Name: Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj metodę segmentowej infekcji adeno-cre jelita grubego w genetycznie modyfikowanym modelu mysim raka jelita grubego. Technika umożliwia tworzenie odtwarzalnych guzów lokalizowanych w okrężnicy i ich monitorowanie kolonoskopią wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest poświęcona pamięci profesora Moritza Kocha.

Przedstawione tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały niezależnie ocenione i zatwierdzone przez instytucjonalny i rządowy Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Federacji Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA). Podjęto wszelkie możliwe środki, aby zminimalizować cierpienie, w tym znieczulenie i analgezję lub, jeśli to konieczne, przedwczesną eutanazję.
1. Miejscowa indukcja guza poprzez chirurgiczne zakażenie adeno-cre
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierząt do zabiegu chirurgicznego 
	UWAGA: Praktycznie każda mutacja warunkowa ("floksowana") może być wywołana za pomocą opisanej tutaj metody. Zaleca się stosowanie mutacji w genach istotnych dla raka jelita grubego, takich jak Apc, Kras lub Tp53. Skuteczność rekombinacji cre zależy od wielkości konstruktu, który ma zostać wycięty. Duże sekwencje floxowane są wycinane mniej wydajnie. Rekombinacja wszystkich alleli powinna zostać potwierdzona w nowotworach metodą PCR.
	<ol>
		<li>Do rozwoju nowotworów jelita grubego należy użyć krzyżówki następujących alleli warunkowych dla podstawowego modelu CRC (numer bazy danych MGI w nawiasach): 
		Apctm2Rak (MGI: 3688435)16 
		Krastm4Tyj (MGI: 2429948)17 
		Tp53tm2Tyj (MGI: 3039263)18</li>
		<li>Jeśli wymagany jest allel reporterowy fluorescencji (np. do wykrywania mikroprzerzutów), należy użyć następującego allelu: 
		Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze (MGI: 3809522)19 
		UWAGA: Wszystkie powyższe szczepy są dostępne za pośrednictwem NCI Mouse Repository lub Jackson Laboratory. Nie jest wymagany post, ponieważ cały pozostały kał może zostać wypłukany przed infekcją adenowirusową. Post przedoperacyjny prowadzi do wyższej śmiertelności okołooperacyjnej i stanowi ogromny stres dla małych gryzoni.</li>
		<li>Stosować sewofluran w stężeniu 3 - 3,5% obj. do znieczulenia ogólnego. Utrata odruchu szczypania palca u nogi wskazuje na wystarczające znieczulenie.</li>
		<li>Przed pierwszym nacięciem należy wstrzyknąć podskórnie 0,05 mg/kg buprenorfiny.</li>
		<li>Zakryj oczy znieczulonej myszy maścią okulistyczną, aby uniknąć wysuszenia rogówki.</li>
		<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na małym stole. Użyj nieurazowych taśm samoprzylepnych, aby unieruchomić mysz.</li>
		<li>Ogol brzuch golarką elektryczną (alternatywnie można użyć kremu do depilacji) i zdezynfekuj wacikami nasączonymi alkoholem lub jodem. Stosować czas kontaktu zalecany przez producenta.</li>
		<li>Przykryj pole operacyjne sterylnymi serwetami. 
		UWAGA: Stosowanie antybiotyków okołooperacyjnych jest opcjonalne i podlega wytycznym instytucjonalnym.</li>
		<li>Do wszystkich zabiegów chirurgicznych używaj sterylnych narzędzi jednorazowego użytku lub wysterylizowanych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laparotomia w linii środkowej i odsłonięcie jelita grubego
	<ol>
		<li>Za pomocą nożyczek (alternatywnie można użyć skalpeli), aby wykonać nacięcie w linii środkowej (~ 15 mm) skóry na dolnej części brzucha.</li>
		<li>Podnieś muskulaturę ściany brzucha kleszczami i ostrożnie naciąć ją nożyczkami, otwierając w ten sposób jamę brzuszną.</li>
		<li>Zidentyfikuj dystalną okrężnicę, dotykaj jej tylko atraumatycznymi kleszczami. Zacisnąć okrężnicę delikatnym zaciskiem (np. zaciskiem naczyniowym Micro Serrefine) około 15 mm proksymalnie od odbytu. 
		UWAGA: Przez cały czas zwracaj szczególną uwagę na wrażliwość jelita grubego. Perforacja nieuchronnie prowadzi do zapalenia otrzewnej i sepsy oraz wymaga eutanazji zwierzęcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Segmentowe zakażenie jelita grubego wirusem Adeno-cre
	<ol>
		<li>Włóż elastyczną rurkę teflonową przezodbytniczo i ostrożnie przesuwaj ją, aż osiągnie okluzję światła uzyskaną przez zacisk umieszczony wcześniej w odległości 15 mm od krawędzi odbytu. Nie używaj nadmiernej siły, ponieważ może to prowadzić do perforacji.</li>
		<li>Kankanulować probówkę kaniulą 30G, podłączyć standardową strzykawkę o pojemności 1 ml i przepłukać okrężnicę zwykłą solą fizjologiczną w celu usunięcia pozostałego kału. Może to wymagać kilku ml soli fizjologicznej.</li>
		<li>Gdy dystalna okrężnica jest pusta, wyjmij rurkę i zastąp ją świeżą rurką teflonową i ponownie ustaw ją bezpośrednio dystalnie do zacisku, jak opisano powyżej.</li>
