Półautomatyczna ilościowa analiza strukturalna oparta na mikrotomografii komputerowej nagiego szczura Model złamania kręgów związanego z osteoporozą
28 września 2017
Celem tego protokołu jest wygenerowanie modelu złamania kompresyjnego kręgów związanego z osteoporozą u nagich szczurów, który może być oceniany in vivo za pomocą półautomatycznej ilościowej analizy strukturalnej opartej na mikrotomografii komputerowej.
Ogólnym celem tej metody analizy modelu chirurgicznego i obrazu jest obserwacja wpływu leczenia na przedkliniczny model złamania kompresyjnego kręgów związanego z osteoporozą. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie medycyny regeneracyjnej gleju, takie jak to, jakie może być skuteczne leczenie złamań kompresyjnych kręgów związanych z osteoporozą i w jaki sposób takie leczenie pomogłoby w regeneracji kości? Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje nagie szczury, dzięki czemu nowe terapie mogą być testowane in vivo bez obaw o odrzucenie immunologiczne.
Co więcej, regeneracja kości leży u podstaw tej metody, jest półautomatyczna, dzięki czemu jest dokładniejsza i mniej zależna od użytkownika niż wcześniej publikowana. Procedurę zademonstruje doktor Wafa Tawackoli, naukowiec z naszego laboratorium. Najpierw wywołaj znieczulenie u szczura z osteoporozą za pomocą 5% izofluranu w 100% tlenie, a następnie przenieś do stożka nosowego z dwoma do 3% izofluranem w celu konserwacji.
Ogol okolice brzucha za pomocą golarki elektrycznej. Przetrzyj wacik ze środkiem antyseptycznym na bazie jodu w 0,5% glukonianu chlorheksydyny, a następnie 70% etanolu. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
Zastosuj bodziec szczypania palców u stóp, aby zapewnić odpowiednią płaszczyznę znieczulenia. Jeśli nie zostanie odnotowana żadna odpowiedź, wszcząć procedurę. Umieść znieczulonego szczura w pozycji grzbietowej na poduszce grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i rozciągnij kończyny za pomocą magnetycznego systemu chowania stabilizatora.
Wstrzyknąć szczurowi podskórnie karprofen przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego. Po wykonaniu pięcio- do ośmiocentymetrowego nacięcia w skórze, zaczynając jeden centymetr poniżej wyrostka mieczykowatego i przez linię środkową, za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie rozcięgna przez linię białą, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Odsłoń jamę brzuszną za pomocą retraktorów.
Odchyl jelita w prawo od szczura, aby odsłonić aortę brzuszną i lewą nerkę. Aby uniknąć odwodnienia, użyj sterylnych, nasączonych gaz do owinięcia narządów wewnętrznych. W razie potrzeby użyj dodatkowych zwijaczy, aby odsłonić aortę.
Zbadaj palpacyjnie odcinek lędźwiowy kręgosłupa, a następnie przystąp do jego odsłonięcia. Użyj termokoagulacji, aby odsłonić przednią stronę lędźwiowych trzonów kręgów L od czterech do pięciu i odizolować je od otaczającej tkanki łącznej i mięśni. Użyj bawełnianego wacika, aby usunąć krew i resztki tkanki z kręgów L czterech.
Następnie za pomocą sterylnego wiertła o średnicy dwóch centymetrów wywiercić ubytek kostny o głębokości pięciu milimetrów w środku odsłoniętej przedniej części trzonu kręgu. Zastosuj minimalny nacisk, aby przewiercić się tylko przez korę brzuszną i leżącą pod nią kość beleczkową. Unikaj wiercenia w korze grzbietowej.
Następnie wywierć pięć kręgów L w ten sam sposób, aby stworzyć dwie wady na szczura. Po zakończeniu wiercenia należy przywrócić jelita do jamy brzusznej i usunąć retraktory. Następnie użyj syntetycznego wchłanialnego szwu chirurgicznego vicryl w sposób ciągły, aby zszyć rozcięgno.
Zamknij skórę za pomocą niewchłanialnego szwu nylonowego z monofilamentu 4-0 w prostym, przerywanym wzorze. Następnie nałóż 100 mikrolitrów miejscowego kleju do skóry na wierzch i między szwami skórnymi, aby zapewnić całkowite zamknięcie skóry. Po wstrzyknięciu szczurowi roztworu Ringera z mleczanami o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapobiec hipotermii i odwodnieniu oraz buprenorfiny w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego, pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na poduszce grzewczej.
Następnego dnia po zabiegu chirurgicznym należy wywołać znieczulenie izofluranem jak poprzednio. Zeskanuj szczura za pomocą mikrotomografu komputerowego in vivo. Po zeskanowaniu i wyzdrowieniu ze znieczulenia wróć szczura do klatki domowej.
Aby oddzielić dane kręgów do analizy, kliknij program do oceny mikrotomografii komputerowej i wybierz próbkę z menu. Następnie użyj myszki, aby obrysować poszczególne kręgi na plasterku. Użyj paska Z, aby przejść do następnego przekroju i konturuj poszczególne kręgi w ten sam sposób.
