Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI)

Ogólnym celem tego zautomatyzowanego testu immuno-MALDI jest dokładna i czuła kwantyfikacja peptydów oraz nienaruszonych białek w złożonych płynach biologicznych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie proteomiki ilościowej, takie jak określenie poziomu białek do celów diagnostycznych lub monitorowania odpowiedzi pacjenta na leczenie. Główną zaletą tej metody jest możliwość bardzo czułej i dokładnej kwantyfikacji poziomu białek w złożonych próbkach.

Technika ta umożliwia diagnostykę chorób na wczesnym etapie, ponieważ etap immuno-wzbogacania w analizie pozwala na ilościowe oznaczenie niskoobfitych białkowych i peptydowych biomarkerów. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji o aktywności reniny w osoczu, może być ona również zastosowana w innych badaniach związanych z chorobami, takich jak ilościowe oznaczenie białek związanych z nowotworami w celu prognozowania, diagnostyki i zarządzania leczeniem. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić próbki ludzkiego osocza w kąpieli wodnej o temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie umieścić próbki na lodzie aż do całkowitego rozmrożenia. Kolejno ręcznie przenieść 200 µL każdej próbki osocza do oddzielnych dołków płytki głębokodna o objętości 1,1 ml. Wirować płytkę przez 10 minut w temperaturze 2 °C przy 3 000 rpm.

Następnie, użyj systemu Bravo do wykonania rozcieńczeń seryjnych standardowego roztworu Ang-1 NAT o stężeniu 500 femtomole per microliter, aby przygotować sześć roztworów kalibracyjnych z albuminą białka jaja kurzego. Po odwiruванні przeniesienie pipetą 200 microliters każdego kalibratora do osobnej studzienki oraz 125 microliters buforu do generowania do płytki z próbkami. Używając zautomatyzowanego systemu do obsługi cieczy, wymieszaj 125 microliters supernatantu osocza lub 125 microliters roztworu albuminy białka jaja kurzego z 25 microliters buforu do generowania angiotensyny I w nowej płytce z głębokimi studzienkami o pojemności 1.1 milliliter.

Następnie automatycznie przenieś roztwory na płytkę 96-dołkową w trzech powtórzeniach dla każdego roztworu, dozując 34 µL roztworu na dołek. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. W celu sprzężenia przeciwciała z kulkami białka G, przenieś najpierw 78 µL wcześniej przygotowanej zawiesiny kulek do probówki o pojemności 1,5 ml.

Przemyj kuleczki siedem razy jednym mililitrem 25% acetonitrylu w PBSC oraz trzy razy jednym mililitrem PBSC, wykorzystując statyw magnetyczny do osadzania kuleczek po każdym myciu. Po przemyciu kuleczek resuspenduj je w 110 µl PBSC i dodaj 110 µl przeciwciała przeciwko angiotensynie I. Wymieszaj kuleczki z roztworem, pipetując zawiesinę.

Następnie inkubować kuleczki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, rotując je z prędkością 8 rpm. Po tym czasie przemyć kuleczki trzykrotnie 1 ml PBSC. Następnie zawiesić kuleczki ponownie w 1,100 µl PBSC.

Następnie ręcznie przenieś roztwór kulek do płytki 96-dołkowej. Potem za pomocą Bravo podziel kulecki do tej samej płytki 96-dołkowej. Po trzygodzinnym okresie generowania angiotensyny I umieść płytkę inkubacyjną na lodzie na 10 minut, aby przerwać proces generowania angiotensyny I. Automatycznie rozcieńcz stokowy roztwór peptydowych standardów izotopowych 100-krotnie w buforze PBS.

Następnie automatycznie nalić rozcieńczenie peptydowego standardu izotopu stabilnego do płytki PCR z 96 dołkami. Przenieś 10 µL rozcieńczonego roztworu peptydowego do każdego dołka płytki inkubacyjnej. Wymieszaj rozcieńczony roztwór peptydowy z próbkami osocza lub roztworem albuminy białka jaja kurzego.

Automatycznie dodaj próbki lub roztwory standardów do roztworów kulek na płytkę inkubacyjną i wymieszaj. Po godzinnej inkubacji automatycznie przemyj kulki trzy razy roztworem wodorowęglanu amonu o stężeniu 5 mM. Po każdym przemyciu użyj magnesu, aby przyciągnąć kulki do dna.

Po ostatnim przemyciu, do każdej studzienki należy dodać 10 µL roztworu wodorowęglanu amonu, aby resuspendować kuleczki. Następnie automatycznie przenieść 7 µL zawiesiny kuleczkowej na płytkę docelową MALDI o rozmiarze plamki 2 600 µm. Po wyschnięciu kuleczek, automatycznie nanieść 2 µL wcześniej przygotowanego roztworu matrycy HCCA ze studzienki z matrycą na każdą plamkę z próbką na płytce docelowej.

Następnie przeanalizuj plamki z próbek za pomocą instrumentu MALDI-TOF w dodatnim trybie reflektorowym. Przeprowadź kalibrację wewnętrzną, wygładzanie danych oraz odejmowanie linii bazowej przy użyciu oprogramowania producenta. Zautomatyzowana procedura iMALDI służąca do pomiaru angiotensyny I umożliwia wysokoprzepustową analizę dużej liczby próbek z wewnątrzdobowym współczynnikiem zmienności poniżej 10%. Tutaj przedstawiono reprezentatywne widma uzyskane podczas pomiaru angiotensyny I w próbkach ludzkiej osocza.

Tutaj przedstawiono korelację wartości PRA z 188 próbek pacjentów uzyskanych za pomocą zautomatyzowanego testu iMALDI z wartościami PRA uzyskanymi przy użyciu klinicznej procedury LC-MS/MS. Współczynnik korelacji obu metod wynosi 0,98, a różnica między nachyleniami może wynikać z zastosowania różnych standardów wewnętrznych lub różnych przeciwciał. Tutaj zaprezentowano zakres liniowy testu oraz precyzję testu.

Po opanowaniu techniki jej wykonanie zajmuje około pięciu godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym ustawieniu głowicy końcówki oraz prędkości dozowania cieczy. Po zakończeniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody w celu potwierdzenia pierwotnego hiperaldosteronizmu u pacjentów, w tym testy obciążenia solą drogą doustną lub testy infuzji soli fizjologicznej.

Zautomatyzowana technika iMALDI umożliwia specyficzne i dokładne wysokoprzepustowe przesiewowe oznaczanie ilościowe próbek biologicznych, w tym próbek pacjentów, w celu wykrycia białek lub peptydów związanych z chorobą. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania zautomatyzowanego testu iMALDI do ilościowego oznaczania białek i peptydów metodą spektrometrii mas. Należy pamiętać, że praca z próbkami biologicznymi, takimi jak ludzka osocze, wiąże się z ogromnym ryzykiem, dlatego podczas wykonywania procedury należy zawsze przestrzegać niezbędnych środków ostrożności.