Name: Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną technikę immuno-MALDI do ilościowej analizy peptydów i białek w złożonych płynach biologicznych. Metoda umożliwia czułą i dokładną diagnostykę chorób na wczesnym etapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Genome Canada i Genome British Columbia na operacje (204PRO) i rozwój technologii (214PRO) za pośrednictwem Genome Innovations Network (GIN). Dziękujemy Platformie Odkrywania Leków w Instytucie Badawczym Centrum Zdrowia Uniwersytetu McGill za wykorzystanie instrumentu MALDI-TOF do filmowania. H.L. jest wdzięczna za wsparcie w postaci stypendium podoktorskiego od National Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC). C.H.B jest wdzięczna za wsparcie ze strony Leading Edge Endowment Fund (LEEF). C.H.B. jest wdzięczna za wsparcie ze strony Segal McGill Chair in Molecular Oncology na Uniwersytecie McGill (Montreal, Quebec, Kanada). M.X.C. i C.H.B. są wdzięczni za wsparcie ze strony Warren Y. Soper Charitable Trust i Alvin Segal Family Foundation dla Jewish General Hospital (Montreal, Quebec, Kanada).

Ilości odczynników opisanych poniżej są oparte na pomiarze 20 próbek osocza pacjenta. Przedstawiony poniżej protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu etycznego ds. badań na ludziach Uniwersytetu Wiktorii.
1. Generowanie Ang I w ludzkim osoczu
<ol>
	<li>Próbki osocza (≥200 μl) rozmrażać w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie umieszczać próbki na lodzie aż do całkowitego rozmrożenia.</li>
	<li>Przenieść ręcznie 200 μl każdej próbki osocza do oddzielnych dołków na płytce głębinowej o pojemności 1,1 ml (płytka do próbki) i odwirować płytkę w wirówce przez 10 minut w temperaturze 2 °C i 1278 x g.</li>
	<li>Za pomocą zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy seryjnie rozcieńczyć roztwór wzorcowy Ang I NAT o stężeniu 500 fmol/μl, przygotować sześć roztworów kalibracyjnych z albuminą białka jaja kurzego (0,1, 0,2, 0,6, 1,9, 5,7, 17,2 fmol/μL).</li>
	<li>Odpipetować 200 μl każdego kalibratora do dołka i 125 μl buforu generacyjnego do płytki z próbką. 
	UWAGA: CEWA w buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) musi być świeżo przygotowana w dniu doświadczenia.</li>
	<li>Za pomocą zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy, na nowej płytce zmieszać 125 μl supernatantu osocza lub 125 μl CEWA w PBS z 25 μl buforu generacji Ang I, który zawiera 1 M Tris, 0,2 mM kwasu etylenosulfonylooctowego (EDTA) i 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF). 
	UWAGA: Przygotować bufor generacji Ang I, mieszając 1 M Tris/0,2 mM wodnego buforu EDTA (dostosować do pH 5,5 za pomocą kwasu octowego) i roztworu PMSF (100 mM w metanolu). Oba roztwory mogą być przechowywane do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C. Wymieszać oba roztwory w dniu eksperymentu.</li>
	<li>Automatycznie przenieś roztwory na 96-dołkową płytkę, 3 powtórzenia na roztwór, 34 μl na studzienkę. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
</ol>
2. Wzbogacenie immunologiczne Ang I za pomocą kulek pokrytych przeciwciałami
<ol>
	<li>Koniugacja przeciwciała z magnetycznymi kulkami białka G 
	UWAGA: Koniugacja przeciwciała z kulkami odbywa się ręcznie w ciągu 3 godzinnego okresu generacji Ang I w dniu eksperymentu. W przypadku innych analitów sprzężone kulki mogą być przechowywane w buforze PBS zawierającym 0,015% CHAPS (PBSC) w temperaturze 4 °C przez trzy miesiące lub dłużej, w zależności od właściwości i stabilności przeciwciała.
	<ol>
		<li>Przenieś 110 μl zawiesiny perełkowej (wystarczającej do zmierzenia 20 próbek i wykonania 6-punktowej krzywej wzorcowej) do probówki o pojemności 1,5 ml. Umyj kulki siedmiokrotnie 1 ml 25% acetonitrylu/PBSC i trzy razy 1 ml PBSC. Użyj stojaka magnetycznego, aby granulować koraliki między każdym etapem prania. Usuń bufor do płukania po ostatnim praniu. 
		UWAGA: 7-krotne mycie 25% acetonitrylem/PBSC ma kluczowe znaczenie dla usunięcia dodatków niekompatybilnych z MS w zawiesinie perełek, takich jak Tween-20. Jeśli w wybranych kulkach nie ma takich dodatków, ten obszerny etap mycia może nie być konieczny.</li>
		<li>Zawiesić kulki w 110 μl PBSC i dodać 110 μl przeciwciała anty-Ang I (końcowe stężenie przeciwciała: 100 μg/ml). Wymieszać kulki i roztwór, pipetując, a następnie inkubować je w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, obracając z prędkością 8 obr./min.</li>
		<li>Umyj kulki 3 razy 1 ml PBSC i ponownie zanurz w 1100 μl PBSC. 