		<li>Okrężnica należy zatkać drugim zaciskiem ~ 3 mm dystalnie do zacisku proksymalnego (tj. nad wprowadzoną rurką, ~ 12 mm od krawędzi odbytu), co skutkuje izolowanym segmentem o grubości 3 mm, który ma zostać zainfekowany. 
		UWAGA: Do dystalnej niedrożności segmentu klipsy do tętnic wieńcowych Fogarty okazały się najbardziej odpowiednie, ponieważ są gumowane, co prowadzi do ciasnej niedrożności okrężnicy pomimo rurki śródświetlnej między gałęziami zacisku.</li>
		<li>Użyj drugiej strzykawki (standardowo 1 ml z kaniulą 30G), aby ostrożnie wstrzyknąć 50 - 80 μl 0,25% trypsyny-EDTA do zaciśniętego segmentu okrężnicy i inkubować przez 10 minut. Pozostaw kaniulę i strzykawkę podłączone do rurki teflonowej, aby zapobiec cofaniu się płynu. 
		UWAGA: Okrężnica musi być napompowana, aby rozbić barierę śluzówkową i dotrzeć do krypt komórek macierzystych, ale nie za bardzo, aby uniknąć perforacji zaciśniętego segmentu.</li>
		<li>Najpierw usuń dystalny zacisk, a następnie rurkę trypsyny.</li>
		<li>Przepłucz dystalną część jelita grubego ~ 500 μl soli fizjologicznej, aby usunąć pozostałą trypsynę.</li>
		<li>Włóż nową rurkę teflonową, umieść dystalny zacisk z powrotem na miejscu i napompuj segment okrężnicy 50 - 80 μl roztworu adenowirusowego (1011 jednostek tworzących blaszki (PFU)/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) i inkubuj przez 30 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
		UWAGA: Nie rozlewaj roztworu wirusa, ponieważ kontakt z adeno-cre może prowadzić do rozwoju guza w jakiejkolwiek tkance warunkowo zmutowanych myszy.</li>
		<li>Usuń zaciski i rurkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknięcie brzucha i rekonwalescencja pooperacyjna
	<ol>
		<li>Zamknij ścianę brzuszną za pomocą 6-0 szybko wchłanialnych szwów biegowych (np. polidioksanon (PDS)).</li>
		<li>Zamknij skórę klipsami chirurgicznymi do ran.</li>
		<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 38 °C, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia.</li>
		<li>Podać kolejny bolus 0,05 mg/kg buprenorfiny domięśnie 12 godzin po zabiegu, a następnie dodatkowe bolusy buprenorfiny co 12 godzin, jeśli to konieczne.</li>
		<li>Monitoruj myszy co najmniej raz dziennie pod kątem oznak niepokoju spowodowanego wzrostem guza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kolonoskopia
UWAGA: W zależności od zastosowanych mutacji warunkowych, infekcja adenowirusowa prowadzi do endoskopowo widocznych guzów w ciągu 2 - 4 tygodni. Dlatego pierwszą kolonoskopię pooperacyjną należy wykonać 2 tygodnie po indukcji adenowirusa i powtarzać co 2 tygodnie. Do kolonoskopii mysiej zalecany jest dostępny na rynku system. 20
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierząt do kolonoskopii 
	UWAGA: Post nie jest wymagany. Pozostały kał jest zwykle dobrze uformowany w dystalnej części okrężnicy i może zostać wypchnięty poza guz podczas kolonoskopii, dzięki czemu stresujący proces powtarzającego się postu nie jest potrzebny.
	<ol>
		<li>Stosować sewofluran w stężeniu 3 - 3,5% obj. do znieczulenia ogólnego. Utrata odruchu szczypania palca u nogi wskazuje na wystarczające znieczulenie.</li>
		<li>Zakryj oczy znieczulonych myszy maścią okulistyczną, aby uniknąć wysuszenia rogówki.</li>
		<li>Unieruchamiaj myszy w pozycji leżącej na małym stole.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolonoskopia
	<ol>
		<li>Włóż lunetę (średnica 1,9 mm; długość 10 cm) do przewodu pokarmowego przez odbyt i ostrożnie wdmuchuj powietrze pod kontrolą wzrokową, aby rozciągnąć okrężnicę. Nie wdmuchiwać więcej powietrza niż jest to wymagane do badania. 
		UWAGA: Do wdmuchiwania powietrza można użyć pompy powietrza przeciwmgielnego systemu kolonoskopowego. Jeśli nie jest dostępna pompa powietrza przeciwmgielnego, można użyć dowolnej innej pompy powietrza z bardzo niskimi ustawieniami ciśnienia lub powietrza pod ciśnieniem z delikatnym zaworem redukcyjnym ciśnienia. Dwutlenek węgla (CO2 ) łatwo prowadzi do kwasicy u małych gryzoni i dlatego należy go unikać.</li>
		<li>Ostrożnie popchnij lunetę do przodu, aż będzie można zidentyfikować zmianę śluzówkową w dalszej części jelita grubego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A - 1D).</li>
		<li>Zapisz obrazy endoskopowe do późniejszej oceny. Endoskopowy system punktacji guzów śródświetlnych został opisany wcześniej. 20</li>
		<li>Ostrożnie zdejmij lunetę i umieść mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 38 °C, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2016.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li>
<li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639298">Colorectal cancer.</a> Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).</li>
<li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+minimal+residual+disease+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer.</a> World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).</li>
