Name: Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj metodę DSC z termolabilnymi ligandami do szybkiej analizy termodynamicznych parametrów fałdowania i wiązania biomolekuł. Technika ta przyspiesza badania w dziedzinie biokalorymetrii i projektowania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R. W. H. V był wspierany przez program szkoleniowy McGill Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) w zakresie bionanomaszyn. A. K. M. i P. E. J. byli wspierani przez granty NSERC 327028-09 (A. K. M) i 238562 (P. E. J.).

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Oczyść pożądaną biomolekułę13. 
	UWAGA: W protokole tym wykorzystuje się zakupiony aptamer DNA wiążący kokainę MN4 po trzykrotnej wymianie na 2 M NaCl, a następnie trzech rundach dejonizowanej wody przy użyciu filtra odśrodkowego z membraną odcinającą masę cząsteczkową 3 kDa.</li>
	<li>Zsyntetyzuj i oczyść lub kup żądany ligand termolabilny 13. 
	UWAGA: MN4 wiąże termolabilny ligand kokainę. MN4 wiąże również chininę, która jest stosowana jako ujemna kontrola termolabilności ligandów w tych temperaturach eksperymentalnych.</li>
	<li>Przygotować do dializy oczyszczonej biomolekuły i rozpuszczenia ligandów (20 mM fosforanu sodu i 140 mM buforu NaCl, pH 7,4, dla MN4 i stosowanych tu ligandów).</li>
	<li>Poddać biomolekułę dializie w stosunku do co najmniej 2 l buforu za pomocą rurki dializacyjnej z odcięciem 0,5 - 1,0 kDa.</li>
	<li>Przefiltruj końcowy bufor (określany jako bufor roboczy) przez filtr 0,2 μm, który został dokładnie zrównoważony z buforem.</li>
	<li>Odważyć żądane masy ligandów i rozpuścić je w przefiltrowanym buforze roboczym. Jeśli pożądane stężenia ligandów wymagają mas, które są zbyt małe, aby można je było dokładnie zważyć, należy przygotować stężony roztwór podstawowy liganda (10x na przykład). 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wszystkie eksperymenty DSC wykorzystywały ten sam bufor roboczy dla próbki i liganda, tj. nigdy nie wykonuj eksperymentu, w którym ligand jest rozpuszczony w innej partii buforu roboczego niż biomolekuła, ponieważ spowoduje to artefakty niedopasowania bufora w danych.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór podstawowy biomolekuły przez filtr 0,2 μm, który został dokładnie zrównoważony z buforem roboczym.</li>
	<li>Określ stężenie biomolekuły za pomocą pomiarów absorbancji (260 nm dla kwasów nukleinowych, takich jak MN4 i 280 nm dla białek).</li>
	<li>Przygotować biomolekułę i ligand należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C (odpowiedniej dla MN4 i stosowanych tu ligandów) lub w temperaturze -20 lub -80 °C, jeśli biomolekuła i ligandy tolerują zamrażanie i wymagane jest długotrwałe przechowywanie. Odgazowanie roztworów buforu, biomolekuły i liganda w odgazowywaczu stołowym (patrz tabela materiałów) przed załadowaniem do DSC. 
	UWAGA: Odgazowanie pomaga zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków w DSC w wyższych temperaturach. Bąbelki powodują artefakty sygnału, które zasłaniają kształty pików DSC i linie bazowe.</li>
</ol>
2. Przygotowanie DSC
<ol>
	<li>Odkręć uchwyt dociskowy od DSC (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Poprowadź rurkę silikonową z bufora roboczego i przymocuj ją do przedniego kołnierza (metalowego otworu) kapilary odniesienia.</li>
	<li>Utwórz most między kapilarą odniesienia a kapilarą próbki, łącząc tylny kołnierz odniesienia z przednim kołnierzem próbki.</li>
	<li>Podłącz kawałek silikonowej rurki do tylnego kołnierza próbki, który biegnie do kolby na odpady z podłączonym przewodem próżniowym.</li>
	<li>Włącz linię podciśnieniową, aby przepłukać DSC 200 ml działającego buforu.</li>
	<li>Załadować kapilarnę referencyjną DSC buforem roboczym. Przymocuj około 3-5 cm odcinki rurki silikonowej do referencyjnych kołnierzy kapilary.</li>
	<li>Włóż końcówkę pipety o pojemności 1 ml do silikonowej rurki tylnego kołnierza. Pobrać 0,8 ml buforu roboczego za pomocą pipety i włożyć końcówkę pipety z buforem do silikonowej rurki przedniego kołnierza odniesienia.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij tłok pipety w dół, aby przepuścić bufor roboczy przez przednią silikonową rurkę do kapilary referencyjnej i w górę do końcówki pipety dołączonej do tylnego kołnierza. Docisnąć tłok pipety, aż poziom bufora roboczego znajdzie się tuż nad przednią rurką silikonową, a następnie zwolnić tłok pipety, aż poziom buforu roboczego znajdzie się tuż nad tylną rurką silikonową.
	<ol>
		<li>Powtórz przepuszczanie buforu roboczego tam iz powrotem, aby oczyścić objętość z pęcherzyków w kapilarze odniesienia. 