		UWAGA: Jeśli podczas inkubacji do nasadki probówki dostał się jakikolwiek roztwór kulek, odwiruj roztwór za pomocą wirówki stołowej o sile 2680 x g.</li>
		<li>Przenieść roztwór kulki ręcznie na płytkę 96-dołkową (standardowa płytka z kulkami). Użyj zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy, aby podzielić kulki na tę samą 96-dołkową płytkę, 120 μl na dołek. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacenie immunologiczne na koralikach
	<ol>
		<li>Po 3 h okresie wytwarzania Ang I umieścić płytkę inkubacyjną na lodzie na 10 minut, aby zakończyć wytwarzanie Ang I.</li>
		<li>Automatycznie rozcieńczyć podstawowy roztwór peptydu SIS (10 pmol/μl) 100-krotnie buforem PBS, a następnie automatycznie podwielokrotnić rozcieńczenie stabilnego izoptopu wzorcowego peptydu na 96-dołkową płytkę PCR. Przenieść 1,5 μl roztworu peptydu wzorca stabilnego izotopu (SIS) (zawierającego 100 fmol) do każdego dołka płytki inkubacyjnej i wymieszać go z próbkami osocza lub CEWA w PBS.</li>
		<li>Automatycznie przenieś zawartość płytki inkubacyjnej do roztworu kulek, 10 ml na studzienkę, wymieszaj.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, obracając ją z prędkością 8 obr./min.</li>
		<li>Umyj kulki trzy razy automatycznie 5 mM roztworem wodorowęglanu amonu (AmBic), 100 μl na studzienkę na pranie. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić kulki w 7 μl 5 mM roztworu AmBic w każdym dołku. Użyj magnesu, aby pociągnąć koraliki na dół po ostatnim praniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przenoszenie koralików na tarczę docelową MALDI i dodawanie roztworu matrycowego
<ol>
	<li>Przenieś automatycznie 7 μl zawiesiny perełkowej na tarczę tarczową MALDI o wielkości plamki 2 600 μm. Pozwól koralikom wyschnąć. 
	UWAGA: Mały wentylator zasilany przez USB może być użyty do przyspieszenia procesu suszenia ściegów.</li>
	<li>Automatycznie dodać 2 μl roztworu matrycowego kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (HCCA) (zawierającego 3 mg/ml HCCA, 1,8 mg/ml cytrynianu amonu, 70% acetonitrylu i 0,1% kwasu trifluorooctowego) z dołka matrycowego na każde miejsce próbki na płytce docelowej.</li>
</ol>
4. Akwizycja sygnału przez MALDI-TOF-MS i analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj miejsca pobierania próbek za pomocą przyrządu MALDI-TOF w trybie dodatniego reflektora. Automatyczne przeprowadzanie kalibracji wewnętrznej, wygładzanie danych i odejmowanie linii bazowej za pomocą oprogramowania specyficznego dla dostawcy. 
	UWAGA: Tryb (dodatni/ujemny, liniowy/reflektorowy) wybrany do pomiaru MALDI-TOF zależy od docelowych peptydów lub białek.</li>
	<li>Obliczyć względny współczynnik odpowiedzi (stosunek intensywności Nat/SIS) i porównać go z krzywą standardową w celu określenia stężenia Ang I w każdej próbce. Obliczać PRA za pomocą równania (1), gdzie ΔtAng I generacji oznacza czas używany do generowania Ang I. 
	PRA = [Ang I]/ΔtAng I pokolenie (1)</li>
</ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
<li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Chemical+Genomics+and+Proteomics%3A+Reviews+and+Protocols%22">Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols</a>. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).</li>
<li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI%2FTOF-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li>
<li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li>
<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
<li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast%2C+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li>
<li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li>
<li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li>
<li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+%28iMALDI%29+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li>
<li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li>
<li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+%28iMALDI%29+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20(2013).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
<li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+chimica+acta%22%5BJournal%5D)">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li>
<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
<li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).</li>
<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
<li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+fragments%3A+Hope+and+hype%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B posiada patent na technologię iMALDI.