<li>Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+significance+of+circulating+and+disseminated+tumour+cells+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer.</a> Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).</li>
<li>García, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDB1+overexpression+is+a+negative+prognostic+factor+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer.</a> Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).</li>
<li>van Noort, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Drug+Candidates+for+the+Treatment+of+Metastatic+Colorectal+Cancer+through+Global+Inverse+Gene-Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling.</a> Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).</li>
<li>Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/peer-reviewed/mouse-models-of-colorectal-cancerderived-circulating-tumor-cells-76740.html">Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells.</a> Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).</li>
<li>Taketo, M. M., Edelmann, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19263594">Mouse models of colon cancer.</a> Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+exhibit+stem+cell+characteristics+in+an+orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+combined+with+TLR7%2F8+activation+induces+strong+immune+responses+against+gastrointestinal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors.</a> Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).</li>
<li>Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+induction+relationships+in+development+of+transplantable+cancers+of+the+colon+in+mice+for+chemotherapy+assays%2C+with+a+note+on+carcinogen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure.</a> Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).</li>
<li>Roper, J., Hung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priceless+GEMMs%3A+genetically+engineered+mouse+models+for+colorectal+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development.</a> Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).</li>
<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li>
<li>Shibata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorectal+adenoma+formation+initiated+by+conditional+targeting+of+the+Apc+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene.</a> Science. 278 (5335), 120-123 (1997).</li>
<li>Kuraguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenomatous+polyposis+coli+%28APC%29+is+required+for+normal+development+of+skin+and+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus.</a> PLoS Genet. 2 (9), e146(2006).</li>
<li>Jackson, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lung+tumor+initiation+and+progression+using+conditional+expression+of+oncogenic+K-ras%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.</a> Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).</li>
<li>Olive, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p53+gain+of+function+in+two+mouse+models+of+Li-Fraumeni+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome.</a> Cell. 119 (6), 847-860 (2004).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+colonoscopy+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).</li>
<li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li>
<li>de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+mouse+Msh2+gene+results+in+mismatch+repair+deficiency%2C+methylation+tolerance%2C+hyperrecombination%2C+and+predisposition+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer.</a> Cell. 82 (2), 321-330 (1995).</li>
<li>Reitmair, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+intestinal+carcinomas+and+skin+neoplasms+in+Msh2-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice.</a> Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).</li>
<li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+operating+procedures+for+describing+and+performing+metabolic+tests+of+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice.</a> Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).</li>
<li>Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+of+mice%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Fasting of mice: a review.</a> Lab Anim. 47 (4), 225-240 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż są one na ogół łatwe do wygenerowania i utrzymania, klasyczne mysie modele CRC oparte na wstrzyknięciu linii komórkowej są sztuczne i nie są w stanie w pełni odtworzyć ludzkiej choroby. W związku z tym opracowano GEMM-y. Pierwszą CRC GEMM była mysz ApcMin, która jest nosicielem heterozygotycznej mutacji zerowej w genie Apc, naśladując w ten sposób ludzką dziedziczną polipowatość gruczolakowatą (FAP). 21 Jednak myszy ApcMin niezmiennie rozwijają mnogie gruczolaki jelit...