		UWAGA: Zwykle 10 przejść roztworu tam iz powrotem wystarcza, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakryj tylną końcówkę pipety kciukiem i delikatnie pociągnij do góry tylną końcówkę pipety i przednią pipetę, aby wyjąć je z kołnierzy odniesienia z dołączoną silikonową rurką.</li>
	<li>Załadować kapilar próbki buforem roboczym, jak w krokach 2.6 - 2.9. Umieść czarną plastikową nasadkę na tylnym odnośniku i sample kołnierze, pozostawiając przednie kołnierze odkryte.</li>
	<li>Zamocuj uchwyt dociskowy.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie DSC (patrz Tabela materiałów) i zwiększ ciśnienie w urządzeniu, klikając czerwoną strzałkę w górę u góry interfejsu, gdy odczyt mocy się ustabilizuje; moc DSC jest wskazywana w polu w prawym górnym rogu interfejsu wraz z odczytem temperatury i ciśnienia przyrządu. 
	UWAGA: Monitoruj odczyt mocy, gdy ciśnienie w DSC rośnie. Zmiany mocy o więcej niż ~ 10 μW wskazują na tworzenie się pęcherzyków w naczyniach włosowatych, co może powodować artefakty w danych. Przed kontynuowaniem roztwory należy usunąć i dalej odgazować.</li>
	<li>Zrównoważ DSC z buforem roboczym, wykonując skanowanie do przodu i do tyłu. W zakładce "Metoda eksperymentalna" po lewej stronie ekranu upewnij się, że wybrana jest opcja "Skanowanie", aby uruchomić DSC w trybie skanowania temperatury. 
	UWAGA: Parametry eksperymentalne to zakres skanowania temperatury, szybkość skanowania, czas równoważenia niskiej i wysokiej temperatury oraz liczba skanów.
	<ol>
		<li>W polu "Parametry temperatury" w zakładce "Metoda eksperymentalna" kliknij przycisk "Ogrzewanie". Wprowadź 1 i 100 °C dla dolnej i górnej temperatury doświadczalnej, 1 °C/min dla szybkości skanowania i 60 s dla okresu równowagi.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Dodaj serię" pod polem wprowadzania dla okresu równowagi. Wpisz 2 w polu "Kroki do dodania" w wyskakującym okienku (dla jednego skanowania ogrzewania i jednego chłodzenia) i zaznacz pole "Alternatywne ogrzewanie/chłodzenie". Kliknij "OK"; Dodane skany pojawiają się w dolnej części interfejsu. Sprawdź, czy parametry każdego skanowania są zgodne z oczekiwaniami.</li>
		<li>Rozpocznij eksperyment, klikając zielony przycisk "odtwórz" u góry interfejsu. Przejdź do żądanego folderu i wprowadź nazwę pliku, aby zapisać eksperyment w wyskakującym okienku. Aby sprawdzić postęp eksperymentu, kliknij kartę "Dane" po prawej stronie karty "Metoda eksperymentu".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zbieranie zestawów danych DSC dla ligandów termolabilnych
UWAGA: Minimalna procedura składa się z pięciu eksperymentów: eksperymentów z odniesieniem do bufora z ligandem i bez niego (używane do odejmowania linii bazowej, zobacz Dyskusję), próbnych eksperymentów z wolną biomolekułą, biomolekułą związaną z ligandem oraz biomolekułą związaną z ligandem z dłuższym okresem równowagi w wysokiej temperaturze.
<ol>
	<li>Uruchom eksperymenty referencyjne w celu odjęcia linii bazowej przykładowych danych. Załaduj DSC z buforem roboczym w obu kapilarnach i zbierz wiele skanów do przodu i do tyłu w odpowiednim zakresie temperatur w temperaturze 1 °C min-1 z górnym (wysokotemperaturowym) czasem równowagi wynoszącym 120 s.
	<ol>
		<li>Usuń poprzednie skany równoważenia bufora z dolnej części interfejsu, podświetlając każdy z nich osobno i klikając czerwony X w prawym środkowym rogu interfejsu. Dodaj nowe skany, klikając przycisk "Dodaj serię", wpisując 20 w polu "Kroki do dodania" i zaznaczając pole "Alternatywne ogrzewanie/chłodzenie". Kliknij przycisk OK i uruchom eksperyment, klikając zielony przycisk odtwarzania, jak powyżej.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.1 - 3.1.1 z buforem roboczym zawierającym pożądane stężenie liganda w obu naczyniach włosowatych, aby uzyskać doświadczenia referencyjne dla liganda (zebrać dwa oddzielne doświadczenia, używając odpowiednio czasów równowagi wysokiej temperatury 120 s i 600 s, które zostaną wykorzystane do uzyskania stałej szybkości dla termolabilnej konwersji liganda). 
UWAGA: Zastosowana tutaj szybkość skanowania zapewnia, że biomolekuła w kolejnych eksperymentach jest w równowadze termicznej w skanowaniu do przodu i do tyłu (patrz Dyskusja). Szybkość skanowania < 0,1 - 0,2 °C min-1 prowadzi do hałaśliwych termogramów i nie ma zastosowania w eksperymentach DSC. Temperatury powinny wahać się od znacznie poniżej temperatury topnienia wolnej biomolekuły do znacznie powyżej temperatury topnienia biomolekuły nasyconej ligandem (~ 20 - 80 °C dla MN4). Sprawdź odtwarzalność skanów (na przykład wystarczy 10 skanów do przodu i 10 skanów wstecznych, co daje łącznie 20).</li>
		<li>W przypadku stosowania wielu ligandów (takich jak kokaina i chinina), należy przepłukać DSC 200 ml buforu roboczego (powtórzyć od kroku 2.5) między seriami, aby usunąć ligand z naczyń włosowatych i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. 
