Name: Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Poznaj metodę rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania dyfuzji 1D cząsteczek wzdłuż DNA. Protokół obejmuje przygotowanie DNA z biotyną, funkcjonalizację szkiełek PEG, budowę komórki przepływowej oraz obrazowanie TIRF.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Tony'emu Kulesie, Robinowi Kirkpatrickowi i Evangelosowi Gatzogiannisowi za pomoc w początkowej konfiguracji i testowaniu oprzyrządowania. Ponadto dziękujemy Tony'emu Kulesie za znaczącą pomoc w pisaniu i ocenie dostosowanego oprogramowania do śledzenia pojedynczych cząstek. Praca ta została wsparta przez fundusze dla startupów i nagrodę Career Award at the Scientific Interface (do PCB) od Burroughs Wellcome Foundation.

1. Przygotowanie biotyny- λ-DNA
UWAGA: Cząsteczki biotyny-λ-DNA są przygotowywane przez ligowanie znakowanego biotyną oligonukleotydu, 5'-AGGTCCCCC(A)20-biotyny-3' do cząsteczek λ-DNA20.
<ol>
	<li>Przygotować 0,1 mM oligo znakowanego biotyną w buforze TE.</li>
	<li>Podgrzewać 0,5 mg/ml λ-DNA w temperaturze 65 °C przez 60 s i od razu zanurzyć się w mokrym lodzie. 
	UWAGA: Szybkie chłodzenie hartowania zmniejsza konkategoryzację λ-DNA.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl roztworu λ-DNA do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 1 μl 0,1 mM oligo do 9 μl buforu TE.</li>
	<li>Dodać 2 μl roztworu oligonukleotydów do probówki mikrowirówki zawierającej λ-DNA. Dokładnie wymieszaj. 
	UWAGA: Oligo jest obecny w około 12-krotnym nadmiarze molowym nad komplementarnym końcem λ-DNA.</li>
	<li>Ogrzewać mieszaninę λ-DNA/oligo w temperaturze 65 °C przez 60 s.</li>
	<li>Powoli schłodzić mieszaninę do temperatury pokojowej. 
	UWAGA: Ten etap umożliwia wyżarzanie oligo do komplementarnego końca λ-DNA.</li>
	<li>Umieść mieszaninę na lodzie. Dodać 11 μl buforu reakcyjnego ligazy DNA T4 (końcowe stężenie buforu 1x). Delikatnie wymieszaj. Następnie dodaj 2 μl (800 jednostek) enzymu ligazy DNA T4. Delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze 16 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oczyścić produkt za pomocą odśrodkowych rurek filtracyjnych o nominalnej masie cząsteczkowej 100 kDa. W szczególności przenieść mieszaninę z etapu 1.9 do odśrodkowej rurki filtracyjnej i odwirować przy 14 000 x g przez 5 minut, przemyć dwukrotnie 400 μl buforem TE i zebrać oczyszczony produkt. 
	UWAGA: Oczyszczone biotyno-λ-DNA w buforze TE są stabilne w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku.</li>
</ol>
2. Funkcjonalność szkiełek nakrywkowych
UWAGA: Szkiełka nakrywkowe są funkcjonalizowane poprzez reakcję z silanem-PEG-biotyną. Z naszego doświadczenia wynika, że ten jednoetapowy protokół reakcji jest prostszy i bardziej niezawodny niż standardowy dwuetapowy protokół reakcji20. Funkcjonalizacja szkiełka nakrywkowego za pomocą silanu-PEG-biotyny tworzy miejsca wiązania streptawidyny i minimalizuje niespecyficzną adsorpcję DNA i białka na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
<ol>
	<li>Zanurz pięć szkiełek nakrywkowych nr 1 w 95% etanolu w słoiku do barwienia przez 10 minut, a następnie spłucz ultraczystą wodą trzy razy. 
	UWAGA: Piąte szkiełko nakrywkowe stanowi zapas w przypadku pęknięcia.</li>
	<li>Napełnij słoik do barwienia 1 M KOH, poddaj sonikacji przez 10 minut, a następnie trzykrotnie spłucz ultraczystą wodą.</li>
	<li>Powtórz cykl 2.1-2.2 dwukrotnie.</li>
	<li>Wysuszyć szkiełka nakrywkowe pod czystym, suchym strumieniem gazuN2.</li>
	<li>Następnie oczyścić i wysuszyć szkiełka nakrywkowe, stosując obróbkę plazmą powietrzną pod ciśnieniem 900 mTorr przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe z 25 mg/ml silanu-peg-biotyny rozpuszczonej w 95% etanolu w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. W szczególności umieścić 50 μl roztworu silanu-peg-biotyny między dwoma czystymi, suchymi szkiełkami nakrywkowymi i inkubować "kanapki" z szkiełkiem nakrywkowym w zamkniętym pudełku z końcówką pipety z około 10 ml wody na dnie (nie stykającej się ze szkiełkami nakrywkowymi), aby zminimalizować parowanie rozpuszczalnika.</li>
	<li>Nadmiar cząsteczek PEG zmyć ultraczystą wodą i wysuszyć szkiełka nakrywkowe pokryte PEG pod czystym, suchym przepływem gazuN2. 
	UWAGA: Funkcjonalne szkiełka nakrywkowe można przechowywać do trzech dni w warunkach otoczenia.</li>
</ol>
3. Budowa komory przepływowej
UWAGA: Komory przepływowe są konstruowane poprzez umieszczenie podwójnej taśmy klejącej z wstępnie wyciętymi kanałami pomiędzy funkcjonalizowanym PEG szkiełkiem nakrywkowym a płytą PDMS zawierającą otwory wlotowe i wylotowe. W każdej komorze przepływowej zintegrowanych jest wiele kanałów.
<ol>
	<li>Zaprojektuj kanały przepływu w oprogramowaniu CAD i przytnij kanały (szerokość, głębokość i długość każdego kanału wynoszą odpowiednio 1, 0,13 i 12 mm) na podwójnej taśmie klejącej za pomocą obcinaka do taśm (zwykle osiem kanałów jest zintegrowanych w każdej komórce przepływowej). Usuń resztki taśmy, aby utworzyć kanały przepływowe.</li>
	<li>Aby wykonać płyty PDMS, dokładnie wymieszaj 45 g PDMS z 5 g odczynnika sieciującego (wystarcza do wytworzenia dwunastu płyt PMDS o grubości 5 mm, które mogą być przechowywane w nieskończoność w warunkach otoczenia) za pomocą miksera, wlej mieszaninę do dwóch 10-centymetrowych szalek Petriego i pozostaw naczynia w komorze próżniowej, aż zasadniczo wszystkie pęcherzyki powietrza znikną (ręcznie usuń pęcherzyki powietrza, jeśli takie pozostały, gdy naczynia są wyjmowane z odkurzacza Izba Gmin). Następnie przełóż naczynia do piekarnika o temperaturze 80 °C, aż PDMS stężeje (około 2 godziny).</li>
	<li>Wytnij płytę PDMS, która pasuje do rozmiaru podwójnej taśmy klejącej z wstępnie wyciętymi kanałami. Odklej jedną folię ochronną z podwójnej taśmy klejącej i przyklej folię do płaskiej powierzchni płyty PDMS. Przebij otwory wylotowe i wlotowe w płycie PDMS za pomocą dziurkacza do biopsji z igłą o rozmiarze 23.</li>
	<li>Odklej drugą folię ochronną z podwójnej taśmy klejącej i przyklej zespół taśmy PDMS do funkcjonalizowanej powierzchni szkiełka nakrywkowego (upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest płaskie. Zobacz zdjęcie w pełni zmontowanej komory przepływowej w <silna klasa="xfig">Rysunek 1a).</li>
</ol>
4. Obrazowanie TIRF
UWAGA: Biotyna-λ-DNA są przywiązane do powierzchni kanału przepływowego, a przepływ laminarny jest stosowany do rozciągania przepływu cząsteczek DNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b). > 80% rozciągnięte cząsteczki DNA służą jako przestrzennie rozszerzone matryce do obserwacji aktywności wiązania i transportu cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. Trajektorie pojedynczych cząsteczek są śledzone za pomocą poklatkowego obrazowania TIRF (<silna klasa="xfig">Rysunek 1c i e).
<ol>
	<li>Zamocować celę przepływową na stoliku mikroskopowym i załadować wstępnie odgazowany bufor ślepej próby (10 mM fosforanu sodu, 2 mM NaCl, 50 μM EDTA, 20 mM etanolu, 5% (v/v) glicerolu, 0,01% Tween-20, 1% (v/v) β-merkaptoenol, pH 7,4), 0,2 mg/ml roztworu streptawidyny, 1 mg/ml roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 100 pM roztworu biotyny-λ-DNA do czterech zbiorników, z których każdy ma rurkę Tygon podłączoną do wartości solenoidu i inna rurka Tygon połączona z rurką PEEK poprzez nałożenie rurki Tygon na mniejszą rurkę PEEK (zapobiega cofaniu się odczynników). Odgazowanie małych objętości buforu przez nocne wystawienie na działanie próżni lub krótszą ekspozycję na próżnię z mieszaniem (do momentu, gdy pęcherzyki przestaną być widoczne).</li>