W porównaniu z konwencjonalną kwantyfikacją białek na podstawie stwardnienia rozsianego, iMALDI wykorzystuje przeciwciała do wzbogacania analitów i oczyszczania ich ze złożonych próbek, umożliwiając w ten sposób ilościowe oznaczanie białek lub peptydów w niskich stężeniach. Kluczowym krokiem w protokole iMALDI jest immunowzbogacenie docelowych peptydów. W tym celu należy wybrać przeciwciała o wysokiej swoistości i powinowactwie. W badaniu SISCAPA doniesiono, że powinowactwo przeciwciał na poziomie 10-9 M lub w...

Spektrometria mas stała się nieodzownym narzędziem w proteomice ilościowej. Spektrometria mas może określać masy docelowych białek lub peptydów, dlatego uzyskane sygnały analitowe mogą być wysoce specyficzne w porównaniu z testami immunologicznymi. Dwie metody jonizacji, elektrospray i MALDI, są najczęściej używane do wykrywania białek i peptydów1,2,3,4. Głównym wyzwaniem w kwantyfikacji białek na podstawie stwardnienia rozsianego jest wykrywanie białek o niskiej liczebności w złożonych próbkach w stężeniach ng/ml lub pg/ml w obecności białek o wysokiej obfitości, a wiele potencjalnych biomarkerów białkowych znajdujących się w ludzkim osoczu mieści się w tym zakresie5. Ten problem jest w dużej mierze spowodowany z natury szerokim zakresem dynamiki i złożonością ludzkiego proteomu6.
Aby sprostać tym wyzwaniom związanym z wykrywaniem, opracowano metody immuno-MS, które wzbogacają docelowe białka lub peptydy z roztworów próbek na powierzchnię ciała stałego, a następnie elucję analitów i pomiar MS7,8,9,10. Poprzez wzbogacenie immunologiczne anality są oczyszczane ze złożonych próbek, dzięki czemu efekty tłumienia jonów przez inne cząsteczki są zminimalizowane. Spośród różnych podpór stałych, kulki magnetyczne są obecnie najczęściej stosowane, ponieważ mają zalety wysokiej zdolności wiązania przeciwciał i łatwości obsługi. Kulki magnetyczne o różnych funkcjonalizacjach i rozmiarach zostały opracowane i skomercjalizowane do eksperymentów z immunoprecypitacją. Do tej pory wzbogacanie immunologiczne na kulkach było połączone zarówno z jonizacją elektronrozpylania (ESI), jak i MALDI-MS do pomiaru białek i peptydów. W stabilnych wzorcach izotopowych i technologii wychwytywania za pomocą przeciwciał antypeptydowych (SISCAPA) białka w próbkach są trawione, a następnie inkubowane z kulkami pokrytymi przeciwciałami w celu wzbogacenia odporności. W "klasycznym" SISCAPA wychwycone peptydy proteotypowe są eluowane z kulek i mierzone za pomocą chromatografii cieczowej-ESI-MS (LC-MS) lub za pomocą bezpośredniej infuzji ESI-Multiple Reaction Monitoring-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Wzbogacenie immunologiczne poprawiło czułość testu MRM o 3-4 rzędy wielkości, osiągając niski zakres ng/ml13.