		UWAGA: Pomocne jest przeprowadzenie powtórzonego eksperymentu na wolnej biomolekułach po przebiegu związanym z ligandem w celu sprawdzenia, czy poprzedni ligand silnie adsorbuje się na ściankach naczyń włosowatych i nie jest odpowiednio usuwany przez przepłukiwanie buforu. Jeśli termogramy dla wolnej biomolekuły wydają się być przesunięte do większej wielkości i wyższej temperatury denaturacji po eksperymencie związanym z ligandem, jest prawdopodobne, że poprzedni ligand jest nadal obecny w kalorymetrze po przepłukaniu. Usunąć zaadsorbowany ligand przez inkubację naczyń włosowatych z 20% Contrad-70 przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C z plastikowymi nasadkami i zdjętym uchwytem dociskowym. W oprogramowaniu DSC zmień tryb eksperymentalny na "Izotermalny" w zakładce Metoda eksperymentalna. Wybierz 3 600 s jako czas trwania i 60 °C jako temperaturę izotermiczną, z zerem wprowadzonym jako czas równowagi. Kliknij "Dodaj do metody eksperymentalnej". Eksperyment izotermiczny pojawia się w dolnej części ekranu. Po zakończeniu przepłucz przyrząd 2 litrami wody dejonizowanej i powtórz od kroku 2.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom eksperymenty z próbkami przy użyciu tej samej procedury ładowania DSC i parametrów eksperymentalnych, co skany referencyjne. W przypadku wolnego zestawu danych biomolekuł należy upewnić się, że kapilara referencyjna zawiera bufor roboczy, podczas gdy kapilara próbki zawiera wolną biomolekułę w pożądanym stężeniu w buforze roboczym.
	<ol>
		<li>W przypadku doświadczeń związanych z ligandem należy upewnić się, że ligand znajduje się w buforze roboczym w kapilarze odniesienia, a biomolekuła i ligand znajdują się w buforze roboczym w kapilarze próbki. Przepłukać system między dodatkami różnych ligandów, jak w kroku 2.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić jeden dodatkowy eksperyment z biomolekułą związaną z ligandem termolabilnym, w którym okres równowagi w wysokiej temperaturze zwiększa się do 600 s, a wszystkie inne parametry eksperymentalne są takie same jak w kroku 3.2.1. 
	UWAGA: Czas trwania okresu równowagi w wysokiej temperaturze dla drugiego eksperymentu związanego z ligandem jest po prostu wybierany tak, aby zapewnić, że ligand zostanie szybciej wyczerpany niż w eksperymencie z krótkim czasem równowagi. Jeśli piki związane z ligandem z pierwszego doświadczenia rozpadają się powoli w funkcji liczby skanowania (np. różnice w kolejnych maksimach pików wynoszą ≤ 0,5 °C), należy oszacować 10- do 20-krotny wzrost okresu równowagi wysokiej temperatury, aby odpowiednio zubożyć ligand podczas drugiego eksperymentu. Dokładne obliczenie stałej szybkości konwersji liganda wymaga, aby drugi eksperyment miał szybsze zubożenie liganda w stosunku do pierwszego. Stężenia ligandów uzyskane z globalnej analizy dwóch eksperymentów będą podobne, a zatem bezużyteczne, jeśli zubożenie ligandów nie zostanie wystarczająco przyspieszone w drugim doświadczeniu.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Otwórz pliki eksperymentu DSC w oprogramowaniu do analizy danych DSC (patrz Tabela materiałów) i wyeksportuj surowe dane dotyczące mocy jako arkusze kalkulacyjne.</li>
	<li>Zaimportuj arkusze kalkulacyjne zawierające surowe dane dotyczące mocy do oprogramowania w celu dopasowania danych.</li>
	<li>Linia bazowa Odejmij dane próbki, odejmując dane dotyczące mocy bufora z eksperymentów z biomolekułami swobodnymi i związanymi z ligandem. 
	UWAGA: W eksperymencie z ligandem termolabilnym stężenie początkowego ligandu zmniejsza się z każdym skanem. Dlatego idealnym rozwiązaniem jest odjęcie skanu bufora 1 od skanu próbki 1 i tak dalej. Odkryliśmy, że skany buforowe z kokainą nie zmieniają się znacząco w miarę postępu konwersji liganda, a zatem pojedynczy termolabilny skan bufora liganda może być użyty do odjęcia wszystkich danych związanych z termolabilnym ligandem.</li>
	<li>Przelicz odjęte od linii bazowej dane dotyczące mocy próbki na pojemność cieplną. 
	UWAGA: Konwersja wymaga częściowej objętości właściwej biomolekuły, którą można oszacować14,15,16. Równanie zamiany mocy na pojemność cieplną zostało opisane wcześniej17.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Globalnie dopasuj zestaw danych o pojemności cieplnej związanej z ligandem o krótkim czasie równowagi z pojedynczym zestawem parametrów linii podstawowej, stężenia liganda, fałdowania i wiązania liganda, jak opisano wcześniej4.</li>
	<li>Powtórz globalne dopasowanie dla zestawu danych długiego czasu równowagi, aby obliczyć stałą szybkości konwersji ligandów termolabilnych, jak opisano wcześniej4.</li>
</ol>

