Skanowanie retrowirusowe: mapowanie miejsc integracji MLV w celu zdefiniowania regionów regulatorowych specyficznych dla komórki

Ogólnym celem tej procedury jest mapowanie miejsc integracji wektorów retrowirusowych pochodzących z wirusa białaczki myszy w celu zdefiniowania regionów regulatorowych specyficznych dla komórki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad terapią genową i regulacją genów, takie jak to, gdzie wektor integruje się z ludzkim genomem i który element regulatorowy może aktywnie wykorzystywać za pośrednictwem określonego podtypu. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, obserwując, że w badaniach nad terapią genową wektory MLV integrują się z aktywnymi subspecyficznymi promotorami i wzmacniaczami.

Zacznij od transdukcji komórek docelowych wektorem retrowirusowym pochodzącym z MLV, zawierającym gen reporterowy EGFP i pseudotypowanym VSV-G lub glikoproteiną otoczki amfrotopowej. Próbne transdukowane komórki są używane jako kontrola negatywna. 48 godzin po transdukcji odwirować próbki, a następnie ponownie zawiesić 100 000 komórek w 300 mikrolitrach PBS zawierających dwa procent płodowej surowicy bydlęcej.

Następnie zmierz wyrażenie EGFP za pomocą analizy metryk miejsca przepływu. Zbierz kolejne 0,5 do pięciu milionów transdukowanych komórek w celu przygotowania genomowego DNA, a następnie trawienia enzymem restrykcyjnym. Ustaw cztery trawienie enzymem restrykcyjnym na próbkę w probówkach o pojemności 1,5 mililitra.

Trawić od 0,1 do jednego mikrograma G-DNA w każdej probówce. Dodając 10 jednostek TRU91 i jeden mikrolitr buforu M na próbkę w końcowej objętości 10 mikrolitrów. Dozować dwa mikrolitry mieszanki do probówek wytrawiających.

A następnie inkubuj reakcje w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez sześć godzin lub noc. Po inkubacji dodaj 40 mikrolitrów wody do 1,5 mililitrowej probówki. W tej samej probówce dodaj 10 jednostek PST1 i jeden mikrolitr buforu H na próbkę.

Dozować 10 mikrolitrów mieszanki reakcji trawienia do probówek wytrawiających. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin lub przez noc. Następnego dnia ustaw osiem reakcji podwiązania łącznika w probówkach o pojemności 1,5 mililitra.

Dla każdej reakcji dodać mieszaninę reakcji ligazy do 10 mikrolitrów genomowego DNA trawienia. Inkubować w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez trzy do sześciu godzin. W przypadku pierwszej rundy PCR ustaw 48 reakcji PCR w probówkach o pojemności 0,2 mililitra.

Dla każdego PCR dodać mieszaninę reakcyjną zawierającą starter łącznikowy i starter MLV3 prime LTR do dwóch mikrolitrów reakcji ligacji. Umieścić próbki w termocyklerze z pokrywą grzałki. Ustaw parametry cyklu i uruchom pierwszą rundę reakcji PCR.

W przypadku drugiej rundy PCR należy przygotować mieszaninę reakcyjną, w tym starter zagnieżdżony w łączniku i starter MLV3 prime LTR. Następnie dodaj dwa mikrolitry produktu PCR z pierwszej rundy PCR jako szablon. Następnie uruchom drugą rundę reakcji PCR, aby wygenerować końcowe produkty LN PCR.

Po drugiej rundzie PCR wyciągnij 48 zagnieżdżonych reakcji LM PCR w 15-mililitrowej probówce. Następnie dodać 20 mikrolitrów buforu ładującego do 100 mikrolitrów zbiorczego i wytrąconego produktu LM PCR. I załaduj próbkę na jednoprocentowy żel agarozowy wraz z drabinką DNA zawierającą 100 par zasad.

