Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie prostego, niezawodnego i wysokoprzepustowego testu rozciągania pojedynczych cząsteczek w przepływie do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności lambda-DNA znakowanego biotyną, poprzez ligację znakowanego biotyną oligonukleotydu do lambda-DNA. Drugim krokiem jest przygotowanie szkiełek nakrywkowych funkcjonalizowanych glikolem polietylenowym (PEG) zgodnie z protokołem reakcji jednowstępowej.

Następnie konstruuje się wysokoprzepływową celę przepływową, umieszczając taśmę dwustronną z wyciętymi kanałami pomiędzy funkcjonalizowanym PEG szkiełkiem nakrywką a płytką z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającą otwory wlotowe i wylotowe. Ostatnim krokiem jest śledzenie trajektorii pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych w kanale przepływowym przy użyciu obrazowania TIRF (całkowite wewnętrzne odbicie fluorescencji) w trybie time-lapse. W celu identyfikacji trajektorii pojedynczych cząsteczek dyfundujących wzdłuż rozciągniętego przez przepływ lambda-DNA wykorzystuje się niezawodne i wydajne, specjalistyczne oprogramowanie do śledzenia pojedynczych cząsteczek w celu analizy surowych obrazów fluorescencyjnych.

Głównymi zaletami tej konfiguracji analizy w porównaniu do alternatyw są niezawodność przygotowania szkiełek nakrywkowych, większa przepustowość, skrócony czas bezpośredniej pracy przy przygotowywaniu próbek oraz bardziej usprawniona, nienadzorowana analiza danych. Procedurę zaprezentuje pracownik postdoktorancki w moim laboratorium, dr Kan Xiong. Przed rozpoczęciem analizy należy przygotować wszystkie niezbędne odczynniki zgodnie z opisem w tekście protokołu.

Podgrzać roztwór lambda-DNA o stężeniu 0,5 mg/ml do 65 °C przez 60 s i natychmiast przenieść do mokrego lodu. W probówce do mikrowirówki wymieszać 100 µl roztworu lambda-DNA z 2 µl 10 µM biotynowanego oligonukleotydu. Podgrzać mieszaninę w temperaturze 65 °C przez 60 s, a następnie powoli schłodzić do temperatury pokojowej.

Umieścić mieszaninę w lodzie. Dodać 11 µL buforu do reakcji ligazy DNA T4 i delikatnie wymieszać. Następnie dodać dwa µL odpowiadające 800 jednostkom ligazy DNA T4 i delikatnie wymieszać.

Inkubować mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze 16°C lub przez noc w temperaturze 4°C. Produkt oczyścić, używając rurek z filtrem do wirowania o nominalnej granicy odcięcia masy cząsteczkowej 100 kDa. Poddać sonikacji szkiełka nakrywki numer jeden w 95% etanolu w słojku do barwienia przez 10 minut, a następnie trzykrotnie przepłukać wodą ultrapurystyczną.

Napełnij naczynie do barwienia jedenmolarowym wodorotlenkiem potasu, ponownie poddaj sonikacji przez 10 minut, a następnie trzykrotnie opłucz wodą ultraczystą. Powtórz ten cykl dwukrotnie. Osusz szkiełka coverglass pod strumieniem czystego, suchego azotu.

Dalsze oczyszczanie i suszenie szkiełek nakrywkowych należy przeprowadzić poprzez obróbkę plazmą powietrzną pod ciśnieniem 900 millitorr przez pięć minut. Szkiełka nakrywkowe inkubuje się z 50 µL silanu-glikolu polietylenowego-biotyny o stężeniu 25 mg/mL rozpuszczonego w 95% etanolu w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Nadmiar glikolu polietylenowego należy wypłukać wodą ultrapurą, a szkiełka nakrywkowe pokryte glikolem polietylenowym wysuszyć w strumieniu czystego, suchego azotu.

Zaprojektuj kanały przepływowe w programie CAD, a następnie wytnij je w dwustronnej taśmie za pomocą wycinarki do taśm. Usuń pozostałości taśmy z wnętrza kanałów. Aby przygotować płyty PDMS, dokładnie wymieszaj 45 g PDMS z pięcioma gramami czynnika sieciującego za pomocą miksera.

Wlej mieszaninę do dwóch 100 milimetrowych szalek Petriego i pozostaw je w komorze próżniowej przez około 30 minut, aż znikną wszystkie pęcherzyki powietrza. Pozostaw szalki w piekarniku nagrzanym do 80 stopni Celsjusza przez około dwie godziny, aż PDMS stężeje. Wytnij blok PDMS o rozmiarze odpowiadającym dwustronnej taśmie z wyciętymi kanałami.

Zdejmij jedną folię ochronną z dwustronnej taśmy i przyklej ją do płaskiej strony bloku PDMS. Wypuść otwory wlotowe i wylotowe w bloku PDMS, używając wycinaka do biopsji z igłą 23G. Zdejmij drugą folię ochronną z dwustronnej taśmy i przyklej ją do funkcjonalizowanej powierzchni szkiełka nakrywkowe.

Zamocuj złożoną komorę przepływową w adapterze stolika mikroskopu. Napełnij wszystkie uprzednio odgazowane odczynniki w zbiornikach, do których podłączone są rurki Tygon prowadzące do zaworów elektromagnetycznych oraz kolejne rurki połączone z rurką PEEK, która zapobiegnie cofaniu się odczynników. Przepływ odczynników jest regulowany przez zawory elektromagnetyczne sterowane za pomocą aplikacji do programowania skryptów.