<ol><li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+in+life+science%3A+thermodynamics%2C+stability%2C+molecular+recognition+and+application+in+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li>
<li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Anatoliy_Dragan/publication/7002826_Microcalorimetry_of_biological_macromolecules/links/0912f507f62e09cd1b000000.pdf">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li>
<li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li>
<li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li>
<li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li>
<li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li>
<li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics-based+drug+design%3A+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li>
<li>Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2173508511000141">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li>
<li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2710.1978.tb00096.x/full">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li>
<li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12066569">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li>
<li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15025917">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li>
<li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li>
<li>Hinz, H. -J. Chapter 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDurchschlag%2C+H+%22Thermodynamic+Data+for+Biochemistry+and+Biotechnology%22">Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).</li>
<li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J+Biophy%22%5BJournal%5D)">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li>
<li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li>
<li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li>
<li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="https://web.stanford.edu/~kimth/www-mit/8.13/error_propagation.pdf">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li>
<li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Szczegóły analizy dopasowania globalnego użytej na Rysunku 1 i Rysunku 2 opisano wcześniej4. Tutaj przedstawiamy praktyczne aspekty wykonywania i analizowania eksperymentów wiązania DSC z termolabilnymi ligandami. Należy zauważyć, że linia bazowa DSC uzyskana dla termolabilnego liganda samodzielnie jest odejmowana od zestawu danych ligand + biomolekuła, co sku...