Rak jelita grubego (CRC) nadal jest jedną z głównych przyczyn zgonów związanych z rakiem w krajach zachodnich. 1 Podczas gdy rokowanie pacjentów z wczesnym stadium choroby jest dobre, wiele nowotworów jest diagnozowanych w późniejszych stadiach, w których, pomimo licznych opcji leczenia, rokowanie jest ograniczone. 2,3,4,5
Większość obecnych mysich modeli CRC opiera się na implantacji komórek nowotworowych pochodzących z linii komórkowych lub guzów pacjenta myszom z niedoborem odporności. 6,7,8 Prowadzi to do miejscowych i, w zależności od miejsca wstrzyknięcia i komórek nowotworowych użytych do wstrzyknięcia, czasami do guzów przerzutowych. 9,10 Powstałe modele ksenoprzeszczepów mają jednak poważne ograniczenia. Muszą one zostać ustalone u myszy z niedoborem odporności, eliminując w ten sposób złożoną interakcję między guzem a układem odpornościowym gospodarza. Ponadto, ponieważ zrąb guza pochodzi z komórek gospodarza, interakcja między ludzkim miąższem guza a mysim zrębem jest wadliwa, a zatem nie jest reprezentatywna dla choroby. Niedoborów tych można uniknąć, stosując mysie linie komórkowe do wstrzykiwań. Jednak dostępnych jest tylko kilka mysich linii komórkowych CRC i, podobnie jak większość dostępnych ludzkich linii komórkowych CRC, są monoklonalne i wysoce anaplastyczne. 11 Podsumowując, większość obecnie dostępnych modeli myszy CRC jest wysoce sztuczna i nie w pełni reprezentatywna dla ludzkiej choroby.
Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) CRC mogą uniknąć tych wad, ponieważ zawierają prawdziwe guzy myszy, które powstają poprzez indukcję kluczowych mutacji CRC w okrężnicy. 12,13,14 Można to osiągnąć poprzez aktywację warunkowych (floxowanych) mutacji linii zarodkowej przez rekombinazę cre w błonie śluzowej jelita grubego. Podczas gdy w GEMM wielu innych jednostek nowotworowych stosuje się ekspresję cre linii zarodkowej (indukowalną) napędzaną przez promotory specyficzne dla tkanki, cre linii zarodkowej nie można stosować w okrężnicy, ponieważ prowadzi to do dużej liczby gruczolaków w całej okrężnicy, powodując śmierć z powodu łagodnego obciążenia guzem w bardzo młodym wieku. Dlatego w opisywanym tu modelu wektor adenowirusowy eksprymujący cre jest używany do zakażenia krótkiego odcinka jelita grubego. Prowadzi to do indukcji nowotworzenia w tym segmencie błony śluzowej w punkcie czasowym określonym przez badacza, co prowadzi do progresji gruczolaków do raka inwazyjnego i przerzutowego. Guzy są prawdziwymi nowotworami myszy, rosną w nienaruszonym mikrośrodowisku i dlatego są w stanie symulować całość onkogenezy jelita grubego, w tym interakcję guz-gospodarz i kaskadę przerzutów. Model ten jest zatem atrakcyjną platformą do badań nad biologią nowotworów i przedklinicznych badań terapeutycznych.
Główną wadą genetycznie modyfikowanych mysich modeli CRC jest ich techniczna złożoność. Miejscowe podawanie cre za pomocą lewatywy adeno-cre doodbytniczej u myszy przenoszących floksowane allele Apc zostało opisane wcześniej; Jednak częstość występowania, mnogość i lokalizacja guzów jelitowych może być bardzo zmienna w przypadku tej techniki. 15 Dlatego opracowano technikę ograniczania infekcji adeno-cre poprzez chirurgiczne zaciskanie segmentu, który ma być indukowany. 13 Zmodyfikowaliśmy tę procedurę, aby poprawić dobrostan zwierząt, a także zmniejszyć śmiertelność i liczbę powstających nowotworów. Dzięki temu protokołowi wszystkie laboratoria z doświadczeniem w chirurgii małych gryzoni powinny być w stanie odtworzyć model i wytworzyć guzy, które są wysoce powtarzalne i łatwo dostępne do kolonoskopii. W zależności od mutacji warunkowych stosowanych do nowotworzenia można zaobserwować pełne spektrum gruczolaka, raka inwazyjnego i przerzutów. Ponieważ guzy znajdują się w dalszej części jelita grubego, w tym modelu łatwo możliwa jest seryjna ocena endoskopowa.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki / materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%, czerwień fenolowa)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna 0,9% (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>Ad5CMV-Cre (adenowirus, c = 2E+11 PFU/mL)</td><td>Wektor transferu genów Core University of Iowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL, 50 mL probówki wirówkowe</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf 1,5 ml/ 2 ml</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72,695,400</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego PS 100/15 mm (sterylna, Nuclon)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>10508921/ NUNC150350</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml (bez objętości martwej) - Injekt-F SOLO Igła</td> iniekcyjna <td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>30G</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy<</td><td>strong>Uwagi</td></tr><tr><td>Analgezja / znieczulenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie)</td><td>AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Tlen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>medyczny Air Liquide Medical</td><td></td> GmbH-Buprenorfina <td></td></tr><tr><td>(Temgesic)</td><td>Indivior Eu Ltd.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen - maść okulistyczna</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Stołowy aparat do znieczulenia badawczego x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Waciki Surgical Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celuloza</td><td>Lohmann & Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa EMG 1 ml (z kaniulą 30G)</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161627S</td><td></td></tr><tr><td>Rurka drobnootworowa (otwór: 0,28 mm / średnica: 0,61 mm)</td><td>Smiths Medical Deutschland</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki Micro-Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły Olsen-Hegar</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw AutoClip</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (szew chirurgiczny)</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony zacisk naczyniowy Micro Serrefine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Fogarty Spring Clips</td><td>Edwards</td><td>CDSAFE 6</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Golarka do włosów</td><td>Aesculap - Braun</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Kolonoskopia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fontanna światła zimnego XENON 175 SCB</td><td>Karl Storz</td><td>20132101-1</td><td>Karl Storz Coloview System Moguncja</td></tr><tr><td>światłowodowy</td><td>Karl Storz</td><td>69495NL</td><td>Karl Storz Coloview System Moguncja</td></tr><tr><td>TRICAM Głowica kamery z trzema</td><td>chipami Karl Storz</td><td>20221030</td><td>Karl Storz Coloview System Moguncja</td></tr><tr><td>TRICAM SLII Jednostka sterująca kamerą</td><td>Karl Storz</td><td>20223011-1</td><td>Karl Storz Coloview System Moguncja</td></tr><tr><td>15-calowy monitor z płaskim ekranem EndoVue</td><td>Karl Storz</td><td>9415NN</td><td>Karl Storz Coloview System Moguncja</td></tr><tr><td>HOPKINS Teleskop prosty średnica 1,9 mm; długość 10 cm autoklawowalny w autoklawie wbudowana światłowodowa transmisja światła</td><td>Karl Storz</td><td>64301AA</td><td></td></tr><tr><td>Osłona ochronno-badawcza</td><td>Karl Storz</td><td>61029C</td><td></td></tr></tbody></table>

genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Pomimo zalet łatwej aplikacji i opłacalności, mysie modele raka jelita grubego oparte na wstrzykiwaniu komórek nowotworowych mają poważne ograniczenia i nie symulują dokładnie biologii guza i rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wprowadzono genetycznie zmodyfikowane modele myszy; Jednak takie modele są wymagające technicznie, szczególnie w dużych narządach, takich jak okrężnica, w których pożądany jest tylko pojedynczy guz.
W rezultacie opracowano immunokompetentny, genetycznie modyfikowany mysi model raka jelita grubego, który rozwija bardzo jednolite guzy i może być wykorzystany do badań biologicznych nowotworów, jak również do prób terapeutycznych. Rozwój guza jest inicjowany przez chirurgiczne, segmentowe zakażenie dystalnej części jelita grubego wirusem adeno-cre u myszy warunkowo zmutowanych złożonych. Guzy można łatwo wykryć i monitorować za pomocą kolonoskopii. Opisujemy tutaj technikę chirurgiczną segmentowego zakażenia adeno-cre jelita grubego, nadzór nad guzem za pomocą kolonoskopii o wysokiej rozdzielczości i przedstawiamy powstałe guzy jelita grubego.

Przy prawidłowym wykonaniu u &gt; 85% zwierząt rozwijają się guzy. Śmiertelność w przypadku przedstawionego tutaj zabiegu chirurgicznego wynosi &lt; 5%, natomiast śmiertelność przy kolonoskopii jest praktycznie zerowa. U większości myszy wykrywana jest jedna zmiana; u około 30% można stwierdzić 2 - 3 małe gruczolaki, które zazwyczaj zlewają się w jeden guz w ciągu 2 - 3 tygodni po indukcji nowotworu.
Fenotyp i zachowanie biologi...