Przygotuj jeden kanał przepływowy, przepuszczając przez niego czysty bufor. Włóż trzy pozostałe rurki PEEK do otworów wlotowych. Należy uważać, aby nie doprowadzić do powstania pęcherzyków powietrza wewnątrz kanału.

Połącz wężyk Tygon z krótkim wężykiem PEEK, prowadząc go od otworu wylotowego do pojemnika na odpady z próbek. Przepuść roztwór Streptavidyny o stężeniu 0,2 mg/ml i inkubuj przez pięć minut. Następnie przepuść pusty bufor, aby wypłukać niezwiązaną Streptavidynę.

Przepuść roztwór albuminy surowicy bydlęcej o stężeniu 1 mg/mL i inkubuj przez 1 minutę. Następnie przepuść pusty bufor, aby wypłukać niezwiązaną albuminę surowicy bydlęcej. Przepuść roztwór biotynowanego $\lambda$-DNA o stężeniu 100 pM i inkubuj przez 10 minut.

Następnie przepuść pusty bufor, aby wypłukać niezwiązane lambda-DNA. Aby sprawdzić jakośćy szkiełka podstawowego funkcjonalizowanego PEG, przepuść barwnik do DNA, taki jak barwnik SYTOX Orange, i rozpocznij obrazowanie fluorescencyjne. Jeśli jakość szkiełka podstawowego jest wysoka, gęstość rozciągniętych w przepływie lambda-DNA będzie wysoka.

Należy również dostroić kąt TIRF, aby uzyskać najwyższy stosunek sygnału do szumu w obrazach niemal całkowicie rozciągniętych w przepływie cząsteczek lambda-DNA. Aby śledzić trajektorie pojedynczych cząsteczek, należy rozpocząć inkubację w nowym kanale, a następnie wprowadzić subnanomolarne cząsteczki znakowane fluoroforem przy odpowiednio wysokiej prędkości przepływu przy użyciu pompy strzykawkowej i rejestrować sekwencje obrazów fluorescencyjnych z częstotliwością klatek 100 Hertz. Zazwyczaj w jednym polu widzenia rejestruje się 10 000 klatek, a nagrania są zbierane z wielu pól widzenia.

Na koniec ponownie wprowadzono barwnik do wybarwiania DNA, aby potwierdzić, że cząsteczki DNA nadal mogą być rozciągane w przepływie. Do identyfikacji trajektorii pojedynczych cząsteczek dyfundujących wzdłuż DNA zostanie użyte specjalistyczne oprogramowanie do śledzenia pojedynczych cząsteczek. Oprogramowanie to najpierw z wysoką dokładnością wyznaczy pozycje centroidów pojedynczych cząsteczek.

Usuń cząsteczki przytwierdzone do powierzchni szkiełka nakrywkowego, a następnie powiąż cząsteczki w różnych klatkach obrazu, aby utworzyć trajektorie w funkcji czasu. Na podstawie tych trajektorii zostaną oszacowane jednowymiarowe stałe dyfuzji. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz aplikację do programowania skryptów i przejdź do katalogu oprogramowania do śledzenia pojedynczych cząsteczek.

Otwórz skrypt o nazwie largedataprocess3.m. Ważnym parametrem do zdefiniowania jest wartość progu detekcji pojedynczych cząstek. Aby wyznaczyć optymalną wartość progu, uruchom program determine_threshold_value.

skrypt m. Skrypt ten pozwoli zwizualizować, w jaki sposób wartość progu wpływa na detekcję pojedynczych cząstek. Po wyznaczeniu optymalnej wartości progu uruchom largedataprocess3.

skrypt .m. Po zakończeniu analizy śledzenia pojedynczych cząsteczek surowe trajektorie zostaną przefiltrowane poprzez uruchomienie skryptu trajectory_filtering.m.

Stworzono interfejs graficzny użytkownika (GUI), aby zwizualizować etap filtrowania. W panelu GUI ustaw minimalne przemieszczenie wzdłuż DNA, MinXDisp, na dwie piksele. Ustaw maksymalne przemieszczenie poprzeczne do DNA, MaxYDisp, na dwie piksele.

Ustaw minimalną liczbę klatek, minFrames, na 10. Ustaw minimalną liczbę stanów tripletu, minTriplets, na 10. Ustaw minimalną stałą dyfuzji wzdłuż DNA, D_par, na zero.

Ustaw maksymalną szacowaną stałą dyfuzji prostopadłej do DNA, D_trans, na 10 mega base pair squared per second. Ustaw minimalny parametr statystyczny, Chi2 Stat, na minus pięć. Ustaw minimalny stosunek przemieszczenia wzdłuż DNA do przemieszczenia prostopadłego do DNA, MinX/Y, na dwa.

Wszystkie surowe trajektorie, które spełnią te parametry filtrowania, zostaną wymienione w tabeli jeden, a te, które ich nie spełnią, zostaną wymienione w tabeli trzy. Kliknij numer trajektorii w tabeli jeden. Trajektoria zostanie wyświetlona na grafikach jeden i dwa.

Kliknij przycisk odtwarzania, aby wyświetlić surowe obrazy fluorescencji. Kliknij „dodaj do table2”, jeśli dana trajektoria jest trajektorią poślizgu pojedynczej cząsteczki. Na koniec wszystkie trajektorie dodane do table2 zostaną zapisane podczas zamykania interfejsu graficznego (GUI).

Trajektorie, które przeszły wszystkie etapy filtrowania, są łączone w jedną grupę, z której zostanie oszacowana średnia stała dyfuzji. Aby obliczyć średnie stałe dyfuzji, należy uruchomić skrypt calculate_mean_diffusion_constant.m. Procedura ta będzie pomocna dla wielu osób badających biofizykę pojedynczych cząsteczek in vitro.