	<li>Włóż rurkę PEEK ślepego zbiornika buforowego do jednego otworu wlotowego komory przepływowej. Zalać kanał, przepływając w pustym buforze i włożyć trzy inne rurki PEEK do otworów wlotowych Przepływ każdego odczynnika sterowany ciśnieniem powietrza jest kontrolowany przez zawory elektromagnetyczne i w pełni zautomatyzowany za pomocą skryptu komputerowego. Uważaj, aby nie wywołać tworzenia się pęcherzyków powietrza w kanale.</li>
	<li>Podłącz rurkę Tygon z krótką rurką PEEK od otworu wylotowego do pojemnika na odpady. Krótki przewód PEEK na wylocie pomaga hamować tworzenie się pęcherzyków powietrza podczas infuzji, utrzymując dodatnie ciśnienie wewnątrz kanału.</li>
	<li>Wiązanie cząsteczek biotyny-λ-DNA z powierzchnią kanału przepływowego.
	<ol>
		<li>Przepłynąć w 0,2 mg/ml roztworu streptawidyny, inkubować przez 5 minut, a następnie przepłynąć do ślepej próby w celu wypłukania niezwiązanej streptawidyny.</li>
		<li>Przepłynąć w 1 mg/ml roztworu BSA, inkubować przez 1 minutę, a następnie przepłynąć do ślepej próby w celu wypłukania niezwiązanego BSA. 
		UWAGA: BSA dodatkowo hamuje adsorpcję DNA i próbki na powierzchni.</li>
		<li>Przepłynąć w 100 pM roztworze biotyny-λ-DNA, inkubować przez 10 minut, a następnie przepłynąć do ślepej próby w celu wypłukania niezwiązanych DNA. 
		UWAGA: Po związaniu DNA z powierzchnią należy unikać gwałtownych przepływów, aby zapobiec uszkodzeniu cząsteczek DNA na uwięzi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby sprawdzić jakość funkcjonalizowanego szkiełka nakrywkowego, należy wprowadzić barwnik barwiący DNA, taki jak pomarańczowy Sytox, w warunkach testu, które mają być użyte (przeczytaj 4.6 poniżej) i rozpocząć obrazowanie fluorescencyjne przy oświetleniu laserowym 532 nm. 
	UWAGA: Jakość funkcjonalizowanego szkiełka nakrywkowego jest zazwyczaj dobra, a gęstość rozciągniętych przepływowo cząsteczek DNA będzie wysoka. Niezbędne jest posiadanie wystarczająco dużej gęstości rozciągniętych przepływowo cząsteczek DNA, aby można było zaobserwować zdarzenia wiązania i przesuwania DNA/dyfuzji 1D.</li>
	<li>Dostosuj kąt TIRF, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu obrazów rozciągniętych cząsteczek DNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1d).</li>
	<li>Aby zarejestrować trajektorie pojedynczych cząsteczek poruszających się wzdłuż DNA, powtórz kroki 4.2-4.4 wewnątrz nowego kanału (bez barwnika barwiącego DNA), a następnie wstrzyknij wstępnie odgazowane sub-nanomolowe cząsteczki znakowane fluoroforem z wystarczająco dużą szybkością przepływu za pomocą pompy strzykawkowej i zbierz poklatkowe obrazy fluorescencyjne z częstotliwością odświeżania 100 Hz. 
	UWAGA: Natężenie przepływu odpowiadające liczbie Weissenberga (Wi: bezwymiarowy iloczyn najdłuższego czasu relaksacji polimeru - około 0,2 s dla λ-DNA - i szybkości ścinania - zmiany prędkości przepływu wraz z odległością od powierzchni szkiełka nakrywkowego) wynoszącej 500 wewnątrz kanału jest zalecane do obrazowania pojedynczych cząsteczek z częstotliwością odświeżania 100 Hz21.
	<ol>
		<li>Zbierz 10 000 klatek w jednym polu widzenia (FOV), aby wyprodukować film, i zbierz podobne filmy z wielu (zwykle dziesięciu) pól widzenia na próbkę. 
		UWAGA: Gęstość pojedynczych cząstek w jednym polu widzenia nie powinna być ani zbyt wysoka - co skomplikuje analizę danych, powodując, że przypisanie obiektów między ramkami będzie niejednoznaczne, ani zbyt niska - co może prowadzić do niskiego występowania zdarzeń pojedynczych cząsteczek na DNA.</li>
		<li>Zoptymalizuj intensywność oświetlenia, aby cząsteczki związane z powierzchnią szkiełka nakrywkowego były szybko wybielane foto, aby stłumić tło, podczas gdy cząsteczki dyfundujące na DNA nie były wybielane zbyt szybko, aby można było wykryć dłuższe trajektorie. 
		UWAGA: Zazwyczaj używamy gęstości mocy 200 - 800 W/cm2 w polu widzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod koniec kroku 4.6 wlej barwnik barwiący DNA, aby potwierdzić, że cząsteczki DNA mogą być nadal rozciągane przepływowo.</li>
	<li>Uruchom zarówno dodatnie, jak i ujemne próbki kontrolne. 
	UWAGA: Dobrą kontrolą pozytywną jest tetrapeptyd, tetrametylodamina(TMR)-KRRR (TMR jest sprzężona z N-końcową aminą), który ma średnią stałą dyfuzji 1D wynoszącą 10,5 ± 0,7 (błąd standardowy) M (bp2 / s) przy neutralnym pH<klasa sup = "xref">11. Dobrą kontrolą ujemną jest pomiar znakowanych próbek będących przedmiotem zainteresowania w buforze testowym w kanale, w którym nie ma uwięzi DNA, gdzie nie należy wykrywać aktywności dyfuzyjnej na DNA.</li>
</ol>
5. Analiza danych:
UWAGA: Niestandardowe oprogramowanie do śledzenia pojedynczych cząsteczek służy do identyfikacji trajektorii pojedynczych cząsteczek dyfundujących wzdłuż DNA i szacowania stałych dyfuzji. To oprogramowanie najpierw określa pozycje środka ciężkości pojedynczych cząstek z dużą dokładnością, identyfikuje cząstki, które utknęły na powierzchni szkiełka nakrywkowego, a następnie łączy cząstki w różnych ramkach, tworząc trajektorie poklatkowe. Na podstawie tych trajektorii szacuje się stałe dyfuzji 1D.
<ol>
	<li>Aby rozpocząć analizę danych, otwórz oprogramowanie skryptowe (patrz tabela materiałów) i przejdź do katalogu oprogramowania do śledzenia pojedynczych cząstek. Otwórz skrypt o nazwie "largedataprocess3.m". Jednym z ważnych parametrów, które należy zdefiniować, jest wartość progowa dla wykrywania pojedynczych cząstek.</li>
	<li>Aby określić optymalną wartość progową, uruchom skrypt "Determine_threshold_value.m". Ten skrypt wskaże, w jaki sposób wartość progowa wpływa na wykrywanie pojedynczych cząstek. Po określeniu optymalnej wartości progowej uruchom skrypt "largedataprocess3.m".</li>
	<li>Po zakończeniu analizy śledzenia pojedynczych cząstek, przefiltruj surowe trajektorie, uruchamiając skrypt "Trajectory_filtering.m". Graficzny interfejs użytkownika (GUI) jest wbudowany w wizualizację kroku filtrowania.</li>
	<li>Na panelu GUI ustaw minimalne przemieszczenie wzdłuż DNA, MinXDisp, na 2 piksele; ustaw maksymalne przemieszczenie poprzeczne do DNA, MaxYDisp, na 2 piksele; ustaw minimalną liczbę ramek, minFrames, na 10; ustaw minimalną liczbę stanów trypletu, minTriplets, na 10; ustaw minimalną stałą dyfuzji wzdłuż DNA, D_par, na 0; ustaw maksymalną szacowaną stałą dyfuzji poprzeczną do DNA, D_trans, do 10 M(bp2)S-1; ustawić minimalny parametr statystyczny, Chi2_stat, na -5; ustaw minimalny stosunek przemieszczenia wzdłuż DNA do poprzecznego do DNA, MinX/Y, na 2, 
	UWAGA: Wszystkie nieprzetworzone trajektorie, które spełniają te parametry filtrowania, są wymienione w Tabeli 1, a te, które tego nie robią, są wymienione w Tabeli 3.</li>
	<li>Kliknij numer trajektorii w Tabeli 1, trajektoria zostanie przemieszczona na Grafice 1 i 2. Kliknij przycisk "Odtwórz", aby odtworzyć surowe obrazy fluorescencyjne. Kliknij "Add_to_Table2", aby zidentyfikować trajektorię jako trajektorię ślizgania się pojedynczej cząsteczki. Ostatecznie wszystkie trajektorie dodane do Tabeli2 zostaną zapisane po zamknięciu GUI.</li>
	<li>Aby obliczyć średnie stałe dyfuzji, uruchom skrypt "Calculate_mean_diffusion_constant.m". Średnią stałą dyfuzji szacuje się na podstawie zestawu trajektorii, które przeszły wszystkie etapy filtrowania i zostały dodane do tabeli 2.</li>
</ol>

