Skanowanie retrowirusowe: mapowanie miejsc integracji MLV w celu zdefiniowania regionów regulatorowych specyficznych dla komórki

Ogólnym celem niniejszej procedury jest mapowanie miejsc integracji wektorów retrowirusowych pochodzących z wirusa białaczki mysiej w celu zdefiniowania komórkowych regionów regulacyjnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad terapią genową i regulacją genów, takich jak miejsce integracji wektora w genomie ludzkim oraz to, który element regulacyjny może być aktywnie wykorzystywany przez konkretny podtyp komórek. Pomysł na tę metodę pojawił się po zaobserwowaniu w badaniach nad terapią genową, że wektory MLV integrują się z aktywnymi, specyficznymi podtypami promotorów i enhancerów.

Rozpocznij od transdukcji komórek docelowych wektorem retrowirusowym pochodzącym z MLV, zawierającym gen reporterowy EGFP i pseudotypowanym białkiem otoczki VSV-G lub białkiem otoczki amfrotropowej. Komórki poddane transdukcji pozorowanej służą jako kontrola negatywna. 48 godzin po transdukcji odwiruj próbki, a następnie resuspenduj 100 000 komórek w 300 µL PBS zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej.

Następnie zmierzono ekspresję EGFP za pomocą analizy cytometrycznej. Zebrano kolejne od 0,5 do 5 milionów transdukowanych komórek w celu przygotowania genomicznego DNA i następnego trawienia enzymami restrykcyjnymi. Przygotowano cztery reakcje trawienia enzymami restrykcyjnymi na próbkę w probówkach o pojemności 1,5 mililitra.

Poddaj trawieniu od 0,1 do 1 µg G-DNA w każdej probówce. Dodaj 10 jednostek TRU91 oraz 1 µL buforu M na próbkę, aby uzyskać końcową objętość 10 µL. Odmierz 2 µL mieszaniny do probówek przeznaczonych do trawienia.

Następnie inkubować reakcje w temperaturze 65 °C przez sześć godzin lub przez noc. Po inkubacji do probówki o pojemności 1,5 ml dodać 40 µL wody. Do tej samej probówki dodać 10 jednostek PST1 oraz 1 µL buforu H na każdą próbkę.

Napołóż 10 µL mieszaniny reakcyjnej do trawienia do probówek do trawienia. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 °C przez sześć godzin lub przez noc. Następnego dnia przygotuj osiem reakcji ligacji linkerów w probówkach o pojemności 1,5 ml.

Dla każdej reakcji dodaj mieszaninę reakcyjną ligazy do 10 µL trawionego DNA genomicznego. Inkubuj w temperaturze 16 °C przez trzy do sześciu godzin. W przypadku pierwszej rundy PCR przygotuj 48 reakcji PCR w probówkach o pojemności 0,2 ml.

Dla każdej reakcji PCR dodać mieszaninę reakcyjną zawierającą primer łącznikowy oraz primer MLV3 prime LTR do dwóch mikrolitrów reakcji ligacji. Umieścić próbki w termocyklerze z grzaną pokrywą. Ustawić parametry cykli i przeprowadzić pierwszą rundę reakcji PCR.

W celu przeprowadzenia drugiej rundy PCR przygotuj mieszaninę reakcyjną zawierającą zagnieżdżony primer linker oraz zagnieżdżony primer MLV3 prime LTR. Następnie dodaj 2 µL produktu PCR z pierwszej rundy jako matrycę. Przeprowadź reakcję drugiej rundy PCR, aby uzyskać końcowe produkty LN PCR.

Po drugiej rundzie PCR przenieś 48 reakcji zagnieżdżonego LM PCR do probówki o pojemności 15 ml. Następnie dodaj 20 µl buforu do nakładania do 100 µl połączonego i wytrąconego produktu LM PCR. Następnie nałóż próbkę na jeden procentowy żel agarozowy wraz z markerem DNA 100 bp.

