Name: In Situ Charakterystyka biofilmów Shewanella oneidensis MR1 za pomocą SALVI i ToF-SIMS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę hodowli biofilmów Shewanella oneidensis MR-1 w mikroreaktorze SALVI z analizą ToF-SIMS. Technika umożliwia wizualizację żywych biofilmów w stanie uwodnionym oraz mapowanie ich rozkładu chemiczno-przestrzennego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni funduszowi Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Earth and Biological Sciences (EBD) za wsparcie dla Laboratorium Badań i Rozwoju (LDRD). Dostęp instrumentalny został zapewniony za pośrednictwem W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) General User Proposal. EMSL jest krajowym obiektem naukowym sponsorowanym przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych (BER) w PNNL. Autorzy dziękują dr Yuanzhao Dingowi za korektę manuskryptu i udzielenie przydatnych informacji zwrotnych. PNNL jest obsługiwany przez Battelle dla DOE na podstawie umowy DE-AC05-76RL01830.

<ol><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+regulation+of+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Physicochemical regulation of biofilm formation.</a> MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrmicro/journal/v8/n9/abs/nrmicro2415.html">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Aldeek, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+hydrophobic+domains+in+the+exopolymer+matrix+of+Shewanella+oneidensis+MR-1+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Patterned hydrophobic domains in the exopolymer matrix of Shewanella oneidensis MR-1 biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (4), 1400-1402 (2013).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+molecular+imaging+of+a+hydrated+biofilm+in+a+microfluidic+reactor+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS.</a> Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).</li>
<li>Yu, X. Y., Yang, L., Cowin, J. P., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US Patent. , (2013).</li>
<li>Yu, X. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US Patent. , (2014).</li>
<li>Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/234016179_Making_a_hybrid_microfluidic_platform_compatible_for_in_situ_imaging_by_vacuum-based_techniques">Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques.</a> J Vac Sci Technol A. 29 (6), (2011).</li>
<li>Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Iedema, M. J., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+liquid+surfaces+under+vacuum+using+SEM+and+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Molecular+Imaging+of+the+Biofilm+and+Its+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In Situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix.</a> Anal Chem. , (2016).</li>
<li>Yang, J., Ghobadian, S., Montazami, R., Hashemi, N. Proceedings of the Asme 11th Fuel Cell Science, Engineering, and Technology Conference, 2013. , (2013).</li>
<li>Yu, F., Wang, C. X., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/1996-1944/9/10/807">Applications of Graphene-Modified Electrodes in Microbial Fuel Cells.</a> Materials. 9 (10), (2016).</li>
<li>Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Characterization+of+Hydrated+Proteins+in+Water+by+SALVI+and+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS.</a> J Vis Exp. (108), e53708(2016).</li>
<li>Hill, E. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Effects+of+Electron-Transport-System+Impairment+on+Hydrogen+Gas+Production+by+the+Bacterium+Shewanella+oneidensis+MR-1%22">Effects of Electron-Transport-System Impairment on Hydrogen Gas Production by the Bacterium Shewanella oneidensis MR-1</a>. , Washington State University. Master's thesis (2007).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/EE/C4EE03875D#!divAbstract">Biophotovoltaics: oxygenic photosynthetic organisms in the world of bioelectrochemical systems.</a> Energy Environ Sci. 8 (4), 1092-1109 (2015).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chemical+probing+of+the+electrode-electrolyte+interface+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 14, 855-859 (2014).</li>
<li>Keune, K., Hoogland, F., Boon, J. J., Peggie, D., Higgitt, C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1387380608004259">Evaluation of the "added value" of SIMS: A mass spectrometric and spectroscopic study of an unusual Naples yellow oil paint reconstruction.</a> Int J mass Spectrom. 284 (1-3), 22-34 (2009).</li>
<li>Lee, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+M+%22Mass+Spectrometry+Handbook%22">Mass Spectrometry Handbook</a>. , John Wiley & Sons Inc. 988(2012).</li>
<li>Petrovic, M., Barcelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+anionic+and+nonionic+surfactants%2C+their+degradation+products%2C+and+endocrine-disrupting+compounds+in+sewage+sludge+by+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of anionic and nonionic surfactants, their degradation products, and endocrine-disrupting compounds in sewage sludge by liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Anal Chem. 72 (19), 4560-4567 (2000).</li>
<li>Vickerman, J. C. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/an/c1an00008j#!divAbstract">Molecular Imaging and Depth Profiling by Mass Spectrometry--Sims, MALDI or DESI.</a> Analyst. 136 (11), (2011).</li>
<li>Weng, L. T., Bertrand, P., Stonemasui, J. H., Stone, W. E. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sia.740210611/abstract">Tof Sims Study of the Desorption of Emulsifiers from Polystyrene Latexes.</a> Surf Interface Anal. 21 (6-7), 387-394 (1994).</li>
<li>Peñuelas-Urquides, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+of+Mycobacterium+tuberculosis+crowth.+A+correlation+of+the+optical+measurements+with+colony+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Measuring of Mycobacterium tuberculosis crowth. A correlation of the optical measurements with colony forming units.</a> Braz J Microbiol. 44 (1), 287-289 (2013).</li>
<li>Dohnalkova, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hydrated+microbial+extracellular+polymers%3A+comparative+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Imaging hydrated microbial extracellular polymers: comparative analysis by electron microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1254-1262 (2011).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sia.5252/abstract">In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces.</a> Surf Interface Anal. 46, 224-228 (2013).</li>
<li>Yu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+transient+species+at+the+electrode-electrolyte+interface+by+in+situ+dynamic+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging.</a> Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Po zaszczepieniu w fazie logarytmicznej ważne jest, aby przetestować liczbę dni i temperaturę, w których biofilm powinien rosnąć, zanim stanie się wystarczająco zdrowy i gruby do obrazowania, jak opisano w kroku 3.1. Procedura ta obejmuje w szczególności hodowlę biofilmu MR1 S. oneidensis w temperaturze pokojowej; Jednak różne temperatury w pomieszczeniu mogą wpływać na tempo wzrostu. Dlatego tak ważne jest, aby wykorzystać obrazowanie optyczne, aby zrozumieć, czy biofilm jest gotowy przed przystąpieniem do analizy ToF-S...