<ol><li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids.+1.+Models+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory.</a> Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).</li>
<li>Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+base-excision+DNA-repair+protein+finds+intrahelical+lesion+bases+by+fast+sliding+in+contact+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).</li>
<li>Leith, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+sliding+kinetics+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent sliding kinetics of p53.</a> P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).</li>
<li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+Viral+Proteinase+by+a+Peptide+and+DNA+in+One-dimensional+Space+IV.+Viral+proteinase+slides+along+DNA+to+locate+and+process+its+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates.</a> J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).</li>
<li>Graziano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+Viral+Proteinase+by+a+Peptide+and+DNA+in+One-dimensional+Space+II.+Adenovirus+proteinase+is+activated+in+an+unusual+one-dimensional+biochemical+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction.</a> J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).</li>
<li>Graziano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+viral+proteinase+by+a+peptide+and+DNA+in+one-dimensional+space%3A+I.+binding+to+DNA+and+to+hexon+of+the+precursor+to+protein+VI%2C+pVI%2C+of+human+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus.</a> J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).</li>
<li>Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+viral+proteinase+by+a+peptide+and+DNA+in+one-dimensional+space%3A+III.+atomic+resolution+structure+of+the+nascent+form+of+the+adenovirus+proteinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase.</a> J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).</li>
<li>Kabata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+molecules+of+RNA+polymerase+sliding+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA.</a> Science. 262, 1561-1563 (1993).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26831565">&#34;Molecular sled&#34;- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA.</a> Nature Communications. , (2016).</li>
<li>Xiong, K., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+sled+sequences+are+common+in+mammalian+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular sled sequences are common in mammalian proteins.</a> Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).</li>
<li>Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sliding+on+DNA%3A+from+peptides+to+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Sliding on DNA: from peptides to small molecules.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).</li>
<li>Turkin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speeding+up+biomolecular+interactions+by+molecular+sledding%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding.</a> Chem Sci. 7, 916-920 (2016).</li>
<li>Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+chemical+reactions+by+molecular+sledding%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Accelerating chemical reactions by molecular sledding.</a> Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).</li>
<li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
<li>Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+and+nanoscale+curtain+rods%3A+high-throughput+tools+for+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging.</a> Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Enzymes+Replicating+DNA+Using+a+Single-molecule+DNA+Stretching+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Expt%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay.</a> J Vis. Expt. , e1689(2010).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724(2012).</li>
<li>Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+estimation+of+diffusion+coefficients+from+single-particle+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22+Physical+review.+E%2C+Statistical%2C+nonlinear%2C+and+soft+matter+physics%22%5BJournal%5D)">Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories.</a> Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726(2014).</li>
<li>Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+CM+%22Hydrodynamic+Flow-stretching+Assay+for+Single-Molecule+Studies+of+Nucleic+Acid-Protein+Interactions%22">Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-Molecule+Studies+of+Protein-DNA+Interaction%3A+Diffusive+Search+and+Sequence-Dependent+Motors%22">Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors</a>. , Harvard University. (2007).</li>
<li>Gorman, J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+one-dimensional+diffusion+of+proteins+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).</li>
<li>Lin, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Bias+from+Flow+to+Elucidate+Single+DNA+Repair+Protein+Sliding+and+Interactions+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA.</a> Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).</li>
<li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecifically+bound+proteins+spin+while+diffusing+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).</li>
<li>Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+TALE+protein+dynamics+reveals+a+two-state+search+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism.</a> Nat Commun. 6, 7277(2015).</li>
<li>Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALE+proteins+search+DNA+using+a+rotationally+decoupled+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism.</a> Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).</li>
<li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57, 179-186 (2012).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).</li>
</ol>

Broad Institute może zdecydować się na składanie wniosków patentowych, które zawierają aspekty prezentowanej tu pracy.