Przedstawiono protokół tworzenia genetycznie modyfikowanego mysiego modelu raka jelita grubego poprzez segmentowe zakażenie adeno-cre i jego nadzorowanie za pomocą kolonoskopii o wysokiej rozdzielczości.

Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie segmentowej infekcji adenowirusowej Cre w jelicie grubym w genetycznie zmodyfikowanym modelu mysim. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie raka jelita grubego (CRC), ponieważ stanowi doskonały model do badania biologii i leczenia CRC. Główną zaletą tej techniki jest to, że każde laboratorium z doświadczeniem w chirurgii małych gryzoni może wykorzystać ten model do wytwarzania wysoce powtarzalnych i łatwo dostępnych guzów zlokalizowanych w jelicie grubym.Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy w pozycji na plecach i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Przymocuj mysz taśmą w bezpiecznej pozycji, a następnie potwierdź odpowiedni poziom sedacji poprzez uciśnięcie palca u stopy. Wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej w dolnej części brzucha o długości około 15 mm.Następnie za pomocą pęsety chwyć mięśnie ściany brzusznej i ostrożnie przetnij mięśnie nożyczkami, aby otworzyć jamę brzuszną. Po zlokalizowaniu końcowego odcinka okrężnicy, ostrożnie uciśnij tkankę delikatnym zaciskiem około 15 milimetrów proksymalnie względem odbytu. Następnie wprowadź przezodbytniczo elastyczną rurkę teflonową, ostrożnie posuwając

a-genetically-engineered-mouse-model-of-sporadic-colorectal-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Do ustanowienia tego modelu można wykorzystać dwie techniki: wstrzyknięcie zawiesiny komórek nowotworowych w ścianę kątnicy lub przeszczepienie fragmentu guza podskórnego na kątnicę. Model ten jest przydatny do badania naturalnej progresji raka jelita grubego oraz testowania nowych środków terapeutycznych przeciwko rakowi jelita grubego.