W porównaniu do electrospray-MS, MALDI-MS jest szybszy i nie wymaga czyszczenia i ponownego równoważenia kolumn LC, więc nie ma problemów z przenoszeniem i zanieczyszczeniem, co czyni go bardziej odpowiednim do badań o wysokiej przepustowości14. Technologia Immuno-MALDI została opracowana w naszym laboratorium w celu połączenia wzbogacania układu immunologicznego z MALDI-MS w celu czułej i specyficznej oceny ilościowej peptydów i białek (na podstawie oceny ilościowej peptydów proteotypowych)15,16,17. Po wzbogaceniu immunologicznym kulki są umieszczane na płytce docelowej MALDI, roztwór matrycy dodaje się do kulek, a po wysuszeniu płytka jest gotowa do analizy za pomocą MALDI-TOF-MS. Elucja peptydów z kulek nie jest przeprowadzana jako oddzielny etap, ale anality związane z powinowactwem są eluowane przez roztwór matrycy MALDI po dodaniu go do plamek perełkowych, upraszczając w ten sposób przygotowanie próbki i minimalizując utratę próbki. Technologia iMALDI została zastosowana w różnych aplikacjach18,19, a ostatnio została zautomatyzowana i wykorzystana do pomiaru angiotensyny I (Ang I) w celu określenia aktywności reniny w osoczu (PRA)20. Protokół ten zademonstruje procedurę zastosowaną do przeprowadzenia automatycznego testu iMALDI. Biorąc za przykład test PRA, CV między dniami poniżej 10% zostało osiągnięte dzięki automatyzacji, z możliwością pomiaru 744 próbek dziennie20.
Test iMALDI PRA pokazany w tym manuskrypcie nie wymaga trawienia białka, ponieważ cząsteczka docelowa (Ang I) jest peptydem o masie cząsteczkowej 1295,7 Da. W innych testach, w których konieczne jest trawienie białek, a peptyd jest stosowany jako substytut nienaruszonego białka, wybrany peptyd dla iMALDI powinien być unikalny i specyficzny dla białka docelowego, o masie powyżej 800 Da, tak aby można go było łatwo odróżnić od szumu chemicznego z roztworu macierzy MALDI. Przeciwciała antypeptydowe są niezbędne do wzbogacenia immunologicznego peptydów. Protokół testu iMALDI mierzącego PRA składa się z czterech etapów: 1) wytwarzanie Ang I w ludzkim osoczu; 2) wzbogacenie immunologiczne Ang I za pomocą kulek pokrytych przeciwciałami; 3) przeniesienie koralików na tarczę celowniczą MALDI i dodanie roztworu matrycy; oraz 4) akwizycja sygnału przez MALDI-TOF-MS i analiza danych20.