Po przejściu z tradycyjnego dwuetapowego protokołu reakcji funkcjonalizacji szkiełka nakrywkowego na jednoetapowy protokół reakcji, zauważyliśmy, że niezawodność funkcjonalizacji szkiełka nakrywkowego uległa znacznej poprawie. Ponieważ całkowity czas przygotowania szkiełek nakrywkowych wynosi mniej niż trzydzieści minut, zalecamy przygotowanie świeżych szkiełek nakrywkowych każdego dnia, w którym planowane jest obrazowanie pojedynczej cząsteczki. W celu zminimalizowania pogorszenia jakości silanu-PEG-biotyny, odczynnik powinien być podzielony na porcje i przechowywany w suchym gazieN2 w temperaturze -20 °C po otrzymaniu. Tutaj nie używamy cząsteczek PEG, które wytwarzają grupy końcowe -COO- lub -CH3 , które były używane w ciągu ostatnich20. Ładunki ujemne grup -COO- i hydrofobowych grup -CH3 wykorzystano, aby zapobiec niespecyficznej adsorpcji odpowiednio cząsteczek DNA i określonych próbek białek na powierzchni. Obserwujemy bardzo niską adsorpcję powierzchniową przez małe próbki peptydów na całkowicie zakończonej biotyną powierzchni PEG, podczas gdy silan-PEG-COOH i/lub silan-PEG-CH3 mogą być przydatne do oznaczania niektórych próbek białek lub gdy warunki testowe (takie jak pH <7,5) sprzyjają interakcjom DNA-powierzchnia.
Przejście z modułów przepływowych ze szkła szkiełkowego na cele przepływowe PDMS przyspiesza konstrukcję komór przepływowych i umożliwia łatwą integrację wielu kanałów. Często projektujemy osiem kanałów na komórkę przepływową, aby umożliwić osiem niezależnych eksperymentów na funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe. Aby jeszcze bardziej zwiększyć przepustowość na szkiełko nakrywkowe, można zastosować jeszcze większą liczbę mikrofabrykowanych kanałów.
Wskazane jest, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza wewnątrz kanału w dowolnym momencie po wstępnym napełnieniu. Zwykle pęcherzyki powietrza nie powodują utraty uwięzionego DNA (chociaż jest to możliwe), ale raczej zakłócają przepływ i prawdopodobnie powodują przyklejanie się DNA do szkiełka nakrywkowego. Odgazowanie buforowe i dodanie niewielkich ilości środków powierzchniowo czynnych jest zazwyczaj skuteczne w zapobieganiu tworzeniu się pęcherzyków w rurze i kanale przepływowym. W przypadkach, gdy pęcherzyki powietrza są wprowadzane do rurki, spróbuj wypłukać pęcherzyki przy powolnym przepływie i upewnij się, że nie przepływają one przez obszar, w którym uwięzione są DNA.
Usprawnione i wydajne oprogramowanie do analizy danych ma kluczowe znaczenie ze względu na ogromną ilość generowanych danych. Zazwyczaj gromadzimy 700 000 obrazów o wysokiej rozdzielczości z pomiarów na jednej komórce przepływowej, które można przetworzyć za pomocą naszego niestandardowego oprogramowania do śledzenia pojedynczych cząstek w ciągu jednego dnia na komputerze stacjonarnym z czterordzeniowym procesorem i pamięcią 32 GB. Odsetek wyników fałszywie dodatnich wykrywających trajektorie dyfuzji 1D przez oprogramowanie (krok 5.5) jest zależny od próbki i może być dość niski, biorąc pod uwagę, że: 1) Gęstość pojedynczych cząstek w polu widzenia jest na tyle niska, że istnieje niewielka niejednoznaczność łącząca cząstki w różnych ramkach (próbki białek na ogół są bardziej podatne na niespecyficzną adsorpcję na szkiełku nakrywkowym niż próbki peptydów, a zatem należy zoptymalizować bufor i gęstość mocy dla każdej próbki białka); 2) Stosunek sygnału do szumu pojedynczych cząstek jest na tyle wysoki, że prawdopodobieństwo fałszywej identyfikacji cząstek jest niskie. Mimo to oprogramowanie może od czasu do czasu popełniać błędy i zalecamy ręczną kontrolę danych za pomocą dostarczonego graficznego interfejsu użytkownika w celu oceny wydajności oprogramowania. W aplikacji szczególnie wrażliwej na wykrywanie trajektorii fałszywie dodatnich parametry procesu, w tym wartość progowa, minFrames, minTriplets i Chi2_stat mogą być ustawiane bardziej rygorystycznie kosztem niższej czułości dla prawdziwych zdarzeń wiązania i potencjalnie większego błędu statystycznego w identyfikacji trajektorii. Dzielimy się i opisujemy nasze oprogramowanie do śledzenia pojedynczych cząstek z nadzieją, że pomoże to ustandaryzować metody analizy danych i pobudzić dyskusję na temat najlepszych praktyk.
W naszym protokole, który wymaga ciągłego przepływu podczas obrazowania w celu utrzymania stanu rozciągnięcia cząsteczek matrycy DNA, przepływ płynu może wpływać na transport niektórych białek wzdłuż matryc DNA, jeśli dyfundują one przez mechanizm przeskakiwania lub jeśli promień hydrodynamiczny znakowanego fluoroforu jest duży22,23. Podczas gdy takie odchylenie można zmierzyć i skorygować w większości zestawów danych, transport białek znakowanych małym fluoroforem i dyfuzyjnych za pomocą mechanizmu ślizgowego nie jest zazwyczaj obciążony w wykrywalnym stopniu przez przepływ 2,4,24. Warto zauważyć, że wpływ prędkości przepływu na transport białek wzdłuż DNA został wykorzystany do zbadania mechanizmów dyfuzji białek wzdłuż DNA23. Ściśle powiązane alternatywne podejście, które umożliwia pomiary przy braku przepływu, wykorzystuje matryce DNA z biotyną na obu końcach, które są przejściowo rozciągnięte w przepływie i przywiązane przez oba końce do szkiełka nakrywkowego, tak że cząsteczki DNA pozostają w rozszerzonej konfiguracji, gdy Przepływ jest wyłączony 25,26,27,28. Podejście oparte na podwójnej uwięzi ma tę zaletę, że umożliwia eksperymenty z transportem bez przepływu, ale wymaga modyfikacji obu końców cząsteczek matrycy DNA, starannej kontroli przepływu podczas wiązania i scharakteryzowania odległości między dwoma miejscami na uwięzi. Ponadto należy ocenić wpływ napięć heterogenicznych i dynamiki konformacyjnej DNA w cząsteczkach DNA na test pojedynczej cząsteczki.
W sumie, oprócz badania dyfuzji 1D cząsteczek wzdłuż DNA, test pojedynczej cząsteczki może przynieść korzyści wielu badaniom biochemicznym i biofizycznym in vitro na poziomie pojedynczej cząsteczki, w tym procesów wyszukiwania celu DNA przez białka, aktywności enzymatycznej na DNA i innych.
Rozwiązywanie problemów
Problem 1: Kanały przepływowe przeciekają.
Rozwiązanie: Najpierw upewnij się, że konstrukcja kanałów przepływowych pozostawia co najmniej 1,5 mm marginesu na uszczelnienie wokół i między kanałami; a następnie, podczas montażu celi przepływowej, upewnij się, że powierzchnie styku między szkiełkiem nakrywkowym, podwójną taśmą klejącą i płytą PDMS są płaskie, suche i wolne od zanieczyszczeń, że nacisk wywierany w celu utworzenia uszczelki jest równomierny i że operacja uszczelniania jest wykonywana w temperaturze pokojowej.
Problem 2: Gęstość DNA na uwięzi jest zbyt niska.
Rozwiązanie: Ten problem pojawia się, gdy wydajność funkcjonalizacji PEG jest niska lub cząsteczki DNA nie są funkcjonalizowane biotyną. Z naszego doświadczenia wynika, że gęstość DNA na uwięzi powinna być wysoka dla > 90% szkiełek nakrywkowych przygotowanych ze świeżego lub odpowiednio przechowywanego odczynnika silan-PEG-biotyna. W przypadkach, gdy gęstość DNA na uwięzi jest niska przy sprawdzonej partii biotyny-λ-DNA, spróbuj zwiększyć stężenie silanu-PEG-biotyny podczas funkcjonalizacji PEG oraz stężenie streptawidyny i biotyny-λ-DNA podczas wiązania DNA. Jeśli to się nie powiedzie, wymień odczynniki PEG i streptawidyny.
Problem 3: DNA przykleja się do szkiełka nakrywkowego i nie może być rozciągnięte przez przepływ.
Rozwiązanie: Ten problem może również wystąpić, gdy wydajność funkcjonalizacji PEG jest niska i pogarsza się przez niskie pH testu. Spróbuj wprowadzić więcej BSA lub podnieść pH (np. do 8,0), aby pomóc stłumić adsorpcję DNA na powierzchni (krok 4.3.2). Jeśli adsorpcja DNA jest uporczywym problemem w określonych warunkach testu, spróbuj włączyć do 90% silanu-PEG-COOH podczas funkcjonalizacji PEG.
UWAGI DOTYCZĄCE ANALIZY DANYCH:
Używamy niestandardowego oprogramowania do śledzenia pojedynczych cząstek, aby zidentyfikować trajektorie pojedynczych cząsteczek dyfundujących wzdłuż DNA, na podstawie których szacowane są ich stałe dyfuzji 1D, D1. Aby usprawnić analizę danych, wdrożyliśmy algorytm symetrii radialnej18 do lokalizacji cząstek oraz estymator oparty na kowariancji19 do szacowania stałych dyfuzji 1D, co znacznie przyspieszyło analizę danych bez uszczerbku dla dokładności. Wcześniej przeprowadziliśmy walidację niestandardowego oprogramowania, analizując symulowane dane11. Główne kroki opisano poniżej.
Identyfikacja cząstek:
Ten etap służy do wykrywania i segmentacji cząstek - plam o ograniczonej dyfrakcji - od tła. Najpierw przestrzennie filtruj pasmowo-przepustowo obrazy, aby wzmocnić sygnał cząstek w zakresie 3-5 pikseli (co odpowiada rozmiarowi funkcji rozproszenia punktowego w naszym systemie), a następnie próg oparty na intensywności (patrz skrypt: spt2_SD_sandbox.m).
Przypisanie środka ciężkości
Segmentacja obrazu lokalizuje cząsteczki tylko w rozdzielczości przestrzennej na poziomie pikseli. Aby zlokalizować cząsteczki ze znacznie większą precyzją, zastosuj algorytm superrozdzielczości symetrii radialnej18 do obrazów przefiltrowanych jak powyżej. (Ta metoda opiera się na obliczeniach analitycznych, a zatem znacznie zmniejsza obciążenie obliczeniowe w porównaniu z innymi popularnymi metodami o wysokiej dokładności, takimi jak dopasowanie Gaussa 2D (patrz skrypt: spt2_SD_sandbox.m).)
Śledzenie cząstek: 
Aby śledzić trajektorię cząstki w czasie, musimy ponownie zidentyfikować te same cząstki, gdy poruszają się między ramkami. Uważamy, że etapy inicjacji, mrugania i zakończenia są składnikami trajektorii. Ograniczamy powiązanie cząstek w bieżących klatkach z tymi pojawiającymi się w poprzednich klatkach za pomocą maksymalnego przemieszczenia dozwolonego na klatkę. W przypadkach, w których możliwe jest wielokrotne powiązania, algorytm Jonkera-Volgenanta jest używany do uzyskania globalnie optymalnych zestawów powiązań (patrz skrypt: traceTraj4_kx.3.m).
Oszacowanie D1: 
Aby oszacować wartości D1 na podstawie trajektorii, używamy estymatora opartego na kowariancji (CVE)19. Na podstawie obliczeń analitycznych metoda ta jest bardziej wydajna obliczeniowo i statystycznie rygorystyczna niż inne powszechnie stosowane metody, takie jak regresja średnich przemieszczeń kwadratowych (patrz skrypt: runspt5_SD.m).
Filtrowanie trajektorii:
Niektóre trajektorie zawierają artefakty, takie jak połączenie z cząsteczkami związanymi z powierzchnią, i muszą zostać usunięte. Zaimplementowaliśmy kilka cech, takich jak minimalne przemieszczenie równoległe do DNA, maksymalne przemieszczenie poprzeczne do DNA, minimalna długość trajektorii, minimalna liczba kolejnych wykrytych pozycji trypletów oraz minimalny wynik prawdopodobieństwa (definicja znajduje się w Xiong i wsp.11 ), które można filtrować w celu wyizolowania minimalnie obciążonego zestawu trajektorii, które mogą reprezentować cząsteczki dyfundujące na DNA (patrz skrypt: sptViewFig2_update3x.m).