Zapisz wyprofilowany kręg jako osobny plik, klikając plik, zapisz GOBJ co kilka plasterków. Następnie, po ustawieniu kręgu referencyjnego, należy go zaimportować do środowiska mikro-tomografii komputerowej. Zastosuj VOI zdefiniowany dla kręgu referencyjnego do zarejestrowanego kręgu docelowego, klikając program oceny mikro-CT, plik, załaduj GOBJ i wybierając wcześniej utworzony GOBJ.
Na koniec wyślij VOI do oceny za pomocą programu do oceny mikro-CT. Ten przedni obraz 3D pokazuje reprezentatywny obraz ubytku kręgów dzień po wytworzeniu wady. Tworzenie się kości w pustce jest oznaczone kolorem czerwonym.
Jest to strzałkowy obraz 2D tego samego obszaru, a na końcu osiowy obraz 2D. Jak widać tutaj, tworzenie się kości następuje z czasem i jest wykrywane za pomocą obrazowania podłużnego. Gęstość objętości kości i gęstość pozorną obliczono i porównano przy użyciu dwukierunkowej ANOVA z korekcją Bonferroniego w celu wielokrotnych porównań.
Jak widać tutaj, objętość kości i gęstość pozorna znacznie wzrastają od dwóch tygodni po powstaniu ubytku kręgów. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak histologia i immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, które komórki są obecne i jakie białka ulegają ekspresji w wadzie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć wiele wad kręgów u nagich szczurów i analizować regenerację kości w czasie w tych wadach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę stworzenia modelu nagiego szczura osteoporozy związanej z złamaniami kompresyjnymi kręgów, umożliwiającą ocenę in vivo za pomocą półautomatycznej mikrotomografii komputerowej. Takie podejście ułatwia badania potencjalnych leczeńć dotyczących regeneracji kości w warunkach osteoporozy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Regeneracja kości
- Badania nad osteoporozą
Tło
- Osteoporoz a prowadzi do zwiększonego ryzyka złamania, szczególnie kręgów.
- Nagie szczury są używane, aby uniknąć odrzucenia immunologicznego w badaniach leczniczych.
- Mikrotomografia komputerowa zapewnia szczegółową analizę struktury kości.
- Zrozumienie mechanizmów regeneracji kości jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu do badania złamań związanych z osteoporozą.
- Ocenę skuteczności nowych leczeń w regeneracji kości.
- Poprawę dokładności analizy strukturalnej za pomocą metod półautomatycznych.
Stosowane metody
- Wprowadzenie znieczulenia przy użyciu izofluranu w tlenie.
- Tworzenie złamań kompresyjnych kręgów u nagich szczurów.
- Ocena podłużna gojenia kości za pomocą mikrotomografii komputerowej.
- Ocenę wpływu leczenia na regenerację kości.
Główne wyniki
- Udane wprowadzenie złamań kompresyjnych kręgów w modelu.
- Wykazano wykonalność półautomatycznej analizy do oceny strukturalnej.
- Potencjalne terapie wykazały obiecujące rezultaty w poprawie regeneracji kości.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia skuteczności leczenia osteoporozy.
Wnioski
- Model nagiego szczura jest skuteczny w badaniu złamań związanych z osteoporozą.
- Półautomatyczna mikrotomografia komputerowa poprawia dokładność analizy.
- To badanie wspiera opracowanie nowych leczeń dla osteoporozy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Longitudinal semiautomated microcomputed tomography (μCT) enables precise, reproducible quantification of bone regeneration in preclinical osteoporosis-related vertebral fracture models. This approach supports predictive confidence in evaluating novel bone regenerative therapies and de-risks translational advancement by standardizing structural outcome measures. The method is positioned to inform early discovery, target validation, and preclinical decision-making for osteoporosis and bone tissue engineering portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of bone regeneration hypotheses in a controlled, immunodeficient in vivo system.
- Supports functional target validation by quantifying new bone formation over time in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating treatment effects from immune confounders.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, semiautomated workflow for generating and analyzing vertebral defects across cohorts.
- Delivers reproducible, quantitative μCT outputs suitable for comparative screening of regenerative compounds or biomaterials.
- Enables high-content, longitudinal assessment of bone volume and density changes, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints for osteoporosis and vertebral fracture repair.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by using clinically relevant imaging and analysis metrics.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates with demonstrated in vivo efficacy in a reproducible model.
Pipeline & Workflow Integration
This semiautomated μCT-based analysis integrates from early discovery through preclinical evaluation, enabling seamless transition of candidates from hypothesis testing to lead identification and translational validation.
- Discovery Biology: Quantitative imaging supports hypothesis-driven assessment of bone regeneration mechanisms.
- Screening: Standardized defect creation and imaging facilitate reproducible, scalable compound evaluation.
- Analytics: Automated registration and volume-of-interest analysis yield robust, comparable structural metrics.
- Translational Research: Longitudinal imaging aligns with clinical endpoints and supports biomarker development.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other longitudinal imaging-based bone and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone regeneration studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of in vivo imaging analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, μCT imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to in vivo μCT scanners and compatible analysis software for automated registration and VOI definition.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to other bone or tissue defect models where longitudinal imaging is beneficial.
- Dependent on animal model suitability and imaging infrastructure availability.
