Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI)
18 sierpnia 2017
Przedstawiono protokół kwantyfikacji białek w złożonych płynach biologicznych przy użyciu technologii automatycznego immuno-MALDI (iMALDI).
Ogólnym celem tego zautomatyzowanego testu immuno-MALDI jest ilościowe określenie peptydów i nienaruszonych białek w złożonych płynach biologicznych w dokładny i czuły sposób. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie proteomiki ilościowej, takie jak ilościowe określanie poziomów białka w diagnostyce lub monitorowaniu odpowiedzi pacjenta na leczenie. Kluczową zaletą tej metody jest to, że może ona bardzo czułie i dokładnie określić ilościowo poziomy białka ze złożonych próbek.
Technika ta pozwala na diagnozowanie chorób na wczesnym etapie, ponieważ etap wzbogacania immunologicznego testu pozwala na ilościowe określenie biomarkerów białkowych i peptydowych o niskiej obfitości. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w aktywność reniny w osoczu, może być również stosowana w innych badaniach związanych z chorobą, takich jak kwantyfikacja białek związanych z rakiem w celu prognozowania, diagnozy i zarządzania leczeniem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy rozmrozić próbki ludzkiego osocza w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Następnie umieść próbki na lodzie do całkowitego rozmrożenia. Następnie ręcznie przenieś 200 mikrolitrów każdej próbki osocza do oddzielnych studzienek płytki o głębokości 1,1 mililitra. Wirować płytkę przez 10 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza i 3 000 obr./min.
Następnie użyj Bravo do seryjnego rozcieńczenia 500 femtomoli na mikrolitr roztworu wzorcowego Ang-1 NAT, aby przygotować sześć roztworów kalibracyjnych z albuminą białka jaja kurzego. Po odwirowaniu odpipetować 200 mikrolitrów każdego kalibratora do studzienki i 125 mikrolitrów buforu generacyjnego do płytki próbki. Korzystając z automatycznego systemu obsługi cieczy, wymieszaj 125 mikrolitrów supernatantu osocza lub 125 mikrolitrów roztworu albuminy białka jaja kurzego z 25 mikrolitrami buforu angiotensyny I generacji na nowej płytce głębokiej o pojemności 1,1 mililitra.
Teraz automatycznie przenieś roztwory na 96-dołkową płytkę z trzema powtórzeniami na roztwór i 34 mikrolitrami roztworu na dołek. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. W celu sprzężenia przeciwciała z kulkami białka G należy najpierw przenieść 78 mikrolitrów wcześniej przygotowanej zawiesiny kulek do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Umyj kulki siedem razy jednym mililitrem 25% acetonitrylu w PBSC i trzy razy jednym mililitrem PBSC, używając magnetycznego stojaka do granulowania kulek między każdym praniem. Po umyciu kulek należy je ponownie zawiesić w 110 mikrolitrach PBSC i dodać 110 mikrolitrów przeciwciała anty-angiotensyny I. Wymieszać kulki i roztwór, pipetując.
Następnie inkubuj kulki w temperaturze pokojowej przez godzinę, obracając się z prędkością ośmiu obr./min. Następnie umyj koraliki trzykrotnie jednym mililitrem PBSC. Następnie ponownie zawieś kulki w 1 100 mikrolitrach PBSC.
Teraz ręcznie przenieś roztwór kulki na płytkę 96-dołkową. Następnie poproś Bravo o podpisanie koralików na tę samą 96-dołkową płytkę. Po trzygodzinnym okresie wytwarzania angiotensyny I umieścić płytkę inkubacyjną na lodzie na 10 minut, aby zakończyć wytwarzanie angiotensyny I. Automatycznie rozcieńczyć 100-krotnie roztwór podstawowy peptydu o stabilnych wzorcach izotopowych buforem PBS.
Ponadto automatycznie podwielokrotnić rozcieńczenie standardowego peptydu stabilnego izotopu na 96-dołkową płytkę PCR. Przenieść 10 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu peptydu do każdej studzienki płytki inkubacyjnej. Zmieszać rozcieńczony roztwór peptydu z próbkami osocza lub roztworem albuminy białka jaja kurzego.