Długotrwałym problemem w biologii jest to, jak endogenne białka, które działają w określonych miejscach genomu, mogą lokalizować swoje cele DNA wystarczająco szybko, aby organizm mógł przetrwać i skutecznie reagować na swoje środowisko. Badania przeprowadzone w ciągu ostatnich czterdziestu lat zaproponowały i w dużej mierze wspierają hipotezę, że kinetyka poszukiwania celu DNA przez białko może być przyspieszona przez ułatwioną dyfuzję, w której białko przechodzi naprzemiennie między dyfuzją 3D w masie a dyfuzją 1D (w tym procesami ślizgania i przeskakiwania) wzdłuż klasy DNA1. Obecnie wiadomo, że wiele białek biorących udział w regulacji genów, metabolizmie kwasów nukleinowych i innych procesach jest zdolnych do ślizgania się po DNA2,3,4,5,6,7,8,9. Co więcej, ostatnie badania wykazały, że nawet małe peptydy mogą wiązać się z DNA i ślizgać się po nim, ze zdolnością do przenoszenia ładunku; na przykład cząsteczka białka lub starter PCR, wzdłuż DNA10,11,12,13,14.
W ciągu ostatnich 15 lat, test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki był szeroko stosowany do badania wiązania i dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA2,15,16. W tego typu testach, biotynylowane dwuniciowe cząsteczki DNA są unieruchamiane na powierzchni i stosuje się przepływ laminarny w celu rozciągnięcia DNA. Rozciągnięte w > 80% DNA służą jako przestrzennie rozszerzone matryce do badania aktywności wiązania i transportu cząsteczek znakowanych fluoroforami, w których trajektorie pojedynczych cząsteczek wzdłuż DNA są śledzone przez poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne. W naszej implementacji, zoptymalizowanej pod kątem odtwarzalności i łatwości użycia, test ten składa się z pięciu głównych etapów: przygotowania biotyny-λ-DNA, funkcjonalizacji szkiełka nakrywkowego, budowy komórek przepływowych, obrazowania fluorescencyjnego i analizy danych. W poprzednich protokołach17, szklane szkiełka nakrywkowe były funkcjonalizowane najpierw przez reakcję z (3-aminopropylo)trietoksysilanem (APTES), a następnie z odczynnikami z glikolu polietylenowego (PEG) reagującymi aminą (np. NHS-PEG-biotyna) w celu utworzenia warstwy PEG, która jest odporna na niespecyficzną adsorpcję składników testowych na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Jakość funkcjonalizowanych szkiełek nakrywkowych w dużej mierze zależała od jakości odczynników PEG i warunków reakcji na każdym etapie. Nasz protokół opisuje uproszczony protokół funkcjonalizacji i konstrukcję multipleksowej komory przepływowej, która nie wymaga płynnego kleju ani czasu utwardzania w dniu montażu komórek przepływowych. Opisujemy również uproszczoną i solidną procedurę analizy danych11, która eliminuje intensywne obliczeniowo kroki regresji poprzez zastosowanie metody symetrii radialnej do lokalizacji centroidów18 i estymatora stałej dyfuzji opartej na kowariancji19.
Tutaj przedstawiamy prostą, solidną i wysokoprzepustową implementację testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki ze znaczącymi ulepszeniami w funkcjonalizacji szkiełek nakrywkowych, budowie komórek przepływowych i analizie danych. W szczególności opracowaliśmy jednoetapowy protokół funkcjonalizacji szkiełek nakrywkowych, w którym czyste, suche szkiełka nakrywkowe reagują bezpośrednio z silanem-PEG-biotyną. Protokół ten upraszcza przygotowanie szkiełek nakrywkowych i poprawia niezawodność jakości funkcjonalizowanych powierzchni w porównaniu ze standardowym dwuetapowym protokołem reakcji. Opisujemy zastosowanie tak funkcjonalizowanych szkiełek nakrywkowych z wielokanałowymi komórkami przepływowymi PDMS, które umożliwiają wykonanie solidnych połączeń rurek bez użycia kleju. Te komory przepływowe zawierają ponadto wiele sterowanych komputerowo wlotów dla każdej komory przepływowej, które umożliwiają zautomatyzowany przepływ odczynników w celu skrócenia czasu pracy podczas konfiguracji i zwiększenia przepustowości testu.