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to potężna metoda ilościowego określania interakcji wiązania i fałdowania biomolekularnego1,2,3. Do mocnych stron DSC należy jego zdolność do wyjaśniania mechanizmów wiązania i fałdowania oraz do uzyskiwania odpowiednich parametrów termodynamicznych2,3. Co więcej, DSC może być wykonywany w roztworze w warunkach zbliżonych do fizjologicznych i nie wymaga znakowania biomolekuły lub ligandu, np. fluoroforami, znacznikami spinowymi lub izotopami jądrowymi4. Przyrząd skanuje temperaturę, mierząc ilość ciepła potrzebną do denaturacji biomolekuły w obecności i bez ligandu. Otrzymane termogramy są wykorzystywane do wyodrębnienia parametrów termodynamicznych rządzących procesami wiązania i fałdowania ligandów. Informacje dostarczane przez DSC lub inne techniki termodynamiczne mają kluczowe znaczenie dla projektowania leków ukierunkowanych na biomolekuły1,5,6,7,8. Jednak wielokrotne skanowanie do wysokich temperatur (~ 60 - 100 °C) może być problematyczne. Na przykład wiele ważnych farmaceutycznie związków ulega przegrupowaniu lub rozkładowi pod wpływem długotrwałej ekspozycji na wysokie temperatury9,10,11, tj. są termolabilne. Badanie oddziaływań wiązania przez DSC zazwyczaj wymaga wielu skanów do przodu i do tyłu w celu zweryfikowania odtwarzalności termogramu do analiz termodynamicznych12. Termiczna konwersja początkowego liganda do formy drugorzędowej o zmienionej charakterystyce wiązania prowadzi do wyraźnych różnic w kształcie i położeniu kolejnych termogramów, ponieważ stężenie początkowego liganda zmniejsza się z każdym skanem, podczas gdy produkty konwersji termicznej gromadzą się. Te zbiory danych nie podlegają tradycyjnym analizom.
Niedawno opracowaliśmy globalną metodę dopasowania dla zestawów danych termolabilnych ligandów DSC, która dostarcza kompletny zestaw parametrów termodynamicznych rządzących biomolekularnymi oddziaływaniami fałdowania i wiązania z pojedynczego eksperymentu związanego z ligandem, odnoszącego się do wymaganego termogramu dla wolnej biomolekuły4. Analiza skraca czas eksperymentu i wymaganą próbkę ~ 10-krotnie w porównaniu ze standardowymi podejściami DSC. Uwzględniliśmy konwersję termiczną liganda, zakładając, że dzieje się to podczas części każdego skanowania o wysokiej temperaturze, w której termogram nie zależy od stężenia liganda. Dlatego stężenie liganda jest stałą w części termogramu, która jest używana do wyodrębniania parametrów termodynamicznych. Dodatkowo wykazaliśmy, w jaki sposób można uzyskać stałą szybkości konwersji termicznej ligandów, wykonując jeden dodatkowy eksperyment z dłuższym okresem równowagi w wysokiej temperaturze. W przypadku układów, w których konwersja termiczna ligandów jest w mniejszym stopniu zależna od temperatury (tj. zachodzi w znacznym stopniu we wszystkich temperaturach), analiza może być modyfikowana tak, aby obejmowała zmienne stężenia ligandów. Tutaj demonstrujemy tę procedurę dla aptameru DNA MN4 w obecności termolabilnego liganda kokainy, który szybko przekształca się w benzoiloekgoninę w wysokich temperaturach (>60 °C). Chinina jest stosowana jako kontrola ujemna termolabywalności ligandów, ponieważ nie ulega konwersji w tych temperaturach eksperymentalnych, a także wiąże się z MN4. Opisano pozyskiwanie zestawów danych DSC ligandów termolabilnych i ich analizę, uzyskując parametry termodynamiczne i kinetyczne procesów fałdowania, wiązania i konwersji ligandów.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejoinizowana do biologii molekularnej</td><td>Sterylne</td> filtry strzykawkowe <td>Millipore H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mikrona</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe 3 kDa</td><td>Milipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>rurki do dializy 0,5-1,0 kDa odcięcie</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe zaślepki kołnierzowe DSC</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>Aptamer DNA MN4</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Kokaina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Chinina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokalorymetr NanoDSC-III</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>DSCRun oprogramowanie</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NanoAnalyze</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar biomolekularnych profili dsc za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to potężna technika ilościowego określania parametrów termodynamicznych rządzących biomolekularnym fałdowaniem i oddziaływaniami wiązania. Informacje te mają kluczowe znaczenie przy projektowaniu nowych związków farmaceutycznych. Jednak wiele ligandów istotnych z farmaceutycznego punktu widzenia jest chemicznie niestabilnych w wysokich temperaturach stosowanych w analizach DSC. W związku z tym pomiar oddziaływań wiążących jest trudny, ponieważ stężenia ligandów i produktów przekształcanych termicznie w komórce kalorymetrycznej stale się zmieniają. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystujący ligandy termolabilne i DSC do szybkiego uzyskiwania informacji termodynamicznych i kinetycznych na temat procesów fałdowania, wiązania i konwersji ligandów. Zastosowaliśmy naszą metodę do aptameru DNA MN4, który wiąże się z termolabilnym ligandem kokainy. Korzystając z nowej globalnej analizy dopasowania, która uwzględnia konwersję termolabilnego liganda, uzyskuje się pełny zestaw parametrów fałdowania i wiązania z pary eksperymentów DSC. Ponadto pokazujemy, że stałą szybkości konwersji ligandów termolabilnych można uzyskać za pomocą tylko jednego dodatkowego zestawu danych DSC. Przedstawiono wytyczne dotyczące identyfikacji i analizy danych z kilku bardziej skomplikowanych scenariuszy, w tym nieodwracalnej agregacji biomolekuły, powolnego fałdowania, powolnego wiązania i szybkiego wyczerpywania się ligandu termolabilnego.

