Półautomatyczna ilościowa analiza strukturalna oparta na mikrotomografii komputerowej nagiego szczura Model złamania kręgów związanego z osteoporozą
28 września 2017
Celem tego protokołu jest wygenerowanie modelu złamania kompresyjnego kręgów związanego z osteoporozą u nagich szczurów, który może być oceniany in vivo za pomocą półautomatycznej ilościowej analizy strukturalnej opartej na mikrotomografii komputerowej.
Ogólnym celem tego modelu chirurgicznego oraz metody analizy obrazów jest obserwacja wpływu zastosowanego leczenia na przedkliniczny model złamania kompresyjnego kręgów związanego z osteoporozą. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej gleju, takie jak: jakie leczenie mogłoby być skuteczne w przypadku złamań kompresyjnych kręgów związanych z osteoporozą oraz w jaki sposób takie leczenie wspomogłoby regenerację kości? Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie szczurów nago, co pozwala na testowanie nowych metod leczenia in vivo bez obaw o odrzucenie immunologiczne.
Ponadto regeneracja kości, która stanowi podstawę zaprezentowanej tutaj metody, jest w pełni zautomatyzowana, dzięki czemu jest ona dokładniejsza i mniej zależna od operatora niż metody opisane w poprzednich publikacjach. Procedurę zaprezentuje doktor Wafa Tawackoli, naukowiec z naszego laboratorium. Najpierw należy wprowadzić szczura z osteoporozą w stan znieczulenia, stosując 5% isoflurane w 100% oxygen, a następnie przenieść go do maski nosowej, utrzymując stężenie od 2 do 3% isoflurane.
Ogolić obszar brzucha za pomocą golarki elektrycznej. Przetrzeć miejsce zabiegu antyseptykiem na bazie jodu w 0,5% glukonianie chlorheksydyny, a następnie 70% ethanolem. Nałożyć maść weterynaryjną do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia.
Zastosuj bodziec w postaci uciśnięcia palca stopy, aby upewnić się, że osiągnięto odpowiedni poziom znieczulenia. Jeśli nie stwierdzono reakcji, rozpocznij procedurę. Umieść znieczulonego szczura w pozycji grzbietnej na podgrzewaczu ustawionym na 37 °C i rozciągnij kończyny, korzystając z systemu retrakcji z magnetycznym mocowaniem.
Przed rozpoczęciem procedury chirurgicznej podaj szczurowi karprofen podskórnie. Po wykonaniu nacięcia skóry o długości od pięciu do ośmiu centymetrów, rozpoczynając jeden centymetr poniżej wyrostka mieczykowatego wzdłuż linii pośrodkowej, użyj nożyczek chirurgicznych, aby naciąć aponeurozę przez linea alba w celu uzyskania dostępu do jamy brzusznej. Odsłoń jamę brzuszną za pomocą rozieraczy.
Odsuń jelita szczura w prawą stronę, aby odsłonić aortę brzuszną i lewą nerkę. Aby uniknąć odwodnienia, owiń organy wewnętrzne sterylnymi gazikami nasączonymi roztworem. W razie potrzeby użyj dodatkowych haków odsuwających, aby w pełni odsłonić aortę.
Wykonaj palpację kręgosłupa lędźwiowego, a następnie przystąp do jego odsłonięcia. Za pomocą termokauteryzacji odsłoń przednią powierzchnię trzonów kręgów lędźwiowych L4 i L5 i wyizoluj je z otaczającej tkanki łącznej oraz mięśni. Użyj patyczka higienicznego, aby usunąć krew i pozostałości tkanki z kręgu L4.
Następnie, używając sterylnego wiertła o średnicy 2 cm, wykonaj ubytek kostny o głębokości 5 mm w centrum odsłoniętej przedniej powierzchni trzonu kręgu. Wywierć otwór, stosując minimalny nacisk, tak aby przebić jedynie korę brzuszną i znajdującą się pod nią kość beleczkową. Unikaj przewiercenia kory grzbietowej.