<table><tbody><tr><td>Oligo znakowany biotyną, 5'-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotyna-3'</td><td>IDT</td><td>Niestandardowa synteza oligonugotypów</td><td>Wystarczające jest standardowe oczyszczanie odsalające</td></tr><tr><td>&lambda;-DNA</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N3011S</td><td>Wytwarzaj porcje i minimalizuj numer cyklu zamrażania-rozmrażania</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4 i bufor reakcji ligacji</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0202S</td> Odśrodkowe rurki <td></td></tr><tr><td>filtracyjne Amicon z NMWL 100k Dalton</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510008</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe nr 1</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Czysty etanol</td><td>VWR</td><td>89125-186</td><td></td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Myjka plazmowa, model nr. PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silane-peg-biotyna</td><td>Nanocs</td><td>PG2-BNSL-5k</td><td>Przechowywać w temperaturze -20oC w suchym gazie azotowym</td></tr><tr><td>A Oprogramowanie CAD</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD</td><td></td></tr><tr><td>Podwójna taśma klejąca</td><td>Zastosowania kleju</td><td>8512-2-DP/DL</td><td></td></tr><tr><td>Obcinarka do taśm, model nr. CE5000-40-CRP</td><td>Graphtec America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS i zestaw odczynników sieciowych</td><td>R.S. Hughes</td><td>RTV615 CLEAR 010</td><td></td></tr><tr><td>Komora odgazowująca, nr modelu F42010-0000</td> Mieszalnik produktów <td></td><td></td><td>BEL-ART</td></tr><tr><td>, nr modelu ARV-310</td><td>Thinky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz, Harris Uni-Cores, rozmiar 0,5 mm</td><td>Harris Uni-Cores</td><td></td><td>Można to zastąpić ręcznym dziurkaczem do biopsji z igłą o podobnym rozmiarze Rurka</td></tr><tr><td>Tygon</td> Cole <td>Parmer</td><td>EW-06420-02</td><td>0,020" ID, 0,060"OD</td></tr><tr><td>Rurka Peek</td><td>Western Analytical</td><td>PK007-031-Y</td><td>0,007" ID, 0,031"OD</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N7021S Albumina</td><td></td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Sytox pomarańczowa plama kwasu nukleinowego</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Ti-E</td><td>Mikroskop Nikon</td><td></td><td>, aparat, obiektyw, lustro dichroiczne i filtr pasmowoprzepustowy można zastąpić podobnym sprzętem</td></tr><tr><td>100x Obiektyw, NA/1.49, CFI Apo TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>aparat Hammamatsu</td><td>Orca Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic lustro</td><td>Semrock</td><td>FF560/659-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-577/690-25</td><td></td></tr><tr><td>Laser 532 nm</td><td>Rayscience Innovation Limited, Szanghaj</td><td>OEMLL-FN-532nm-C</td><td>Wybierz długość fali odpowiadającą wybranej barwie</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Chemxy</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>TMR-KRRR, czystość >=85% MIT</td><td>Biopolimer lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pVIc-Cy3B, oczyszczony HPLC</td><td>Prezent od dr Waltera Mangela z Brookhaven National Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do programowania skryptów</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td></td></tr><tr><td>* Zobacz listę części zaworów elektromagnetycznych, interfejs komputerowy i instrukcje montażu pod adresem: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż dna

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Opisujemy prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania dyfuzji 1D cząsteczek wzdłuż DNA. W tym teście szklane szkiełka nakrywkowe są funkcjonalizowane w jednoetapowej reakcji z silanem-PEG-biotyną. Komory przepływowe są konstruowane poprzez umieszczenie taśmy klejącej z wstępnie wyciętymi kanałami między funkcjonalnym szkiełkiem nakrywkowym a płytą PDMS zawierającą otwory wlotowe i wylotowe. Wiele kanałów jest zintegrowanych w jednej komorze przepływowej, a przepływ odczynników do każdego kanału może być w pełni zautomatyzowany, co znacznie zwiększa przepustowość testu i skraca czas pracy na test. Wewnątrz każdego kanału biotyna-λ-DNA są unieruchomione na powierzchni i stosuje się przepływ laminarny w celu rozciągnięcia DNA. Cząsteczki DNA są rozciągnięte do >80% swojej długości konturowej i służą jako przestrzennie rozszerzone matryce do badania aktywności wiązania i transportu fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek. Trajektorie pojedynczych cząsteczek są śledzone za pomocą poklatkowego obrazowania z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia (TIRF). Surowe obrazy są analizowane przy użyciu usprawnionego, niestandardowego oprogramowania do śledzenia pojedynczych cząstek, aby automatycznie identyfikować trajektorie pojedynczych cząsteczek dyfundujących wzdłuż DNA i szacować ich stałe dyfuzji 1D.