Biofilmy bakteryjne to społeczności związane z powierzchnią, które rozwinęły się z biegiem czasu jako obrona bakterii, aby przetrwać różne niekorzystne bodźce fizyczne i mechaniczne, w których komórki są w stanie przyczepić się i przetrwać w wielu możliwych środowiskach. 1,2 Biofilmy są szeroko badane i mają zastosowanie w wielu dziedzinach, takich jak biomedycyna, inżynieria biomedyczna, rolnictwo oraz badania i rozwój przemysłowy. 1,2 Zrozumienie chemicznego mapowania tych złożonych społeczności mikroorganizmów, w tym ich samodzielnie produkowanych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS) i lokalnego środowiska klastrów wodnych, jest niezbędne do uzyskania dokładnego i szczegółowego obrazu ich aktywności biologicznej. 2
Biofilmy istnieją i rosną w stanie wysokiego nawodnienia. Stanowi to duże wyzwanie w stosowaniu technik analizy powierzchni opartych na próżni, takich jak spektrometria mas jonów wtórnych czasu przelotu (ToF-SIMS), ze względu na trudności w badaniu lotnych cieczy w próżni. W rezultacie, techniki analizy powierzchni w oparciu o próżnię zostały ograniczone prawie wyłącznie do badania próbek biofilmu tylko w stanie wysuszonym. Jednak badanie biofilmu w stanie wysuszonym utrudnia dokładne zbadanie jego prawdziwego mikrośrodowiska biologicznego. Często powoduje to drastyczne zmiany w integralności EPS i morfologii biofilmu, co wykazano po porównaniu wyników widma masowego suchego biofilmu z badaniami cieczy in situ. 3,4 Ten artykuł przedstawia rozwiązanie do badania biofilmów w ich naturalnym stanie uwodnionym przy użyciu naszego Systemu do Analizy na Granicy Spoczynków Cieczy (SALVI),5,6 reaktor mikroprzepływowy, który zawiera ciecz pod cienką membraną z azotku krzemu (SiN) w mikrokanale wykonanym z polidimetylosiloksanu (PMDS), zapewniając w ten sposób bezpośredni dostęp do jonu wtórnego wiązkę sondy przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej matrycy cieczy w komorze próżniowej. 7,8
S. oneidensis MR-1 zmutowany do ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) został wybrany jako organizm modelowy do tej ilustracji procedury biofilmu ze względu na jego metaboliczną wszechstronność i powszechne zastosowanie w mikrobiologii środowiskowej i stosowanej, która opierała się głównie na jego unikalnej zdolności do redukcji metali i zewnątrzkomórkowego transferu elektronów. 9,10,11 Dodatkowo, obecność GFP pozwoliła na łatwe ciągłe monitorowanie grubości biofilmu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, przy użyciu filtra izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Nasze wcześniejsze badania wykazały dowody na to, że bakteria ta sprzyja przyczepianiu się do okna SiN przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego in operando do wzrostu biofilmu o grubości do stu mikrometrów. 4,12 Chociaż w tym artykule omówione zostanie jedynie potwierdzenie obecności biofilmu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, SALVI jest kompatybilny z innymi metodami obrazowania optycznego, takimi jak obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości (tj. mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM)9) i obrazowanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM)4). Obrazowanie optyczne może służyć do pomiaru grubości biofilmu i uzyskania obrazu 3D kształtu biofilmu w takiej postaci, w jakiej się pojawia, potwierdzając jego grubość i przywiązanie do okna SiN. 9 Podczas gdy GFP był używany w analizie SIMS, S. oneidensis bez GFP był używany do krzywej wzrostu, ponieważ wymagało to tylko pomiaru gęstości optycznej i nie wymagało żadnego obrazowania fluorescencyjnego. Ogólnie rzecz biorąc, różnica między gatunkami oznakowanymi i nieoznakowanymi GFP na krzywej wzrostu jest nieznaczna. Dodatkowo, podczas gdy protokół ten wykorzystuje S. oneidensis MR-1 GFP jako organizm modelowy do opisania procedury, procedura ta jest przeznaczona dla każdego szczepu bakteryjnego, który może być potrzebny do hodowli w SALVI. Chociaż, biorąc