Przedstawiono reprezentatywne dane DSC dla liganda termolabilnego w Rycina 1Położenie i wysokość piku dla kompleksu z ligandem termolabilnym stopniowo przesuwają się w stronę piku dla wolnej biomolekuły w miarę wyczerpywania się ligandu termolabilnego z każdym skanem (Rysunek 1a). Profil wolnej denaturacji służy jako punkt odniesienia dla punktu końcowego konwersji ligandu termolabilnego (Rycina 1b)....

Przedstawiamy protokół do szybkiej charakterystyki biomolekularnych oddziaływań fałdowania i wiązania z termolabilnymi ligandami za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej.

Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest wyznaczenie parametrów termodynamicznych rządzących zwijaniem biomolekuł oraz oddziaływaniami wiążącymi za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), wykorzystując termolabilny ligand w zaledwie dwóch eksperymentach. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biokalorymetrii i projektowania leków, takie jak: jakie są względne wartości parametrów termodynamicznych rządzących oddziaływaniami między biomolekułami a inhibitorami o silnym powinowactwie? Główną zaletą tej techniki jest to, że pełne miareczkowanie ligandem przeprowadzane jest w jednym eksperymencie, co pozwala na szybkie wyznaczenie parametrów termodynamicznych z analizy dopasowania globalnego.Na początek należy przygotować bufory do dializy oczyszczonej biomolekuły do roztworu ligandów. Dializuj biomolekułę przeciwko co najmniej jednemu litrowi buforu, używając membrany dializacyjnej z progiem odcięcia od 0,5 do 1,7 kilodalton. Najważniejszym krokiem w celu uzyskania wysokiej jakości danych DSC jest dializa ligandu biomolekuły przeciwko pożądanemu buforowi.Zapewnia to brak artefaktów wynikających z niedopasowania buforu w danych DSC. Przefiltruj końcowy bufor, nazywany buforem roboczym, przez filtr 0,2 µm, który został wcześniej dokładnie nasycony buforem. Odważ odpowiednie masy ligandów i rozpuść je w przefiltrowanym buforze roboczym.Jeśli pożądane stężenia ligandu wymagają mas zbyt małych do dokładnego odważenia, należy przygotować skoncentrowany roztwór zapasu ligandu. Przefiltruj roztwór zapasu biomolekuły przez filtr o porach 0,2 mikrona, który został uprzednio dokładnie wyrównany buforem roboczym. Następnie wyznacz stężenie biomolekuły za pomocą pomiarów absorbancji.Przygotowaną biomolekułę i ligand należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C lub w temperaturze -20°C lub -80°C, jeśli biomolekuła i ligand tolerują zamrażanie i wymagane jest długoterminowe przechowywanie. Przed wprowadzeniem do różnicowego kalorymetru skanującego (DSC) należy odgazować bufor oraz roztwory biomolekuły i ligandu za pomocą degasera stołowego. Odkręć uchwyt ciśnieniowy z urządzenia DSC.Następnie poprowadź silikonowy przewód od buforu roboczego i podłącz go do przedniego kołnierza kapilary referencyjnej. Stwórz mostek między kapilarą referencyjną a próbkową, łącząc tylny kołnierz referencyjny z przednim kołnierzem próbkowym. Następnie do tylnego kołnierza próbkowego przymocuj fragment silikonowego przewodu prowadzącego do kolby z odpadami z podłączoną linią próżniową.Włącz linię próżni, aby przepłukać DSC 200 mililitrami buforu roboczego. Rozpocznij od przymocowania odcinków rurki silikonowej o długości około trzech do pięciu centymetrów do kołnierzy kapilary referencyjnej. Następnie włóż końcówkę pipety o pojemności jednego mililitra do rurki silikonowej tylnego kołnierza.Pobierz pipetą 0,8 mililitra buforu roboczego i wprowadź końcówkę pipety z buforem do silikonowego wężyka przedniego kołnierza referencyjnego. Delikatnie naciśnij tłok pipety, aby przepchnąć bufor roboczy przez przedni wężyk silikonowy do kapilary referencyjnej i do dołączonej końcówki pipety w tylnym kołnierzu. Naciśnij tłok pipety, aż poziom buforu roboczego znajdzie się tuż nad przednim wężykiem silikonowym, a następnie zwolnij tłok, aż poziom buforu roboczego osiągnie wysokość tuż nad tylnym wężykiem silikonowym.Kontynuuj przepływanie buforu roboczego w przód i w tył w kapilarze referencyjnej, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie zakryj palcem wskazującym tylną końcówkę pipety i delikatnie pociągnij tylną końcówkę pipety oraz przednią pipetę do góry, aby wyjąć je z kołnierzy referencyjnych wraz z dołączonymi rurkami silikonowymi. Napełnij kapilarę z próbką buforem roboczym w taki sam sposób jak wcześniej.Na tylne kołnierze próbki referencyjnej nałożyć czarną plastikową zatyczkę, pozostawiając przednie kołnierze odsłonięte. Przymocować uchwyt ciśnieniowy do DSC, a następnie uruchomić oprogramowanie DSC i doprowadzić do uzyskania ciśnienia w urządzeniu, klikając czerwoną strzałkę w górę w górnej części interfejsu po ustabilizowaniu się odczytu mocy. Moc DSC jest wyświetlana w polu w prawym górnym rogu