Rysunek 2a przedstawia wykryte trajektorie cząsteczek pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B jest sprzężony z resztą cysteiny) dyfundujących w DNA w buforze 2 mM NaCl o pH 6.5. Dyfuzja pVIc jest dwukierunkowa i napędzana energią termiczną otoczenia. Na podstawie tych trajektorii dla każdej z nich oszacowano jednowymiarowe stałe dyfuzji (wartości D1) (patrz histogram na Rysunku 2b). Średnia wartość D1 dla tego koniugatu pVIc została obliczona na 22.2 ± 0.9 (błąd standardowy) M(bp2/s) poprzez uśrednienie każdej wartości D1 z trajektorii, z uwzględnieniem wag zależnych od liczby tripletów kolejnych wywołań pozycji zawartych w każdej trajektorii.
<img alt="Schemat mikrofluidycznej stacji roboczej PCR; analiza przepływu DNA za pomocą mikroskopii i detekcji fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Aparatura do śledzenia ruchu pojedynczych cząsteczek wzdłuż DNA. 
a) Ośmiokanałowy mikrofluidyczny chip z PDMS przytwierdzony do funkcjonalizowanej lamielki, do której można przywiązać DNA (moneta 25 centów USA służy jako skala); b) Schemat powiększenia komory przepływowej przedstawiający rozciągnięte przepływem cząsteczki λ-DNA; c) Schemat mikroskopu TIRF i układu przepływowego do rozciągania DNA; d) Obraz TIRF rozciągniętego przepływem λ-DNA; e) Obraz TIRF cząsteczek pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B jest sprzężony z resztą cysteiny) związanych z rozciągniętym przepływem λ-DNA. Rysunek został zmodyfikowany za zgodą2,12. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres mobilności DNA i histogram dyfuzji, x(t), y(t) względem czasu oraz rozkład częstości D1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Jednowymiarowa dyfuzja pVIc (GVQSLKRRRCF) wzdłuż DNA. 
a). Dyfuzja pVIc wzdłuż rozciągniętych przepływem λ-DNA (137 trajektorii) w buforze 2 mM NaCl o pH 6.5. x(t) i y(t) to odpowiednio przesunięcia wzdłuż i w poprzek λ-DNA. Poziome linie przerywane wskazują brakujące punkty wynikające z migotania barwnika. b). Histogram stałej dyfuzji D1 dla pVIc dyfundującego wzdłuż λ-DNA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół demonstruje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania jednowymiarowej (1D) dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie prostego, niezawodnego i wysokoprzepustowego testu rozciągania pojedynczych cząsteczek w przepływie do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności lambda-DNA znakowanego biotyną, poprzez ligację znakowanego biotyną oligonukleotydu do lambda-DNA. Drugim krokiem jest przygotowanie szkiełek nakrywkowych funkcjonalizowanych glikolem polietylenowym (PEG) zgodnie z protokołem reakcji jednowstępowej.Następnie konstruuje się wysokoprzepływową celę przepływową, umieszczając taśmę dwustronną z wyciętymi kanałami pomiędzy funkcjonalizowanym PEG szkiełkiem nakrywką a płytką z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającą otwory wlotowe i wylotowe. Ostatnim krokiem jest śledzenie trajektorii pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych w kanale przepływowym przy użyciu obrazowania TIRF (całkowite wewnętrzne odbicie fluorescencji) w trybie time-lapse. W celu identyfikacji trajektorii pojedynczych cząsteczek dyfundujących wzdłuż rozciągniętego przez przepływ lambda-DNA wykorzystuje się niezawodne i wydajne, specjalistyczne oprogramowanie do śledzenia pojedynczych cząsteczek w celu analizy surowych obrazów fluorescencyjnych.Głównymi zaletami tej konfiguracji analizy w porównaniu do alternatyw są niezawodność przygotowania szkiełek nakrywkowych, większa przepustowość, skrócony czas bezpośredniej pracy przy przygotowywaniu próbek oraz bardziej usprawniona, nienadzorowana analiza danych. Procedurę zaprezentuje pracownik postdoktorancki w moim laboratorium, dr Kan Xiong. Przed rozpoczęciem analizy należy przygotować wszystkie niezbędne odczynniki zgodnie z opisem w tekście protokołu.Podgrzać roztwór lambda-DNA o stężeniu 0,5 mg/ml do 65 °C przez 60 s i natychmiast przenieść do mokrego lodu. W probówce do mikrowirówki wymieszać 100 µl roztworu lambda-DNA z 2 µl 10 µM biotynowanego oligonukleotydu. Podgrzać mieszaninę w temperaturze 65 °C przez 60 s, a następnie powoli schłodzić do temperatury pokojowej.Umieścić mieszaninę w lodzie. Dodać 11 µL buforu do reakcji ligazy DNA T4 i delikatnie wymieszać. Następnie dodać dwa µL odpowiadające 800 jednostkom ligazy DNA T4 i delikatnie wymieszać.Inkubować mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze 16°C lub przez noc w temperaturze 4°C. Produkt oczyścić, używając rurek z filtrem do wirowania o nominalnej granicy odcięcia masy cząsteczkowej 100 kDa. Poddać sonikacji szkiełka nakrywki numer jeden w 95% etanolu w słojku do barwienia przez 10 minut, a następnie trzykrotnie przepłukać wodą ultrapurystyczną.Napełnij naczynie do barwienia jedenmolarowym wodorotlenkiem potasu, ponownie poddaj sonikacji przez 10 minut, a następnie trzykrotnie opłucz wodą ultraczystą. Powtórz ten cykl dwukrotnie. Osusz szkiełka coverglass pod strumieniem czystego, suchego azotu.Dalsze oczyszczanie i suszenie szkiełek nakrywkowych należy przeprowadzić poprzez obróbkę plazmą powietrzną pod ciśnieniem 900 millitorr przez pięć minut. Szkiełka nakrywkowe inkubuje się z 50 µL silanu-glikolu polietylenowego-biotyny o stężeniu 25 mg/mL rozpuszczonego w 95% etanolu w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Nadmiar glikolu polietylenowego należy wypłukać wodą ultrapurą, a szkiełka nakrywkowe pokryte glikolem polietylenowym wysuszyć w strumieniu czystego, suchego azotu.Zaprojektuj kanały przepływowe w programie CAD, a następnie wytnij je w dwustronnej taśmie za pomocą wycinarki do taśm. Usuń pozostałości taśmy z wnętrza kanałów. Aby przygotować płyty PDMS, dokładnie wymieszaj 45 g PDMS z pięcioma gramami czynnika sieciującego za pomocą miksera.Wlej mieszaninę do dwóch 100 milimetrowych szalek Petriego i pozostaw je w komorze próżniowej przez około 30 minut, aż znikną wszystkie pęcherzyki powietrza. Pozostaw szalki w piekarniku nagrzanym do 80 stopni Celsjusza przez około dwie godziny, aż PDMS stężeje. Wytnij blok PDMS o rozmiarze odpowiadającym dwustronnej taśmie z wyciętymi kanałami.Zdejmij jedną folię ochronną z dwustronnej taśmy i przyklej ją do płaskiej strony bloku PDMS. Wypuść otwory wlotowe i wylotowe w bloku PDMS, używając wycinaka do biopsji z igłą 23G. Zdejmij drugą folię ochronną z dwustronnej taśmy i przyklej ją do funkcjonalizowanej powierzchni szkiełka nakrywkowe.Zamocuj złożoną komorę przepływową w adapterze stolika mikroskopu. Napełnij wszystkie uprzednio odgazowane odczynniki w zbiornikach, do których podłączone są rurki Tygon prowadzące do zaworów elektromagnetycznych oraz kolejne rurki połączone z rurką PEEK, która zapobiegnie cofaniu się odczynników. Przepływ odczynników jest regulowany przez zawory elektromagnetyczne sterowane za pomocą aplikacji do programowania skryptów.Przygotuj jeden kanał przepływowy, przepuszczając przez niego czysty bufor. Włóż trzy pozostałe rurki PEEK do otworów wlotowych. Należy uważać, aby nie doprowadzić do powstania pęcherzyków powietrza wewnątrz kanału.Połącz wężyk Tygon z krótkim wężykiem PEEK, prowadząc go od otworu wylotowego do pojemnika na odpady z próbek. Przepuść roztwór Streptavidyny o stężeniu 0,2 mg/ml i inkubuj przez pięć minut. Następnie przepuść pusty bufor, aby wypłukać niezwiązaną Streptavidynę.Przepuść roztwór albuminy surowicy bydlęcej o stężeniu 1 mg/mL i inkubuj przez 1 minutę. Następnie przepuść pusty bufor, aby wypłukać niezwiązaną albuminę surowicy bydlęcej. Przepuść roztwór biotynowanego $\lambda$-DNA o stężeniu 100 pM i inkubuj przez 10 minut.Następnie przepuść pusty bufor, aby wypłukać niezwiązane lambda-DNA. Aby sprawdzić jakośćy szkiełka podstawowego funkcjonalizowanego PEG, przepuść barwnik do DNA, taki jak barwnik SYTOX Orange, i rozpocznij obrazowanie fluorescencyjne. Jeśli jakość szkiełka podstawowego jest wysoka, gęstość rozciągniętych w przepływie lambda-DNA będzie wysoka.Należy również dostroić kąt TIRF, aby uzyskać najwyższy stosunek sygnału do szumu w obrazach niemal całkowicie rozciągniętych w przepływie cząsteczek lambda-DNA. Aby śledzić trajektorie pojedynczych cząsteczek, należy rozpocząć inkubację w nowym kanale, a następnie wprowadzić subnanomolarne cząsteczki znakowane fluoroforem przy odpowiednio wysokiej prędkości przepływu przy użyciu pompy strzykawkowej i rejestrować sekwencje obrazów fluorescencyjnych z częstotliwością klatek 100 Hertz. Zazwyczaj w jednym polu widzenia rejestruje się 10 000 klatek, a nagrania są zbierane z wielu pól widzenia.Na koniec ponownie wprowadzono barwnik do wybarwiania DNA, aby potwierdzić, że cząsteczki DNA nadal mogą być rozciągane w przepływie. Do identyfikacji trajektorii pojedynczych cząsteczek dyfundujących wzdłuż DNA zostanie użyte specjalistyczne oprogramowanie do śledzenia pojedynczych cząsteczek. Oprogramowanie to najpierw z wysoką dokładnością wyznaczy pozycje centroidów pojedynczych cząsteczek.Usuń cząsteczki przytwierdzone do powierzchni szkiełka nakrywkowego, a następnie powiąż cząsteczki w różnych klatkach obrazu, aby utworzyć trajektorie w funkcji czasu. Na podstawie tych trajektorii zostaną oszacowane jednowymiarowe stałe dyfuzji. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz aplikację do programowania skryptów i przejdź do katalogu oprogramowania do śledzenia pojedynczych cząsteczek.Otwórz skrypt o nazwie largedataprocess3.m. Ważnym parametrem do zdefiniowania jest wartość progu detekcji pojedynczych cząstek. Aby wyznaczyć optymalną wartość progu, uruchom program determine_threshold_value.skrypt m. Skrypt ten pozwoli zwizualizować, w jaki sposób wartość progu wpływa na detekcję pojedynczych cząstek. Po wyznaczeniu optymalnej wartości progu uruchom largedataprocess3.skrypt .m. Po zakończeniu analizy śledzenia pojedynczych cząsteczek surowe trajektorie zostaną przefiltrowane poprzez uruchomienie skryptu trajectory_filtering.m.Stworzono interfejs graficzny użytkownika (GUI), aby zwizualizować etap filtrowania. W panelu GUI ustaw minimalne przemieszczenie wzdłuż DNA, MinXDisp, na dwie piksele. Ustaw maksymalne przemieszczenie poprzeczne do DNA, MaxYDisp, na dwie piksele.Ustaw minimalną liczbę klatek, minFrames, na 10. Ustaw minimalną liczbę stanów tripletu, minTriplets, na 10. Ustaw minimalną stałą dyfuzji wzdłuż DNA, D_par, na zero.Ustaw maksymalną szacowaną stałą dyfuzji prostopadłej do DNA, D_trans, na 10 mega base pair squared per second. Ustaw minimalny parametr statystyczny, Chi2 Stat, na minus pięć. Ustaw minimalny stosunek przemieszczenia wzdłuż DNA do przemieszczenia prostopadłego do DNA, MinX/Y, na dwa.Wszystkie surowe trajektorie, które spełnią te parametry filtrowania, zostaną wymienione w tabeli jeden, a te, które ich nie spełnią, zostaną wymienione w tabeli trzy. Kliknij numer trajektorii w tabeli jeden. Trajektoria zostanie wyświetlona na grafikach jeden i dwa.Kliknij przycisk odtwarzania, aby wyświetlić surowe obrazy fluorescencji. Kliknij „dodaj do table2”, jeśli dana trajektoria jest trajektorią poślizgu pojedynczej cząsteczki. Na koniec wszystkie trajektorie dodane do table2 zostaną zapisane podczas zamykania interfejsu graficznego (GUI).Trajektorie, które przeszły wszystkie etapy filtrowania, są łączone w jedną grupę, z której zostanie oszacowana średnia stała dyfuzji. Aby obliczyć średnie stałe dyfuzji, należy uruchomić skrypt calculate_mean_diffusion_constant.m. Procedura ta będzie pomocna dla wielu osób badających biofizykę pojedynczych cząsteczek in vitro.