Automatycznie dodać próbkę lub roztwory wzorcowe do roztworów kulek na płytce inkubacyjnej i wymieszać. Po jednej godzinie inkubacji automatycznie umyj koraliki trzykrotnie pięciomilimolowym roztworem wodorowęglanu amonu. Użyj magnesu, aby pociągnąć koraliki na dół po każdym praniu.
Po ostatnim praniu dodaj 10 mikrolitrów roztworu wodorowęglanu amonu do każdej studzienki, aby ponownie zawiesić kulki. Automatycznie przenieś siedem mikrolitrów zawiesiny perełkowej na płytkę docelową MALDI o wielkości plamki 2 600 mikrometrów. Po wyschnięciu kulek automatycznie dodaj dwa mikrolitry wcześniej przygotowanego roztworu matrycy HCCA z dołka matrycowego na każde miejsce próbki na płytce docelowej.
Następnie przeanalizuj miejsca próbki za pomocą instrumentu MALDI-TOF w trybie dodatniego reflektora. Wykonuj kalibrację wewnętrzną, wygładzanie danych i odejmowanie linii bazowej za pomocą oprogramowania specyficznego dla dostawcy. Zautomatyzowana procedura iMALDI do pomiaru angiotensyny I pozwala na wysokoprzepustową analizę dużej liczby próbek o współczynniku zmienności śróddziennej poniżej 10%Reprezentatywne widma uzyskane przez pomiar angiotensyny I w próbkach osocza ludzkiego przedstawiono tutaj.
Przedstawiono korelację wartości PRA ze 188 próbek pacjentów uzyskanych za pomocą automatycznego testu iMALDI z wartościami PRA uzyskanymi za pomocą klinicznej procedury LC-MS/MS. Obie metody mają współczynnik korelacji wynoszący 0,98, a różnica między nachyleniami może wynikać z zastosowania różnych wzorców wewnętrznych lub różnych przeciwciał. W tym miejscu wyświetlany jest liniowy zakres testu i precyzja testu.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około pięciu godzin. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o odpowiednim wyregulowaniu główki końcówki i prędkości obsługi cieczy. Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody w celu potwierdzenia pierwotnego aldosteronizmu u pacjentów, w tym doustne ładowanie solą lub testy infuzji soli fizjologicznej.
Zautomatyzowana technika iMALDI umożliwia specyficzne i dokładne, bardzo dokładne ilościowe badania przesiewowe próbek biologicznych, w tym próbek pobranych od pacjentów, pod kątem białek lub peptydów związanych z chorobą. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać automatyczny test iMALDI do kwantyfikacji białek i peptydów na podstawie spektrometrii mas. Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi, takimi jak ludzkie osocze, jest niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania zabiegu należy zawsze zachować niezbędne środki ostrożności.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół ilościowego wyznaczania peptydów i całych białek w złożonych płynach biologicznych z wykorzystaniem zautomatyzowanej technologii immuno-MALDI (iMALDI). Metoda ta ma na celu zapewnienie dokładnych i wrażliwych pomiarów, pomagając w diagnostyce i monitorowaniu leczenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Proteomika
- Testy biologiczne
- Diagnostyka
Tło
- Ilościowa proteomika jest niezbędna do zrozumienia poziomów białek w różnych warunkach.
- Niskie stężenia biomarkerów peptydowych i białkowych mogą być wyzwaniem przy kwantyfikacji.
- Wczesne rozpoznanie choroby może znacząco wpłynąć na wyniki leczenia.
- Zautomatyzowane techniki zwiększają wrażliwość i dokładność w ilościowym wyznaczaniu białek.
Cel badania
- Opracowanie wrażliwej i dokładnej metody ilościowego wyznaczania białek.
- Ułatwienie rozpoznawania chorób we wczesnym stadium.
- Dostarczenie informacji na temat aktywności reniny w osoczu i białek związanych z rakiem.
Stosowane metody
- Zautomatyzowana technologia immuno-MALDI (iMALDI).
- Krok immuno-wzbogacania dla nisko występujących białek.
- Roztapianie próbek osocza ludzkiego przed analizą.
- Ilościowe wyznaczanie białek i peptydów w złożonych płynach biologicznych.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia wrażliwe ilościowe wyznaczanie białek złożonych próbek.