pod uwagę wiedzę na temat potrzebnego szczepu bakterii, niektóre warunki wzrostu, takie jak czas, temperatura i środowisko tlenowe, mogą wymagać modyfikacji, aby dostosować się do szczepu bakterii, który ma być użyty. W przypadku pożywki wzrostowej w tej procedurze wykorzystuje się pożywkę "nanodrutów", tryptyczny bulion sojowy (TSB) bez dekstrozy i tryptyczny agar sojowy (TSA) bez dekstrozy do hodowli. Skład pożywki "nanodrutowej" został specjalnie opracowany do wzrostu i monitorowania rozszerzeń błony i peryplazmy S. oneidensis, które wydają się przybierać kształt małych drutów, a skład pożywki został ustalony w ramach wcześniejszych badań. 13,14
Nasz poprzedni protokół dotyczący płynnego ToF-SIMS in situ zilustrował korzyści, jakie SALVI ma do zaoferowania dla immobilizacji białka i przyłączania do SiN, a także szczegółowy protokół analizy ToF-SIMS i redukcji danych. 12 Zamiast powtarzać kroki redukcji danych, ten artykuł posłuży do skupienia się na unikalnym podejściu do tworzenia i hodowli biofilmów w naszym mikrokanale Salvi, a także na krokach obrazowania w celu wykrycia obecności i grubości biofilmu przed analizą ToF-SIMS. Podczas gdy wcześniej biofilmy były ograniczone tylko do wysuszonych próbek w komorze technik analizy powierzchni opartych na próżni, dzięki tej nowej możliwości można teraz uzyskać szczegółowe mapowanie chemiczne EPS i biofilmu żywych biofilmów in situ.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF. Rozdzielczość SIMS 5</td><td>:>10 000 m/&Delta; m dla rozdzielczości masowej; >4 000 m/&Delta; m dla wysokiej rozdzielczości przestrzennej</td></tr><tr><td>System do Analizy na Granicy Spoczynku Cieczy Próżni (SALVI)</td><td>Pacific Northwest</td><td>National Laboratory N/A</td><td>SALVI jest unikalnym, samodzielnym, przenośnym narzędziem analitycznym, które po raz pierwszy umożliwia instrumentom naukowym opartym na próżni, takim jak spektrometria mas jonów wtórnych czasu przelotu (ToF-SIMS), analizowanie powierzchni cieczy w ich naturalnym stanie na poziomie molekularnym.</td></tr><tr><td>-80&stopni; C Zamrażarka</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>N/A</td><td>U410 Premium Energooszczędna zamrażarka niskotemperaturowa</td></tr><tr><td>4& C Lodówka</td><td>BioCold Scientific</td><td>N/A</td><td>COLDBOX1</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>N/A</td><td>Innova 4900 Wielopoziomowy wytrząsarka środowiskowa, ustawiona na 30 stopni Celsjusza do hodowli butelki z surowicą i kolbą, ustawiona na 150 obr./min.</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74905-02</td><td>Pompa strzykawkowa Cole-Parmer, tylko infuzja, sterowanie z ekranem dotykowym 74905-02, służy do wstrzykiwania cieczy do systemu rurek i SALVI przy stałym natężeniu przepływu.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Barnstead International</td><td>LT1465X3</td><td>Lab-Line, ustawiony na 30 stopni Celsjusza do hodowli płytkowej.</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>Służy do sterylizacji złączek PEEK, systemów rurek, fiolek z surowicą i podłoża. Model 533LS Spektrofotometr sterylizatora parowego</td></tr><tr><td>próżniowego Spektrofotometr Thermo Fisher Scientific</td><td>4001-000</td><td>GENESYS 20 do odczytów OD600 kuwet dla krzywych wzrostu.</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1385</td><td>1300 Series AZ Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Mikroskop fluorescencyjny Nikon OPTIPHOT-2 z kamerą i zasilaczem lampy rtęciowej o bardzo wysokim ciśnieniu.</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>51302803</td><td>Służy do badania pH " nanodruty" podłoże po zakończeniu i przed autoklawowaniem.</td></tr><tr><td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>Do podłączenia wlotu i wylotu SALVI, strzykawki do systemu przewodów, a wlotu SALVI do komory ociekowej systemu przewodów.</td></tr><tr><td>5-osiowy stolik na próbkę Stolik</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>Stage jest wykonany samodzielnie do montażu SALVI w ToF-SIMS.