a-simple-robust-high-throughput-single-molecule-flow-stretching-assay

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Ilustrujemy zastosowanie osiowych pęset optycznych o stałej sile do badania właściwości mechanicznych krótkich cząsteczek DNA. Poprzez rozciąganie DNA wzdłuż osi minimalizujemy zawady steryczne oraz artefakty występujące w konwencjonalnej manipulacji bocznej, co pozwala nam badać cząsteczki DNA o długości nawet ~100 nm.

Rozciąganie krótkich sekwencji DNA za pomocą osiowych pęset optycznych o stałej sile

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

To badanie przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną do pomiaru dynamiki pętli dwuniciowego DNA za pomocą jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Protokół opisuje również, w jaki sposób wyodrębnić zapętloną gęstość prawdopodobieństwa zwaną współczynnikiem J.

Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

Prezentujemy podejście do wizualizacji dużych cząsteczek DNA wybarwionych peptydem wiążącym fluorescencyjne białko (FP-DBP) na uwięzi na powierzchni glikolu polietylenowego (PEG) i szkła pokrytego awidyną i rozciąganych za pomocą mikroprzepływowych przepływów ścinających.

Wizualizacja dużych cząsteczek DNA na uwięzi powierzchniowej z peptydem wiążącym DNA z białkiem fluorescencyjnym

Prezentowany tutaj jest protokół do wykonywania transferu energii rezonansu Förstera dla pojedynczej cząsteczki w celu zbadania rozdzielczości HJ. Dwukolorowe wzbudzenie przemienne służy do wyznaczania stałych dysocjacji. Jednokolorowy smFRET poklatkowy jest następnie stosowany w testach rozszczepienia w czasie rzeczywistym w celu uzyskania rozkładu czasu przebywania przed rozdzielczością HJ.

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Ta metoda mierzy skłonność komórki do pękania unieruchomionych dupleksów DNA prezentujących ligand, aby zgłosić względne siły przyciągania komórkowego. Pęknięte oligonukleotydy fluorescencyjne są dostarczane do komórki i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując historię mechaniczną komórki. Pozwala to na wysokoprzepustowy pomiar generowania siły komórkowej w kontekście mechanofentypowania komórkowego.

Wysokoprzepustowy pomiar mechanotypu komórkowego metodą cytometrii przepływowej w oparciu o pęknięcie i dostarczenie sond napięcia DNA do komórek

Poznaj metodę rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania dyfuzji 1D cząsteczek wzdłuż DNA. Protokół obejmuje przygotowanie DNA z biotyną, funkcjonalizację szkiełek PEG, budowę komórki przepływowej oraz obrazowanie TIRF.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA (Wideo) | JoVE Journal

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Przeglądaj więcej filmów