interfejsu, wraz z odczytem temperatury i ciśnienia urządzenia.Wyrównaj DSC za pomocą buforu roboczego, wykonując skanowanie w przód i w tył w zakładce metod eksperymentalnych po lewej stronie ekranu. Upewnij się, że wybrano opcję skanowania w celu uruchomienia DSC i trybu skanowania temperatury. W oknie parametrów temperatury pod zakładką metod eksperymentalnych kliknij przycisk grzania.Wprowadź 1 i 100 stopni Celsjusza jako dolną i górną temperaturę eksperymentalną, jeden stopień Celsjusza na minutę jako szybkość skanowania oraz 60 sekund jako czas wyrównywania. Kliknij przycisk AddSeries pod polem wprowadzania czasu wyrównywania. W wyświetlonym oknie popup wpisz dwa w polu steps to add i zaznacz pole Alternate Heating/Cooling.Kliknij OK. Dodane skany pojawią się w dolnej części interfejsu. Sprawdź, czy parametry każdego skanu są zgodne z oczekiwaniami. Rozpocznij eksperyment, klikając zielony przycisk odtwarzania w górnej części interfejsu.Przejdź do wybranego okna i w wyświetlonym oknie wyskakującym wprowadź nazwę pliku do zapisania eksperymentu. Monitoruj postęp eksperymentu, klikając kartę danych znajdującą się po prawej stronie karty metody eksperymentu. Przeprowadź eksperymenty referencyjne w celu odjęcia tła z danych próbki, ponownie ładując DSC buforem roboczym w obu kapilarach.Wykonaj kilka skanów w kierunku wzrostowym i malejącym w odpowiednim zakresie temperatur, z szybkością jeden stopień Celsjusza na minutę oraz czasem wyrównania temperatury w górę wynoszącym 120 sekund. Usuń poprzednie skany wyrównywania buforu z dolnej części interfejsu, zaznaczając każdy z nich pojedynczo i klikając czerwony znak X znajdujący się po prawej stronie środkowej części interfejsu. Dodaj nowe skany, klikając przycisk AddSeries, wpisując 20 w polu liczby kroków do dodania i zaznaczając pole Alternate Heating/Cooling.Następnie kliknij OK i uruchom eksperyment, klikając zielony przycisk odtwarzania, tak jak poprzednio. Powtórz te kroki z użyciem buforu roboczego zawierającego pożądaną stężenie ligandu w obu kapilarach, aby uzyskać eksperymenty referencyjne dla ligandu. Przeprowadź dwa oddzielne eksperymenty, które zostaną wykorzystane do wyznaczenia stałej szybkości konwersji termolabilnej.W przypadku zestawu danych dla wolnych biomolekuł należy upewnić się, że kapilara referencyjna zawiera bufor roboczy, natomiast kapilara z próbką zawiera wolną biomolekułę o pożądanej koncentracji w buforze roboczym. Następnie należy przeprowadzić eksperymenty z próbką, stosując tę samą procedurę ładowania DSC oraz parametry eksperymentalne, które zostały użyte podczas skanów referencyjnych. W przypadku eksperymentów z biomolekułami związanymi z ligandem należy upewnić się, że ligand znajduje się w buforze roboczym w kapilarze referencyjnym, a biomolekuła wraz z ligandem w buforze roboczym w kapilarze z próbką.Przed dodaniem kolejnych ligandów należy przepłukać układ, tak jak wcześniej. Przeprowadź jeden dodatkowy eksperyment z biomolekułą związaną z ligandem termolabilnym, zwiększając czas równoważenia w wysokiej temperaturze do 600 sekund; wszystkie pozostałe parametry eksperymentalne powinny pozostać bez zmian. Następnie przystąp do przetwarzania i analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Pozycja i wysokość piku związanego ligandu termolabilnego sukcesywnie przesuwają się w stronę piku cząsteczki niezwiązanej w miarę wyczerpywania się ligandu termolabilnego przy każdym skanowaniu. Trójwymiarowy profil dojrzewania służy jako punkt odniesienia dla punktu końcowego konwersji ligandu termolabilnego. Wydłużenie okresu równoważenia w wysokiej temperaturze prowadzi do bardziej wyraźnych redukcji stężenia ligandu termolabilnego przy każdym skanowaniu w porównaniu z zestawem danych dla krótkiego okresu równoważenia.Wykorzystując zoptymalizowane parametry stężeń z globalnego dopasowania dla dwóch zbiorów danych, można obliczyć stałą szybkości konwersji ligandu w wysokiej temperaturze równowagi. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać przeprowadzona w ciągu 72 godzin, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o odpowietrzeniu ligandu biomolekularnego w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z kapilar DSC za pomocą pipety ładującej, aby zapobiec powstawaniu artefaktów w danych.Po obejrzeniu tego filmu i przeczytaniu artykułu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty DSC na biomolekułach, a także jak wdrażać analizy dopasowania globalnego w celu szybkiego wyznaczania parametrów termodynamicznych rządzących oddziaływaniami zwijania i wiązania. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji o równowagowych oddziaływaniach zwijania i wiązania, może być ona również stosowana w innych układach, takich jak biomolekuły wykazujące powolną kinetykę zwijania i/lub wiązania ligandów.