Następnie w ten sam sposób wywierć otwory w pięciu kręgach L, tworząc dwa ubytki u każdego szczura. Po zakończeniu wiercenia wprowadź jelita z powrotem do jamy brzusznej i usuń retraktory. Następnie użyj syntetycznej wchłanialnej nici chirurgicznej Vicryl, aby zaszyć rozcięgno szwem ciągłym.
Zamknij skórę, używając niewchłanialnej nici nylonowej monofilamentowej 4-0, stosując szwy pojedyncze przerywane. Następnie nanieś 100 µL miejscowego kleju skórnego na szwy oraz pomiędzy nie, aby zapewnić całkowite zamknięcie rany. Po wstrzyknięciu szczurowi roztworu Ringera z mleczanami o temperaturze 37 °C w celu zapobiegania hipotermii i odwodnieniu oraz buprenorfiny w celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego, pozostaw zwierzę na podgrzewaczce do wybudzenia z narkozy.
Dzień po zabiegu chirurgicznym wprowadź znieczulenie izofluranem w taki sam sposób jak poprzednio. Wykonaj skanowanie szczura za pomocą mikrotomografu komputerowego in vivo. Po zakończeniu skanowania i wybudzeniu ze znieczulenia, przenieś szczura z powrotem do klatki domowej.
Aby oddzielić dane dotyczące kręgów do analizy, kliknij program do oceny micro-CT i wybierz próbkę z menu. Następnie za pomocą myszy obrysuj poszczególne kręgi na przekroju. Użyj paska Z, aby przejść do następnego przekroju i w ten sam sposób obrysuj poszczególne kręgi.
Zapisz obrysowany kręg jako osobny plik, klikając plik, zapisz GOBJ co kilka przekrojów. Następnie, po ustawieniu kręgu referencyjnego, zaimportuj go do środowiska mikro-CT. Zastosuj VOI zdefiniowany dla kręgu referencyjnego do zarejestrowanego kręgu docelowego, klikając program ewaluacji mikro-CT, plik, załaduj GOBJ i wybierając wcześniej utworzony plik GOBJ.
Na koniec prześlij VOI do oceny za pomocą programu do analizy mikro-CT. Ten frontalny obraz 3D przedstawia reprezentatywny obraz defektu kręgu jeden dzień po jego powstaniu. Tworzenie się kości w pustce zaznaczono kolorem czerwonym.
Jest to obraz 2D w płaszczyźnie strzałkowej tego samego obszaru, a na koniec obraz 2D w płaszczyźnie osiowej. Jak widać, tworzenie kości następuje w czasie i jest wykrywane za pomocą obrazowania podłużnego. Gęstość objętościową kości oraz gęstość pozorną obliczono i porównano, stosując dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami i korektą Bonferroniego dla porównań wielokrotnych.
Jak widać tutaj, gęstość objętościowa kości oraz gęstość pozorna istotnie zwiększają się od dwóch tygodni po utworzeniu defektu kręgowego. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak histologia i immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, jakie komórki są obecne i jakie białka są ekspresjonowane w miejscu defektu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak tworzyć wielokrotne defekty kręgowe u szczurów nago i analizować regenerację kości w tych defektach w czasie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę tworzenia modelu osteoporozą związanych złamań kompresyjnych kręgów u szczurów bezwłosych, co umożliwia ocenę in vivo z wykorzystaniem półautomatycznej mikrotomografii komputerowej. Podejście to ułatwia badanie potencjalnych metod regeneracji kości w stanach osteoporotycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Regeneracja kości
- Badania nad osteoporozą
Wstęp
- Osteoporoza prowadzi do zwiększonego ryzyka złamań, szczególnie w obrębie kręgów.
- W badaniach nad leczeniem stosuje się szczury nagi, aby uniknąć odrzucenia immunologicznego.
- Mikrotomografia komputerowa umożliwia szczegółową analizę strukturalną kości.
- Zrozumienie mechanizmów regeneracji kości jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu do badania złamań związanych z osteoporozą.
- Ocena skuteczności nowych metod leczenia w zakresie regeneracji kości.
- Zwiększenie dokładności analizy strukturalnej poprzez zastosowanie metod półautomatycznych.