<table><tbody><tr><td>Zdrowa kontrola Biorekultywacja</td> <td>ludzkiego osocza</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian amonu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (>=98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z białka jaja kurzego (>98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>klasa LC-MS</td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>Woda klasy LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>39253</td> Kwas octowy <td>klasy LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>LC-MS klasa</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Kulki magnetyczne białkowe G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu; m, 30 mg/ml</td></tr><tr><td>anti-Ang I kozie przeciwciało poliklonalne</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat i SIS Ang I</td><td>zsyntetyzowane w Centrum</td><td></td><td></td>Proteomiki University of Victoria-Genome BC</tr><tr><td>Zautomatyzowany system obsługi cieczy</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Zrobotyzowana stacja robocza Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Magnes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Magnes Invitrogen DynaMag-2</td></tr><tr><td>Rotator rurowy</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Tube Rotator</td></tr><tr><td>Magnes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 magnes z listwą boczną</td></tr><tr><td></td><td>Magnes VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>służy do ciągnięcia koralików na dno studni</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Przyrząd Bruker</td><td></td><td>Bruker Microflex LRF</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Spektrometria mas (MS) jest jedną z najczęściej używanych technologii do ilościowego oznaczania białek w złożonych próbkach, z doskonałą specyficznością testową w wyniku bezpośredniego wykrywania stosunku masy do ładunku każdej cząsteczki docelowej. Jednak proteomika oparta na stwardnieniu rozsianym, podobnie jak większość innych technik analitycznych, ma tendencję do pomiaru analitów o wysokiej obfitości, więc trudno jest osiągnąć granice wykrywalności niskiego ng / ml lub pg / ml w złożonych próbkach, a jest to zakres stężeń dla wielu istotnych dla choroby białek w płynach biologicznych, takich jak ludzkie osocze. Aby pomóc w wykrywaniu analitów o niskiej liczebności, do testu włączono wzbogacanie układu immunologicznego w celu zagęszczenia i oczyszczenia analitu przed pomiarem SM, co znacznie poprawiło czułość testu. W niniejszej pracy przedstawiono technologię immuno-Matrix-Assisted Laser Desorption/Jonizization (iMALDI) do ilościowego oznaczania białek i peptydów w płynach biologicznych, w oparciu o wzbogacenie immunologiczne na kulkach, a następnie pomiar MALDI-MS bez wcześniejszej elucji. Przeciwciała antypeptydowe są funkcjonalizowane na kulkach magnetycznych i inkubowane z próbkami. Po umyciu kulki są bezpośrednio przenoszone na tarczę celowniczą MALDI, a sygnały są mierzone za pomocą przyrządu MALDI-Time of Flight (MALDI-TOF) po nałożeniu roztworu matrycowego na kulki. Procedura przygotowania próbki jest uproszczona w porównaniu z innymi testami immuno-MS, a pomiar MALDI jest szybki. Całe przygotowanie próbki jest zautomatyzowane dzięki systemowi obsługi cieczy, co zapewnia lepszą powtarzalność testu i wyższą przepustowość. W tym artykule test iMALDI służy do oznaczania stężenia peptydu angiotensyny I (Ang I) w osoczu, który jest stosowany klinicznie jako odczyt aktywności reniny w osoczu do badań przesiewowych pierwotnego aldosteronizmu (PA).

Zautomatyzowana procedura iMALDI do pomiaru poziomu Ang I została przedstawiona na Rysunku 1. Peptydy docelowe (peptydy endogenne lub peptydy pochodzące z trawionych białek) są wzbogacane na magnetycznych koralikach antypeptydowych, a następnie koraliki są przenoszone na płytkę docelową do pomiaru metodą MALDI. Cała procedura jest uproszczona w porównaniu z innymi technologiami immuno-MS, które wymagają dodatkowych etapów elucji peptydów. Automatyzacja analiz...

Przedstawiono protokół kwantyfikacji białek w złożonych płynach biologicznych przy użyciu technologii automatycznego immuno-MALDI (iMALDI).

Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Ogólnym celem tego zautomatyzowanego testu immuno-MALDI jest dokładna i czuła kwantyfikacja peptydów oraz nienaruszonych białek w złożonych płynach biologicznych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie proteomiki ilościowej, takie jak określenie poziomu białek do celów diagnostycznych lub monitorowania odpowiedzi pacjenta na leczenie. Główną zaletą tej metody jest możliwość bardzo czułej i dokładnej kwantyfikacji poziomu białek w złożonych próbkach.Technika ta umożliwia diagnostykę chorób na wczesnym etapie, ponieważ etap immuno-wzbogacania w analizie pozwala na ilościowe oznaczenie niskoobfitych białkowych i peptydowych biomarkerów. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji o aktywności reniny w osoczu, może być ona również zastosowana w innych badaniach związanych z chorobami, takich jak ilościowe oznaczenie białek związanych z nowotworami w celu prognozowania, diagnostyki i zarządzania leczeniem. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić próbki ludzkiego osocza w kąpieli wodnej o temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie umieścić próbki na lodzie aż do całkowitego rozmrożenia. Kolejno ręcznie przenieść 200 µL każdej próbki osocza do oddzielnych dołków płytki głębokodna o objętości 1,1 ml. Wirować płytkę przez 10 minut w temperaturze 2 °C przy 3 000 rpm.Następnie, użyj systemu Bravo do wykonania rozcieńczeń seryjnych standardowego roztworu Ang-1 NAT o stężeniu 500 femtomole per microliter, aby przygotować sześć roztworów kalibracyjnych z albuminą białka jaja kurzego. Po odwiruванні przeniesienie pipetą 200 microliters każdego kalibratora do osobnej studzienki oraz 125 microliters buforu do generowania do płytki z próbkami. Używając zautomatyzowanego systemu do obsługi cieczy, wymieszaj 125 microliters supernatantu osocza lub 125 microliters roztworu albuminy białka jaja kurzego z 25 microliters buforu do generowania angiotensyny I w nowej płytce z głębokimi studzienkami o pojemności 1.1 milliliter.Następnie automatycznie przenieś roztwory na płytkę 96-dołkową w trzech powtórzeniach dla każdego roztworu, dozując 34 µL roztworu na dołek. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. W celu sprzężenia przeciwciała z kulkami białka G, przenieś najpierw 78 µL wcześniej przygotowanej zawiesiny kulek do probówki o pojemności 1,5 ml.Przemyj kuleczki siedem razy jednym mililitrem 25% acetonitrylu w PBSC oraz trzy razy jednym mililitrem PBSC, wykorzystując statyw magnetyczny do osadzania kuleczek po każdym myciu. Po przemyciu kuleczek resuspenduj je w 110 µl PBSC i dodaj 110 µl przeciwciała przeciwko angiotensynie I. Wymieszaj kuleczki z roztworem, pipetując zawiesinę.Następnie inkubować kuleczki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, rotując je z prędkością 8 rpm. Po tym czasie przemyć kuleczki trzykrotnie 1 ml PBSC. Następnie zawiesić kuleczki ponownie w 1,100 µl PBSC.Następnie ręcznie przenieś roztwór kulek do płytki 96-dołkowej. Potem za pomocą Bravo podziel kulecki do tej samej płytki 96-dołkowej. Po trzygodzinnym okresie generowania angiotensyny I umieść płytkę inkubacyjną na lodzie na 10 minut, aby przerwać proces generowania angiotensyny I. Automatycznie rozcieńcz stokowy roztwór peptydowych standardów izotopowych 100-krotnie w buforze PBS.Następnie automatycznie nalić rozcieńczenie peptydowego standardu izotopu stabilnego do płytki PCR z 96 dołkami. Przenieś 10 µL rozcieńczonego roztworu peptydowego do każdego dołka płytki inkubacyjnej. Wymieszaj rozcieńczony roztwór peptydowy z próbkami osocza lub roztworem albuminy białka jaja kurzego.Automatycznie dodaj próbki lub roztwory standardów do roztworów kulek na płytkę