Uruchom żel pod napięciem pięciu woltów na centymetr przez 30 do 60 minut, gdy pasma się rozwiążą, odetnij proporcję żelu zawierającego amplikony o długości od 500 do 150 par zasad. Po oczyszczeniu produktu LM PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu na bazie kolumny, przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki należy zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru UV. Oceń również długość produktów LM PCR za pomocą bioanalizatora zgodnie z instrukcjami producenta.

Przygotuj bibliotekę, konfigurując indeksowanie PCR. Do każdego PCR należy użyć od 150 do 170 nanogramów oczyszczonego produktu LM PCR, w innej kombinacji wskaźników dla każdej próbki. Wykonaj PCR w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką, jak wskazano

Po PCR rozcieńczyć oczyszczoną bibliotekę do 10 nanomolowych 10 milimolowymi tris HCL. Następnie wymieszaj pięć mikrolitrów rozcieńczonej puli z pięcioma mikrolitrami wodorotlenku sodu o stężeniu 0,2 niutona w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Krótko wirować, wirować, a następnie inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby denaturować biblioteki.

Umieść probówki denaturowanego basenu na lodzie i 990 mikrolitrach wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego HT1. Następnie podlej 300 mikrolitrów denaturowanego basenu do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. I dodaj 300 mikrolitrów wstępnie schłodzonego HT1, aby uzyskać dziesięć pikomolarnych końcowych pul bibliotecznych.

Równolegle wymieszaj 10 nanomoli stałej biblioteki kontrolnej w objętości dwóch mikrolitrów z 3 mikrolitrami 10 milimolowych tris HCl w 1,5 mililitrowej probówce. Dodaj pięć mikrolitrów wodorotlenku sodu o stężeniu 0,2 niutona i krótko odwiruj. Po odwirowaniu inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby denaturować rozcieńczoną masę.

Po inkubacji umieścić probówkę na lodzie i dodać 990 mikrolitrów wstępnie schłodzonego HT1. Teraz podwielokrotność 100 mikrolitrów denaturatu utrwali się w nowej 1,5 mililitrowej probówce i dodaj 300 mikrolitrów wstępnie schłodzonego HT1, aby uzyskać końcowe stężenie fix 10 pikomolarów. Na koniec, w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra, wymieszaj 510 mikrolitrów zdenaturowanej puli bibliotecznej z 90 mikrolitrami zdenaturowanej stałej biblioteki, uzyskując w ten sposób końcową pulę 10 pikomolarów z 15% kontrolą fix do sekwencjonowania.

Obraz ten przedstawia analizę 3498, 2989 i 4103 klastrów nawracających miejsc integracji MLV w krwiotwórczych komórkach progenitorowych krwi, erytroidalnych progenitorach i przodkach szpiku. W każdej populacji komórek ponad 95% klastrów MLV pokrywało się z epigenetycznie zdefiniowanymi wzmacniaczami i promotorami. Specyficzne dla komórki regiony docelowe MLV były silnie acetylowane i związane ze specyficzną dla komórki ekspresją docelowego genu.

Przykładami są promotor genu SPINK2 specyficznego dla HSP. Region kontrolny locus zawierający silne wzmacniacze erytroidalnych genów globiny beta-podobnej. Wzmacniacze znajdujące się przed genem LYZ specyficznym dla NPP.

Testy reporterowe lucyferazy potwierdziły podzbiór specyficznych dla komórek wzmacniaczy ukierunkowanych na MLV w EPP i MPP. Erytroidalne regiony docelowe MLV miały wyższą aktywność w EPP niż w MPP i odwrotnie, co potwierdza, że MLV identyfikuje specyficzne dla komórek wzmacniacze, które mogą kontrolować ekspresję pobliskich genów. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o maksymalizacji częstotliwości transdukowanych komórek w celu optymalnego pobrania miejsca integracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mapować miejsca integracji wirusa, najpierw dostosowując genomowe DNA, następnie ligując fragmenty genomu za pomocą łącznika DNA, a następnie amplifikując połączenie wirusowe genomu gospodarza za pomocą LM PCR, a na koniec głębokie sekwencjonowanie biblioteki amplikonów.