Prowadź elektroforezę żelu przy napięciu 5 V/cm przez 30 do 60 minut; gdy prążki zostaną rozdzielone, wytnij fragment żelu zawierający amplikony o długości od 500 do 150 bp. Po oczyszczeniu produktu LM PCR za pomocą kolumnowego zestawu do ekstrakcji z żelu, zmierz jego stężenie za pomocą spektrofotometru UV przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki. Oceń również długość produktów LM PCR za pomocą bioanalizatora zgodnie z instrukcjami producenta.

Przygotuj bibliotekę, przeprowadzając PCR indeksującą. Dla każdej reakcji PCR wykorzystaj od 150 do 170 nanogramów oczyszczonego produktu LM PCR, stosując inną kombinację indeksów dla każdej próbki. Wykonaj PCR w termocyklerze z grzaną pokrywą zgodnie z instrukcją.

Po reakcji PCR rozcieńczyć oczyszczoną bibliotekę do stężenia 10 nM za pomocą 10 mM tris HCL. Następnie zmieszać 5 µL rozcieńczonego pulu z 5 µL 0,2 N wodorotlenku sodu w nowej probowce o pojemności 1,5 ml. Krótko wymieszać na vortexie, odwirować, a następnie inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu denaturacji bibliotek.

Probiówki z denaturowaną pulą należy umieścić na lodzie, podobnie jak 990 µL schłodzonego buforu do hybrydyzacji HT1. Następnie należy przenieść 300 µL denaturowanej puli do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 300 µL schłodzonego buforu HT1, aby uzyskać końcowe stężenie puli biblioteki wynoszące 10 pM.

Równolegle, wymieszaj 10 nM stałej biblioteki kontrolnej w objętości 2 µL z 3 µL 10 mM tris HCl w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodaj 5 µL 0,2 N wodorotlenku sodu i krótko wymieszaj na wortexie. Po odwirowaniu, inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby zdenaturować rozcieńczony fiks.

Po inkubacji umieść probówkę w lodzie i dodaj 990 µL schłodzonego HT1. Następnie odnieś 100 µL zdenaturowanego fix do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 300 µL schłodzonego HT1, aby uzyskać końcowe stężenie fix wynoszące 10 pM. Na koniec, w nowej probówce o pojemności 1,5 ml, wymieszaj 510 µL zdenaturowanej puli biblioteki z 90 µL zdenaturowanej biblioteki fixed, uzyskując w ten sposób końcową pulę o stężeniu 10 pM zawierającą 15% kontroli fix do sekwencjonowania.

Na tym obrazie przedstawiono analizę odpowiednio 3498, 2989 i 4103 klastrów powtarzających się miejsc integracji MLV w komórkach macierzystych i progenitorach krwiotwórczych, progenitorach erytroidalnych oraz progenitorach mieloidalnych. W każdej populacji komórek ponad 95% klastrów MLV pokrywało się z epigenetycznie zdefiniowanymi enhancerami i promotorami. Specyficzne dla danej komórki regiony celowane przez MLV były silnie acetylowane i powiązane ze specyficzną dla komórki ekspresją celowanego genu.

Przykładami są promotor genu SPINK2 specyficznego dla HSP. Region kontroli locus zawierający silne enhancery genów globiny typu beta specyficznych dla linii erytroidalnej. Enhancery zlokalizowane powyżej genu LYZ specyficznego dla NPP.

Testy reporterowe lucyferazy potwierdziły podzbiór specyficznych dla komórek enhancerów celowanych przez MLV w EPP i MPP. Regiony celowane przez MLV specyficzne dla linii erytroidalnej wykazywały wyższą aktywność w EPP niż w MPP i na odwrót, co potwierdza, że MLV identyfikuje specyficzne dla komórek enhancey, które prawdopodobnie kontrolują ekspresję pobliskich genów. Po opanowaniu techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu jednego tygodnia.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o maksymalizacji częstotliwości komórek transdukowanych w celu optymalnego odzyskania miejsc integracji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat mapowania miejsc integracji wirusowej, obejmującą w pierwszej kolejności przygotowanie genomowego DNA, następnie ligację fragmentów genomowych z łącznikiem DNA, a w dalszej kolejności amplifikację złącza wirus-genom gospodarza za pomocą LM PCR i na koniec głębokie sekwencjonowanie biblioteki amplikonów.