Zastosowane metody
- Indukcja znieczulenia przy użyciu izofluranu w tlenie.
- Wytwarzanie kompresyjnych złamań kręgów u bezwłosego szczura.
- Podłużna ocena gojenia kości przy użyciu mikrotomografii komputerowej.
- Ocena wpływu leczenia na regenerację kości.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja złamań kompresyjnych kręgów w modelu.
- Wykazanie wykonalności półautomatycznej analizy w ocenie strukturalnej.
- Potencjalne metody leczenia wykazały obiecujące wyniki w zakresie wzmacniania regeneracji kości.
- Otrzymane wyniki przyczyniają się do zrozumienia skuteczności leczenia osteoporozy.
Wnioski
- Model szczura nago jest skuteczny w badaniu złamań związanych z osteoporozą.
- Półautomatyczna mikrotomografia komputerowa zwiększa dokładność analizy.
- Niniejsze badanie wspiera opracowanie nowych metod leczenia osteoporozy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podłużna, półautomatyczna mikrotomografia komputerowa (μCT) umożliwia precyzyjną i powtarzalną kwantyfikację regeneracji kości w przedklinicznych modelach złamań kręgów związanych z osteoporozą. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną przy ocenie nowych terapii regeneracyjnych kości i zmniejsza ryzyko w procesie translacji poprzez standaryzację miar wyników strukturalnych. Metoda ta służy do wczesnego odkrywania, walidacji celów oraz podejmowania decyzji przedklinicznych w ramach portfolio badań nad osteoporozą i inżynierią tkanki kostnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną weryfikację hipotez dotyczących regeneracji kości w kontrolowanym, immunodeficjentnym systemie in vivo.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie tworzenia się nowej kości w czasie w odpowiedzi na potencjalne interwencje.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez oddzielenie efektów terapeutycznych od zakłócających czynników immunologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowany, półautomatyczny proces generowania i analizowania defektów kręgów w różnych kohortach.
- Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki μCT odpowiednie do porównawczego przesiewu związków regeneracyjnych lub biomateriałów.
- Umożliwia wysokotreściową, podłużną ocenę zmian objętości i gęstości kości, wspierając opracowanie wiarygodnych testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z punktami końcowymi istotnymi dla choroby w przypadku osteoporozy oraz naprawy złamań kręgów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki zastosowaniu klinicznie istotnych obrazowania i wskaźników analizy.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów z wykazaną skutecznością in vivo w modelu powtarzalnym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta półautomatyczna analiza oparta na μCT integruje proces od wczesnego etapu odkrywania po ocenę przedkliniczną, umożliwiając płynne przejście kandydatów z etapu testowania hipotez do identyfikacji wiodących cząsteczek i walidacji translacyjnej.
- Biologia odkrywcza: Obrazowanie ilościowe wspiera ocenę mechanizmów regeneracji kości w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Standaryzowane tworzenie defektów oraz obrazowanie ułatwiają powtarzalną i skalowalną ocenę związków.
- Analityka: Zautomatyzowana rejestracja i analiza objętości obszaru zainteresowania pozwalają uzyskać wiarygodne i porównywalne wskaźniki strukturalne.
- Badania translacyjne: Obrazowanie podłużne jest zgodne z punktami końcowymi badania klinicznego i wspiera opracowywanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przepływ pracy można dostosować do innych modeli kości i tkanek opartych na obrazowaniu podłużnym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad regeneracją kości.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i wydajność analiz obrazowania in vivo.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez zapewnienie solidnych punktów końcowych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów w obszarze medycyny regeneracyjnej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu chirurgii małych zwierząt, obrazowania μCT oraz ilościowej analizy obrazów.
- Wymagany jest dostęp do skanerów μCT in vivo oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego do automatycznej rejestracji i definiowania VOI.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów obrazowania i potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w innych modelach defektów kostnych lub tkankowych, w których korzystne jest obrazowanie podłużne.
- Realizacja zależy od odpowiedniego doboru modelu zwierzęcego oraz dostępności infrastruktury obrazowej.