</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure Water Purification System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>ROpure LP Moduł filtracji odwróconej osmozy (D2716)</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>Zakres: 100 do 1,000 &mikro;L.</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet</td><td>Neptun</td><td>2112.96.BS</td><td>1 000 &micro; L końcówki do pipet</td></tr><tr><td>Uchwyt do golenia</td><td></td> Stanley <td>N/A</td><td>Skrobak do golenia Stanley Bostitch z 5 ostrzami jednoostrzowymi, służy do cięcia rurki PTFE</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>309657</td><td>3 mL</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>309646</td><td>5 ml; Służy do wykonania komory kroplowej</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>309604</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>302830</td><td>20 ml</td></tr><tr><td>Pipeta jednorazowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-11</td><td>25 ml Fisherbrand&trade; Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem powiększającym, do napełniania butelek z serum.</td></tr><tr><td>Elektryczny napełniacz pipet</td><td>Pipet-aid</td><td>P-57260</td><td>Elektryczny napełniacz do pipet serologicznych o podciśnieniu</td></tr><tr><td>Butelka serum</td><td>Sigma</td><td>33109-U</td><td>Mieści około 69 ml płynu do wzrostu kultur, optymalna do użycia 20 ml kultury na butelkę.</td></tr><tr><td>Probówka do hodowli anaerobowej VWR</td><td></td><td>89167-178</td><td>Rurki anaerobowe, 18 x 150 mm, dostarczane z korkiem z niebieskiej gumy butylowej 20 mm i aluminiową uszczelką.</td></tr><tr><td>Gumowy korek</td><td>Sigma</td><td>27235-U</td><td>Silikonowy korek, używany do uszczelniania butelek z serum oraz do tworzenia systemu rurek / komory ociekowej.</td></tr><tr><td>Aluminiowa uszczelka zaciskana (bez przegrody)</td><td>Sigma</td><td>27227-U</td><td>Aluminiowa uszczelka do górnej części butelki z serum do stosowania z zaciskarką do butelek z serum.</td></tr><tr><td>Butelka z serum, aluminiowa uszczelka, zaciskarka</td><td>Wheaton</td><td>224307</td><td>30 mm z uszczelką standardową.</td></tr><tr><td>Rurka PTFE</td><td>Supelco</td><td>58697-U</td><td>1,58 mm OD x 0,5 mm ID 50 ft. Rurka teflonowa PTFE, używana do tworzenia systemu rurek.</td></tr><tr><td>Kuwety jednorazowe</td><td>GMBH</td><td>759085D</td><td>1,5 Ml do użytku ze spektrofotometrem.</td></tr><tr><td>Igła</td><td>BD</td><td>303015</td><td>22G; służy do wstrzykiwania butelki z surowicą.</td></tr><tr><td>Igła</td><td>BD</td><td>305120</td><td>23G; służy do przebijania gumowego korka w celu stworzenia systemu rurek kroplujących.</td></tr><tr><td>Shewanella oneidensis MR-1 z GFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Budowa wektorów GFP do stosowania u bakterii Gram-ujemnych innych niż Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; S25310A</td><td>95% zdenaturowany</td></tr><tr><td>TSA</td><td>BD</td><td>212305</td><td>Tryptyczny agar sojowy do hodowli organizmu modelowego (S. oneidensis) stosowany w tym protokole</td></tr><tr><td>RURY Bufor</td><td>Sigma</td><td>P-1851</td><td>Używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S-5881</td><td>używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma</td><td>A-5666</td><td>używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr> <tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td>Używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Fosforan sodu Monobasic</td><td>Sigma</td><td>S-9638</td><td>Używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr> <tr><td>Chlorek sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Używany do " nanodruty" pożywka i używana do wytwarzania roztworu mineralnego używanego do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Mleczan sodu</td><td>Sigma</td><td>L-1375</td><td>60% (w/w) syrop @ 98% czystości, d=1,3 g/mL, 7M, stosowany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td>Używany