Ortotopowy model raka jelita grubego u myszy

Przedstawiamy protokół, w którym podanie genotoksycznego czynnika azoksymetanu (AOM), a następnie trzy cykle podania prozapalnego dekstranu siarczanu sodu (DSS), pozwala na szybkie i powtarzalne wywołanie guzów okrężnicy u myszy, wykazujących podobieństwa morfologiczne i molekularne do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego u ludzi.

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

Ten film opisuje protokół generowania mysiego modelu ortotopowego ksenoprzeszczepu jelita grubego pochodzącego od pacjenta do badania progresji komórek raka jelita grubego u myszy bez otyłości z cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID). Ten mysi model pomaga w zrozumieniu wzorca wzrostu guza pierwotnego i przerzutów.

Generowanie mysiego modelu raka jelita grubego PDOX: badanie progresji raka jelita grubego w modelu mysim

Ten film opisuje protokół tworzenia mysiego modelu spontanicznych przerzutów ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem jelita grubego lub PDX. Te modele ksenoprzeszczepów częściowo naśladują cechy ludzkich nowotworów i rozumieją krytyczne aspekty nowotworów złośliwych u ludzi, w tym inwazję i przerzuty.

Mysie modele spontanicznych przerzutów: platforma do badania potencjału przerzutowego komórek raka jelita grubego wstrzykiwanych ortotopowo

Ten film opisuje generowanie modelu myszy jelita grubego przez segmentową infekcję adeno-cre. Zakażony odcinek jelita grubego prowadzi do nowotworzenia w obrębie tego odcinka błony śluzowej, w wyniku czego gruczolaki ostatecznie przechodzą w raka inwazyjnego i przerzutowego. Model ten stanowi atrakcyjną platformę do badań nad biologią nowotworów i przedklinicznych badań terapeutycznych.

Segmentalna infekcja Adeno-Cre: technika generowania izolowanego raka jelita grubego przy użyciu genetycznie modyfikowanych modeli myszy

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Celem tego manuskryptu jest opisanie modelu myszy KitV558Δ/+ oraz technik udanej sekcji i przetwarzania próbek myszy.

Techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu guza podścieliskowego przewodu pokarmowego

Ten protokół opisuje ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta w ścianie jelita ślepego myszy z niedoborem odporności. Model podsumowuje zaawansowany rak jelita grubego, chorobę z przerzutami i pozwala na ocenę nowych leków terapeutycznych w klinicznie istotnym scenariuszu przerzutów do płuc i wątroby.

Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego

Niniejsze badanie koncentruje się na indukcji in vivo podskórnej indukcji luminescencyjnych komórek raka jelita grubego w modelu mysim oraz na późniejszym pomiarze luminescencji za pomocą systemu obrazowania. Procedura ma na celu stworzenie powtarzalnego modelu wzrostu guza do monitorowania w czasie rzeczywistym i oceny terapeutycznej.

Podskórne zastrzyki ludzkich komórek raka jelita grubego u athymicznych nagich myszy w celu oceny skuteczności przeciwnowotworowej

Procedura ortotopowego wszczepienia komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu w celu oceny progresji guza i przerzutów jest przedstawiona tutaj.

Fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy

Poznaj metodę segmentowej infekcji adeno-cre jelita grubego w genetycznie modyfikowanym modelu mysim raka jelita grubego. Technika umożliwia tworzenie odtwarzalnych guzów lokalizowanych w okrężnicy i ich monitorowanie kolonoskopią wysokiej rozdzielczości.

Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

Przeglądaj więcej filmów