inkubacyjną i wymieszaj. Po godzinnej inkubacji automatycznie przemyj kulki trzy razy roztworem wodorowęglanu amonu o stężeniu 5 mM. Po każdym przemyciu użyj magnesu, aby przyciągnąć kulki do dna.Po ostatnim przemyciu, do każdej studzienki należy dodać 10 µL roztworu wodorowęglanu amonu, aby resuspendować kuleczki. Następnie automatycznie przenieść 7 µL zawiesiny kuleczkowej na płytkę docelową MALDI o rozmiarze plamki 2 600 µm. Po wyschnięciu kuleczek, automatycznie nanieść 2 µL wcześniej przygotowanego roztworu matrycy HCCA ze studzienki z matrycą na każdą plamkę z próbką na płytce docelowej.Następnie przeanalizuj plamki z próbek za pomocą instrumentu MALDI-TOF w dodatnim trybie reflektorowym. Przeprowadź kalibrację wewnętrzną, wygładzanie danych oraz odejmowanie linii bazowej przy użyciu oprogramowania producenta. Zautomatyzowana procedura iMALDI służąca do pomiaru angiotensyny I umożliwia wysokoprzepustową analizę dużej liczby próbek z wewnątrzdobowym współczynnikiem zmienności poniżej 10%. Tutaj przedstawiono reprezentatywne widma uzyskane podczas pomiaru angiotensyny I w próbkach ludzkiej osocza.Tutaj przedstawiono korelację wartości PRA z 188 próbek pacjentów uzyskanych za pomocą zautomatyzowanego testu iMALDI z wartościami PRA uzyskanymi przy użyciu klinicznej procedury LC-MS/MS. Współczynnik korelacji obu metod wynosi 0,98, a różnica między nachyleniami może wynikać z zastosowania różnych standardów wewnętrznych lub różnych przeciwciał. Tutaj zaprezentowano zakres liniowy testu oraz precyzję testu.Po opanowaniu techniki jej wykonanie zajmuje około pięciu godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym ustawieniu głowicy końcówki oraz prędkości dozowania cieczy. Po zakończeniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody w celu potwierdzenia pierwotnego hiperaldosteronizmu u pacjentów, w tym testy obciążenia solą drogą doustną lub testy infuzji soli fizjologicznej.Zautomatyzowana technika iMALDI umożliwia specyficzne i dokładne wysokoprzepustowe przesiewowe oznaczanie ilościowe próbek biologicznych, w tym próbek pacjentów, w celu wykrycia białek lub peptydów związanych z chorobą. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania zautomatyzowanego testu iMALDI do ilościowego oznaczania białek i peptydów metodą spektrometrii mas. Należy pamiętać, że praca z próbkami biologicznymi, takimi jak ludzka osocze, wiąże się z ogromnym ryzykiem, dlatego podczas wykonywania procedury należy zawsze przestrzegać niezbędnych środków ostrożności.

peptide-and-protein-quantification-using-automated-immuno-maldi-imaldi

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu do walidacji histologii immunofluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu jako sposobu ilościowego oznaczania interesującego białka w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Nasze wyniki wskazują na przydatność histologii immunofluorescencyjnej do ustalania względnej ilości białek biomarkerowych w rutynowych próbkach biopsji.

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Tutaj opisujemy proces proteomiki do charakterystyki proteomu powierzchni komórki różnych typów komórek. Ten przepływ pracy obejmuje wzbogacanie białek na powierzchni komórki, późniejsze przygotowanie próbki, analizę przy użyciu platformy LC-MS/MS oraz przetwarzanie danych za pomocą specjalistycznego oprogramowania.

Przepływ pracy "Cell Surface Capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

Poznaj zautomatyzowaną technikę immuno-MALDI do ilościowej analizy peptydów i białek w złożonych płynach biologicznych. Metoda umożliwia czułą i dokładną diagnostykę chorób na wczesnym etapie.

Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI)

Przeglądaj więcej filmów