do wytwarzania roztworu żelaza NTA, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}Kwas</td></tr> <tr><td>nitrolotrioctowy Sól trisodowa</td><td>Sigma</td><td>N-0253</td><td>Używany do wytwarzania roztworu żelaza NTA, używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Chlorek żelaza (III)</td><td>Sigma</td><td>451649</td><td>Używany do wytwarzania roztworu żelaza NTA, używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td>Używany do wytwarzania roztworu minerałów, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Monohydrat siarczanu manganu (II)</td><td>Sigma</td><td>M-7634</td><td>Używany do wytwarzania roztworu mineralnego, używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Siarczan żelaza(II) Siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>215422</td><td>Używany do wytwarzania roztworu minerałów, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td>Służy do wytwarzania roztworu minerałów, służy do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}Chlorek</td></tr> <tr><td>kobaltu(II)</td><td>Sigma</td><td>60818</td><td>Używany do wytwarzania roztworu minerałów, używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>Sigma</td><td>229997</td><td>Używany do wytwarzania roztworu mineralnego, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr> <tr><td>Siarczan miedzi(II) Pentahydrat</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>Używany do wytwarzania roztworu minerałów, używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Siarczan glinu potasu dwunastowodny</td><td>Sigma</td><td>237086</td><td>Używany do wytwarzania roztworu mineralnego, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>B-6768</td><td>Używany do wytwarzania roztworu minerałów, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr> <tr><td>Molibdenian sodu Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td>Używany do wytwarzania roztworu minerałów, używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Chlorek niklu(II)</td><td>Sigma</td><td>339350</td><td>Używany do wytwarzania roztworu minerałów, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Dihydrat wolframu sodu</td><td>Sigma</td><td>14304</td><td>Używany do wytwarzania roztworu minerałów, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>D-Biotyna</td><td>Sigma</td><td>47868</td><td>Służy do wytwarzania roztworu witamin, służy do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Sigma</td><td>F-7876</td><td>Używany do wytwarzania roztworu witaminowego, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Chlorowodorek pirydoksyny</td><td>Sigma</td><td>P-9755</td><td>Używany do wytwarzania roztworu witaminowego, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Ryboflawina (B2)</td><td>Sigma</td><td>47861</td><td>Służy do sporządzania roztworu witaminowego, służy do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tiaminy</td><td>Sigma</td><td>T-4625</td><td>Używany do wytwarzania roztworu witaminowego, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Kwas nikotynowy</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td>Używany do wytwarzania roztworu witamin, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Kwas D-pantotenowy Sól półwapniowa</td><td>Sigma</td><td>21210</td><td>Używany do wytwarzania roztworu witaminowego, używany do " nanodruty" średnia {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Witamina B12</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td>Służy do wytwarzania roztworu witamin, służy do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Kwas 4-aminobenzoesowy</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td>Używany do wytwarzania roztworu witaminowego, używany do " nanodruty" medium {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>Kwas tioktowy</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td>Używany do wytwarzania roztworu witaminowego, używany do " nanodruty" średni {Hill, E.A. 2007}</td></tr></tbody></table>