- Może być zastosowana w różnych badaniach związanych z chorobami.
- Wczesne rozpoznanie choroby ułatwia dokładne pomiary białek.
- Można uzyskać wgląd w monitorowanie leczenia i reakcję pacjenta.
Wnioski
- Zautomatyzowana technologia iMALDI jest cennym narzędziem w ilościowej proteomiki.
- Metoda ta poprawia zdolność do wczesnego rozpoznawania chorób.
- Stanowi ramy dla przyszłych badań nad ilościowym wyznaczaniem białek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated immuno-MALDI (iMALDI) addresses the critical challenge of quantifying low-abundance peptide and protein biomarkers in complex biofluids, enabling sensitive detection in the ng/mL to pg/mL range required for clinical applications. By integrating immuno-enrichment with MALDI-TOF mass spectrometry and full automation, the method delivers high-throughput, reproducible quantification with intraday CV below 10%, supporting reliable biomarker measurement for diagnostic and therapeutic monitoring workflows. This capability enhances predictive confidence in target validation and assay development for cardiovascular, endocrine, and oncology indications where low-abundance analytes drive clinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying low-abundance peptides like angiotensin I in plasma, supporting functional validation of disease-relevant targets.
- Operational Value: Provides specific and accurate measurements from complex samples, reducing false negatives in biomarker detection and improving target confidence.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking through precise correlation with clinical readouts such as plasma renin activity, demonstrated by R=0.98 vs LC-MS/MS.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, mass-specific readouts via MALDI-TOF detection, enabling precise comparison of analyte levels across conditions and samples.
- Operational Value: Streamlines sample preparation through automation on liquid handling systems, improving reproducibility and throughput for large-scale screening campaigns.
- Assay Readiness: Eliminates elution steps, simplifying workflow and reducing hands-on time while maintaining sensitivity for low-abundance analytes in biofluids.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with clinical biomarkers like plasma renin activity, enabling translation from discovery to preclinical validation using disease-relevant concentration ranges.
- Risk-Adjusted Advancement: Delivers quantitative data with defined precision (CV<10%) and linearity, informing go/no-go decisions in lead optimization and preclinical candidate selection.
- Disease-Relevant System: Applicable to human plasma and other complex fluids, ensuring physiological relevance for cardiovascular, renal, and oncology biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
The iMALDI method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to translational screening, providing quantitative protein and peptide measurements that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive quantification of signaling peptides and protein biomarkers in native biological matrices.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs with high reproducibility, facilitating reliable compound effect measurement in phenotypic or target-based screens.
- Analytics: Generates mass-resolved, quantitative readouts suitable for statistical comparison and correlation with functional or clinical endpoints.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment, as demonstrated by angiotensin I quantification correlating with plasma renin activity in patient samples.
- Enterprise Reuse: Automated platform design allows reuse across multiple targets by changing antibody-bead conjugates, supporting scalable implementation in core proteomics laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through sensitive, specific detection of low-abundance analytes in disease-relevant samples.
- Operational Value: Standardization, reproducibility (CV<10%), and scalability via automation, reducing variability and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing reliable biomarker data, reducing late-stage biological attrition and improving capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, translationally aligned measurements that reflect target engagement and pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay design, antibody conjugation, and MALDI-TOF operation for successful implementation and troubleshooting.
- Dependent on liquid handling automation, magnetic bead separation systems, and MALDI-TOF instrumentation with reflector mode capability.
- Necessitates standardization across teams for reagent preparation, washing protocols, and matrix application to ensure inter-run consistency.
- Adaptation to new targets requires validation of antibody specificity, bead coupling efficiency, and interference testing in relevant biological matrices.
- Practical limitations include potential ion suppression in complex samples and the need for optimization of washing and elution-free transfer steps for each analyte-matrix pair.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
Generation of Ang I in Human Plasma
3:01
Immuno-enrichment of Ang I Using Antibody-coated Beads
6:04
Transfer of Beads onto MALDI Target Plate and MALDI-TOF-MS Analysis
6:55
Results: Quantification of Ang I Using iMALDI
7:53
Conclusion
