielników w celu wywołania egzocytozy WPB. Umyte płytki krwi są następnie perfundowane przez aktywowany śródbłonek. Płytki krwi są aktywowane, a następnie wiążą się z wydłużonymi strunami VWF w kierunku przepływu płynu. Używając histonów zewnątrzkomórkowych jako prokoagulantu i bodźca prozapalnego, zaobserwowaliśmy zwiększone tworzenie się pasma płytek krwi VWF na komórkach śródbłonka traktowanych histonami w porównaniu z nieleczonymi komórkami śródbłonka. Protokół ten opisuje ilościową, wizualną i w czasie rzeczywistym ocenę aktywacji interakcji VWF-płytki krwi w modelach zakrzepicy i hemostazy.

Aby bezpośrednio ocenić wpływ histonów na uwalnianie VWF z komórek śródbłonka, poddano konfluentne BOECs działaniu medium bezsurowiczego zawierającego PMA (kontrola pozytywna), UH, HR oraz HK przez 2 h. Wykazano, że HK wywołało 2-krotny wzrost poziomu białka VWF (VWF:Ag) w medium traktowanych komórek śródbłonka (Rycina 1). Co ciekawe, gdy BOECs były stymulowane UH i HR, w medium wykryto mniej VWF:Ag niż w warunkach nie traktowanych. Postawiono hipotezę, że po...

W tym artykule opisujemy metodę oceny śródbłonkowego uwalniania czynnika von Willebranda i późniejszego wychwytywania płytek krwi pod wpływem stresu ścinającego płyn w odpowiedzi na bodźce zapalne za pomocą systemu komór przepływowych in vitro.

Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja i kwantyfikacja tworzenia się nici czynnika von Willebranda lub VWF-płytek w odpowiedzi na sekretagogi. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii czynnika von Willebranda oraz patofizjologii organizmu w stanie paliatywnym. Pomaga ona również w badaniu mutacji upośledzających uwalnianie czynnika von Willebranda oraz funkcję wiązania płytek krwi.Główną zaletą tej techniki jest to, że odtwarza ona oddziaływania in vivo między kolagenem podśródbłonkowym, VWF komórek śródbłonka a płytkami krwi w wizualnym i mierzalnym systemie in vitro. Uważam, że wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa. Etapy mikroskopowe niezbędne do zarejestrowania tworzenia się nici VWF-płytki w czasie rzeczywistym, przy wielu jednoczesnych warunkach, mogą być trudne do opanowania wyłącznie na podstawie opisu tekstowego.Zacznij od pobrania 0,5 ml buforu do powlekania kolagenem do strzykawki 1 ml z końcówką Luer-Lock. Przykręć końcówkę strzykawki do zbiornika slajdu z komorą przepływową i powoli naciśnij tłok, aż cały kanał zostanie powleczony, a każdy zbiornik zostanie wypełniony. Uzupełnij poziom cieczy w zbiornikach, aby upewnić się, że każdy z nich jest pełny.Po załadowaniu wszystkich kanałów inkubować komorę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Następnego dnia za pomocą pipety 200 µL usunąć bufor do powlekania kolagenem. Następnie przepłukać każdy kanał roztworem HBSS, odsysając sól za pomocą pipety 200 µL.Po odrzuceniu trzeciej porcji HBSS, do każdego kanału komory przepływowej należy dodać około 3 × 10⁶ komórek śródbłonka z wypustek krwi (Blood Outgrowth Endothelial Cells) na mililitr w 100 µL pożywki wzrostowej uzupełnionej o 10% FBS. Następnie komorę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 godziny, wymieniając pożywkę co 8 do 12 godzin. Aby zmontować aparat do przepływu, najpierw należy przymocować jeden męski kolankowy konektor Luer do jednego końca każdego z trzech 70 cm odcinków sterylnej rurki silikonowej.Następnie do drugiego końca każdej rurki przymocuj żeński adapter Luer lock. Połącz żeńskie adaptery Luer lock z pojedynczymi strzykawkami o pojemności 20 ml i zaprogramuj pompę strzykawkową. Załaduj strzykawki do pompy, a następnie mocno zabezpiecz uchwyty wokół strzykawek i tłoków.Następnie do obu końców trzech różnych, 20-centymetrowych odcinków sterylnych rurek silikonowych przymocuj pojedyncze męskie kolanka luer, a do jednego z trzech kolanek luer podłącz stępioną igłę o rozmiarze 18G. Następnie, korzystając z mikroskopu dyskowego wyposażonego w w pełni zautomatyzowany stolik, wybierz obiektyw 20x i ustaw odpowiednie parametry kanałów. Aby uzyskać pełny dynamiczny zakres danych, ustaw urządzenie CCD z mnożeniem elektronów na wzmocnienie 150 przy czasie ekspozycji 200 ms.Ustaw moc lasera 491 nm na 20% i za pomocą oprogramowania mikroskopu zaznacz środek wszystkich trzech ścieżek. Ustaw zakres Z na 1,0 µm oraz wielkość kroku na 0,5 µm. Na koniec wybierz czas trwania i interwał tak, aby rejestrować obraz co 10 s w 60 punktach czasowych na slajd.Aby wywołać tworzenie się sznurów VWF-płytek krwi, należy zastąpić pożywkę hodowlaną w trzech kanałach komory przepływowej samą pożywką bezsurowiczą jako kontrolą, a w pozostałych kanałach stymulatorem z rozcieńczeniem w 100 µL pożywki bezsurowiczej. Następnie inkubować komorę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu okresu stymulacji wszystkie trzy kanały należy przemyć od 100 do 200 µL PBS, a następnie za pomocą klipsów naczyniowych przymocować komorę przepływową do podstawki na preparaty.Podłącz męski konektor luer z końca 70 centymetrowego odcinka rurki do każdego zbiornika komory przepływowej. Następnie uruchom pompę strzykawkową, aby usunąć płuczkę PBS. Do przeciwległego zbiornika komory przepływowej pipetuj dodatkowy PBS, aby upewnić się, że kanały nie wyschną.Po potwierdzeniu równoważnego przepływu zatrzymaj pompę strzykawkową. Przymocuj strzykawkę o pojemności 5 ml z żeńskim złączem luer lock do pierwszego wolnego męskiego złącza luer. Następnie zanurz stępioną igłę w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej roztwór przemytych płytek krwi znakowanych fluorescencyjnie.Powoli przeciągnij roztwór płytek przez rurkę, aby upewnić się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza. Przymocuj męski łącznik luer do otwartego zbiornika komory przepływowej, a pozostałe dwa kanały wypełnij roztworem płytek, tak jak właśnie pokazano. Sprawdź konfigurację systemu przepływowego, aby upewnić się, że wszystkie połączenia są szczelne.Uruchom ponownie pompę strzykawkową i rejestruj obraz przepływu płytek krwi przez 10 minut w ciemności. Następnie odłącz złącze luer od rurki doprowadzającej w zbiorniku komory przepływowej. Napełnij zbiornik PBS, aby utrzymać łagodny przepływ soli fizjologicznej nad monowarstwą komórek śródbłonka.Aby ilościowo określić tworzenie się nici VWF-płytek krwi, należy uchwycić 10 obrazów na slajd z każdego toru, bez nakładania się na siebie, z centralnej części slajdu. Po uzyskaniu wszystkich obrazów należy otworzyć oprogramowanie do przetwarzania obrazów, a następnie kliknąć image, adjust oraz brightness contrast. Aby dostosować jasność pierwszego obrazu, należy przesuwać suwak, aż przylepione płytki krwi będą widoczne w stopniu wystarczającym do przeprowadzenia analizy ilościowej.Następnie zarejestruj łańcuch VWF-płytek krwi, gdy zaobserwowane zostaną trzy lub więcej wyrównanych płytek, i policz wszystkie łańcuchy na obrazie. Po zainicjowaniu warunków przepływu komórki niepoddane działaniu czynników wykazują bardzo mało łańcuchów VWF-płytek w porównaniu do komórek traktowanych histaminą lub PMA, które wykazują średnio od dwóch do trzech łańcuchów w jednym polu widzenia.Ponadto histony, które aktywują zarówno płytki krwi, jak i komórki śródbłonka, indukują powstawanie większej liczby nici VWF-płytki niż w przypadku kontroli nieleczonych lub stymulowanych histaminą bądź PMA. Podczas wykonywania tej procedury należy dbać o to, aby płytki krwi pozostały w stanie spoczynku aż do momentu przeprowadzenia eksperymentu z przepływem, co osiąga się poprzez odrzucenie pierwszej probówki z pobraną krwią, utrzymywanie wszystkich odczynników w temperaturze pokojowej oraz stosowanie delikatnej techniki pipetowania. Procedurę tę można zmodyfikować w celu oceny tworzenia nici VWF-płytki w obecności leukocytów, czynników aktywujących płytki krwi lub rozpuszczania nici przez enzym tnący TS13.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak oceniać tworzenie się nici VWF-płytki indukowane sekretagogiem oraz korzystać z modelu komory przepływowej in vitro.