in situ charakterystyka biofilmów shewanella oneidensis mr1 za pomocą salvi i tof-sims

In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS

Biofilmy bakteryjne to społeczności związane z powierzchnią, które są intensywnie badane, aby zrozumieć ich samodzielnie wytwarzane zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe (EPS) i ich rolę w mikrobiologii środowiskowej. W niniejszym badaniu przedstawiono metodę hodowli przyłączania biofilmu do systemu do analizy na granicy faz cieczy i próżni ciekłej (SALVI) oraz mapowania chemicznego in situ żywego biofilmu za pomocą spektrometrii mas jonów wtórnych w czasie przelotu (ToF-SIMS). Odbywa się to poprzez hodowlę bakterii zarówno na zewnątrz, jak i wewnątrz kanału SALVI za pomocą naszej specjalistycznej konfiguracji, a także poprzez techniki obrazowania optycznego w celu wykrycia obecności i grubości biofilmu przed analizą ToF-SIMS. Nasze wyniki pokazują charakterystyczne piki biofilmu Shewanella w jego naturalnym uwodnionym stanie, podkreślając jego zlokalizowane środowisko klastra wodnego, a także fragmenty EPS, które drastycznie różnią się od stanu odwodnionego tego samego biofilmu. Wyniki te wskazują na przełomowe możliwości SALVI w zakresie obrazowania biofilmów in situ za pomocą próżniowego instrumentu do obrazowania chemicznego.

Te reprezentatywne wyniki służą do zobrazowania sposobu identyfikacji i interpretacji profilu chemicznego przytwierdzonego biofilmu uzyskanego za pomocą ToF-SIMS. Po wykreśleniu widm mas z danych pozyskanych w ToF-SIMS, krótko opisanych w sekcji procedur, należy przeprowadzić identyfikację piku w celu przypisania tożsamości każdej odpowiedniej wartości m/z. Można to osiągnąć poprzez obszerny przegląd literatury z zakresu spektrometrii mas bakterii oraz specyficznych fragmentów chemicznych...

Ten artykuł przedstawia metodę hodowli biofilmu do spektrometrii mas jonów wtórnych in situ w czasie przelotu do mapowania chemicznego w stanie uwodnionym, możliwa dzięki reaktorowi mikroprzepływowemu, System do analizy na granicy faz ciekłej próżni. Jako model wykorzystano Shewanella oneidensis MR-1 z białkiem zielonej fluorescencji.

In Situ Charakterystyka biofilmów Shewanella oneidensis MR1 za pomocą SALVI i ToF-SIMS

Bacterial biofilms are surface-associated communities that are vastly studied to understand their self-produced extracellular polymeric substances (EPS) ...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla bakterii w systemie analizy na ciekłym interfejsie próżniowym (SALVI), w celu późniejszego obrazowania biofilmów w ich naturalnym stanie uwodnionym za pomocą technik próżniowych, takich jak sekundarna spektrometria mas z pomiarem czasu przelotu (ToF-SIMS). Przedstawiamy metodę, która pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii środowiskowej poprzez wizualizację chemiczno-przestrzennego rozkładu żywych biofilmów przy użyciu obrazowania spektrometrią mas, np. SIMS. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wprowadzenia żywych biofilmów do spektrometru mas oraz wielu innych platform analitycznych w celu uzyskania pomiarów multipleksowych.Choć w tym filmie wykorzystano Shewanella oneidensis, metodę tę można zastosować również w komorach beztlenowych do wzrostu biofilmu. Te ostatnie wymagają bardziej rygorystycznych warunków hodowli. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy przygotowania układu rurek są trudne do opanowania.Podczas przenoszenia do komory bezpieczeństwa biologicznego konieczne jest zachowanie szczególnej ostrożności oraz odpowiednie rozmieszczenie rurek. Używając igły o rozmiarze 22 G, ost