measuring-biomolecular-dsc-profiles-with-thermolabile-ligands-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

Ten film demonstruje różnicową kalorymetrię skaningową - technikę badania interakcji między biomolekułą a ligandem. Wiązanie aptameru DNA i liganda termolabilnego bada się poprzez zastosowanie powtarzających się cykli ogrzewania i chłodzenia do próbki oraz uzyskanie skanów do analizy termodynamicznej.

Różnicowa kalorymetria skaningowa do badania interakcji DNA aptamer-termolabilny ligand

Termoforeza w mikroskali (MST) może być szeroko stosowana do określania powinowactwa do wiązania bez oczyszczania docelowego białka z lizatów komórkowych. Protokół obejmuje nadekspresję białka połączonego z GFP, lizę komórek w warunkach niedenaturujących oraz wykrywanie sygnału MST w obecności różnych stężeń liganda.

Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy temperaturę(y) przemiany termicznej i całkowitą energię cieplną potrzebną do denaturacji białka. Uzyskane wyniki służą do oceny stabilności termicznej antygenów białkowych w formulacjach szczepionek.

Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Monitorowanie zmian temperatury topnienia docelowego białka (np. test przesunięcia termicznego, TSA) jest efektywną metodą badania bibliotek fragmentów kilkuset związków. Przedstawiamy protokół TSA implementujący wspomaganą robotyką nanoróżnicową fluorymetrię skaningową (nano-DSF) do monitorowania wewnętrznej fluorescencji tryptofanu i rozpraszania wstecznego światła w celu badania przesiewowego fragmentów.

Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.

Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej

Tutaj prezentujemy test przesunięcia termicznego, wysokoprzepustową technikę opartą na fluorescencji, używaną do badania wiązania małych cząsteczek z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Wykorzystanie testu przesunięcia termicznego do badania wiązania substratu z selenoproteiną O

Poznaj metodę DSC z termolabilnymi ligandami do szybkiej analizy termodynamicznych parametrów fałdowania i wiązania biomolekuł. Technika ta przyspiesza badania w dziedzinie biokalorymetrii i projektowania leków.

Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania

Przeglądaj więcej filmów