investigating-von-willebrand-factor-pathophysiology-using-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Aby zbadać interakcję bakterii z naczyniami krwionośnymi pod wpływem naprężeń ścinających, opisano komorę przepływową oraz model mikroskopii przyżyciowej in vivo, które pozwalają na analizę czynników bakteryjnych i gospodarza przyczyniających się do adhezji naczyniowej.

Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

To badanie opisuje mikroskopowe monitorowanie przylegania pneumokoków do ciągów czynnika von Willebranda wytwarzanych na powierzchni zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających w określonych warunkach przepływu. Protokół ten można rozszerzyć o szczegółową wizualizację określonych struktur komórkowych i kwantyfikację bakterii poprzez zastosowanie różnicowych procedur barwienia immunologicznego.

Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Niniejszy artykuł przedstawia protokół ilościowego określania procentu płytek krwi (TF) za pomocą cytometrii przepływu pełnej krwi, oceniając białko: (1) wewnątrzkomórkowo w warunkach spoczynku oraz (2) na powierzchni komórki, zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji. Przedstawiono również wskazówki dotyczące oceny trombocytów TF-dodatnich w osoczu bogatym w płytki.

Analiza ekspresji tkankowych w ludzkich płytkach krwi przepływową za pomocą cytometrii przepływowej

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Poznaj metodę badania uwalniania czynnika von Willebranda i tworzenia się sznurków płytkowych pod wpływem naprężenia ścinającego w układzie komory przepływowej in vitro. Technika ta pozwala wizualizować i ilościowo oceniać interakcje VWF z płytkami krwi w kontrolowanych warunkach.

Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego (Wideo) | JoVE Journal

Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego

Przeglądaj więcej filmów