in-situ-characterization-shewanella-oneidensis-mr1-biofilms-salvi-tof

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Przedstawiamy prostą, półilościową metodę badania tworzenia się biofilmu in vitro. Metoda ta wykorzystuje stereomikroskop Zeiss stemi 2000-C (z dołączoną kamerą) do monitorowania czasu oraz wzorca tworzenia się biofilmu, ocenianego na podstawie rozwoju pomarszczonych kolonii.

Półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonych kolonii

Źródło: Tokunou, Y . i in., Elektrochemiczne wykrywanie efektu izotopu kinetycznego deuteru na transport elektronów zewnątrzkomórkowych w Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje montaż i działanie modelu reaktora elektrochemicznego zaprojektowanego do symulacji powstawania biofilmu na powierzchniach elektrod. Kontrolowana stymulacja elektrochemiczna sprzyja przyczepności mikroorganizmów, prowadząc do stopniowego powstawania bakteryjnego monowarstwowego biofilmu.

Opracowywanie bakteryjnego monowarstwowego biofilmu z użyciem reaktora elektrochemicznego

Pokazano chronoamperometryczny wzrost anodowych elektroaktywnych biofilmów mikrobiologicznych w reaktorze z zasilaniem przy użyciu układu trzech elektrod, kontrolowanego przez potencjostat. Zewnątrzkomórkowy transfer elektronów charakteryzuje się za pomocą woltamperometrii cyklicznej w obecności donora elektronów i pod nieobecność donora elektronów. Pokazano analizę danych fundamentalnych.

Elektroaktywne biofilmy mikrobiologiczne pochodzące ze ścieków: wzrost, utrzymanie i podstawowa charakterystyka

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Przedstawiono protokół pomiaru przewodnictwa elektrycznego żywych biofilmów mikrobiologicznych w fizjologicznie istotnych warunkach.

Charakterystyka transportu elektronów przez żywe biofilmy

Ten protokół umożliwia czytelnikowi analizę powstawania biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych przy użyciu wieloaspektowego podejścia do uchwycenia dynamicznej natury biofilmów bakteryjnych poprzez ocenę przylegania, tworzenia matrycy substancji polimerowej zewnątrzkomórkowej i dyspersji.

Tworzenie biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych: techniki identyfikacji i kwantyfikacji

Tutaj prezentujemy protokół eksperymentów elektrochemicznych na całych komórkach, aby zbadać wpływ transportu protonów na szybkość pozakomórkowego transportu elektronów przez kompleks cytochromów błony zewnętrznej w Shewanella oneidensis MR-1.

Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Ten artykuł przedstawia obszerny protokół dla PmbExM, techniki mikroskopii ekspansyjnej zaprojektowanej specjalnie dla biofilmów Proteus mirabilis. PmbExM wykorzystuje stopniową obróbkę enzymatyczną próbek biofilmu w celu uzyskania izotropowej, 4,3-krotnej ekspansji, umożliwiającej analizę w superrozdzielczości organizacji przestrzennej struktur komórkowych i subkomórkowych w tych siedzących zbiorowiskach drobnoustrojów.

Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Poznaj metodę hodowli biofilmów Shewanella oneidensis MR-1 w mikroreaktorze SALVI z analizą ToF-SIMS. Technika umożliwia wizualizację żywych biofilmów w stanie uwodnionym oraz mapowanie ich rozkładu chemiczno-przestrzennego.

In Situ Charakterystyka biofilmów Shewanella oneidensis MR1 za pomocą SALVI i ToF-SIMS

Przeglądaj więcej filmów