Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni
13 lipca 2017
Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.
Ogólnym celem tej konfiguracji i protokołu rejestrowania zachowań jest ilościowe określenie preferencji chemosensorycznych opartych na populacji C Elegans dla rozpuszczalnych związków przy użyciu systemu akwizycji wideo z wieloma kamerami, a następnie zautomatyzowanej analizy wideo. Metoda ta może ułatwić badania neurobiologiczne C. Elegans, umożliwiając szybszą i bardziej ustandaryzowaną analizę behawioralną mutantów genetycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele powtórzeń może być testowanych jednocześnie w identycznych warunkach, przy jednoczesnym monitorowaniu czasowej dynamiki reakcji populacji nicieni na rozpuszczalne sygnały.
Montaż komory behawioralnej zademonstruje Christopher Cronin, naukowiec z tego laboratorium. Aby rozpocząć, przygotuj osłony z tkaniny, pręty montażowe kamery, wsporniki narożne, pręty wytłaczające i zespół mocowania kamery zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Zaczynając od listew końcowych przymocowanych do środkowego pręta, przymocuj stojak na kamerę i kabury do zespołu mocowania kamery.
Następnie zamontuj ramę komory behawioralnej. Zacznij od przymocowania czterech prętów aluminiowych o długości jednej stopy do kwadratowego arkusza poliestru. Wsuń jeden pręt na dwie nakrętki teowe dookól arkusza tkaniny, centrując pręt wzdłuż szerokości tkaniny.
Dokręć łączniki, aby przymocować arkusz tkaniny do każdego pręta. Rozłóż kwadratowy arkusz poliestru na powierzchni roboczej z czterema dołączonymi aluminiowymi prętami na górze. Następnie wsuń osiem wsporników narożnych na górne powierzchnie czterech aluminiowych prętów, po jednym na każdym końcu każdego pręta.
Umieść wsporniki narożne na prętach tak, aby pionowe nogi wspornika były zlicowane z końcem prętów i zabezpiecz je na miejscu, dokręcając w nakrętkach teowych. W każdym rogu ustaw profil aluminiowy o długości jednej stopy w pozycji pionowej, wsuwając profil na nakrętki teowe na dwóch nogach wspornika narożnego. Następnie przymocuj pionowy pręt do prętów poziomych, dokręcając łączniki, łącząc w ten sposób dwa sąsiednie pręty poziome.
Wsuń luźne nakrętki teowe zespołu mocowania kamery w kształcie litery H w piony ramy. Pozwól H zsunąć się całkowicie w dół, aby spocząć na wspornikach narożnych w każdym rogu ramy. Zamocuj zespół mocowania kamery na miejscu, dokręcając cztery wspornika narożnego.
Następnie użyj ostatnich czterech jednostopowych prętów aluminiowych do wytłaczania, aby zmontować dolną warstwę komory. Ustaw wsporniki narożne tak, aby nogi wsporników były zlicowane z końcem pręta i dokręć, aby zamocować je na miejscu. Następnie wsuń pręty między słupki ramy za pomocą luźnych nakrętek teowych w pionowych kanałach.
Ustaw pręt tak, aby górne krawędzie ich wsporników narożnych znajdowały się jeden cal poniżej otwartego końca słupków i zabezpiecz na miejscu, dokręcając wspornika narożnego. Następnie wsuń nakrętki teowe czterech prostokątnych arkuszy poliestru w dół do kanałów pionowych prętów wytłaczanych, aby zakryć boki komory i dokręć łączniki, aby zamocować na miejscu. Wybierz jedną stronę jako drzwi umożliwiające dostęp do wnętrza komory i usuń dwie i nakrętki teowe z dolnej warstwy komory.
Umieść plastikową nasadkę na górnym końcu każdego rogu, aby służyła jako nóżki dla gotowej ramy. Odwróć ramę prawą stroną do góry i włóż dwa uchwyty paneli na suwak do warstwy przestrzeni ramy i przekręć, aby zabezpieczyć je na miejscu. Następnie umieść kawałek przezroczystego akrylu o wymiarach 12 na 12 cali na wierzchu uchwytów panelu, aby zapewnić scenę dla płytek testowych.
Na koniec ustaw szablon kamery i stołu montażowego zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Dzień przed eksperymentem umieść 28 pustych 35-milimetrowych płytek w stosach po pięć lub mniej na płaskiej powierzchni. Napełnij każdą płytkę testową pięcioma mililitrami agaru z pożywką do hodowli nicieni i pozostaw płytki testowe do wyschnięcia w pozycji pionowej ze zdjętymi pokrywkami, na noc w temperaturze pokojowej.
W dniu eksperymentu włącz podświetlenie, uruchom komputer i uruchom oprogramowanie do przechwytywania wideo w kamerze mikroskopu. Podłącz kamerę mikroskopu do komputera i kliknij ponumerowaną miniaturę kamery w górnej części okna oprogramowania, aby view obraz na żywo z kamery. Aby dostosować ustawienia nagrywania wideo, pociągnij w dół menu formatu wideo w lewym górnym rogu obrazu z kamery i wybierz MJPG 1280x1024.
Następnie rozwiń menu folderów obok menu formatu wideo i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki wideo. Kliknij ikonę automatycznej ekspozycji w prawym górnym rogu obrazu z kamery i wyłącz automatyczną ekspozycję. Następnie kliknij ikonę LED znajdującą się bezpośrednio po prawej stronie ikony automatycznej ekspozycji, aby wyłączyć wbudowane diody LED kamery mikroskopu.
Kliknij na sąsiednie ustawienia'ikonę i wybierz monochromatyczny. Zmaksymalizuj kontrast i dostosuj jasność. Wyrównaj szablon umieszczania rozwiązania na szablonie wyrównania płyty stołu montażowego i kliknij ikonę nagrywania filmu poklatkowego po lewej stronie obrazu z kamery.
Wprowadź pięć sekund jako czas trwania i jedną sekundę jako interwał, aby nagrać pięciosekundowy film kalibracyjny z jedną klatką na sekundę. Użyj szklanej pipety o pojemności pięciu mililitrów, aby dodać 1,2 mililitra buforu pożywki do pożywki dla nicieni do płytki zsynchronizowanych robaków i delikatnie poruszyć płytkę, aby przemieścić robaki do buforu. Odpipetować bufor z płytki i dozować robaki w buforze do czystej probówki do mikrowirówki.
Pozostaw rurki na jedną do dwóch minut, aby robaki mogły osiąść na dnie. Następnie użyj plastikowej końcówki do pipety, aby usunąć jak najwięcej buforu do płukania z probówek, nie naruszając osadu zagnieżdżonych robaków na dnie probówek. Napełnij probówkę jednym mililitrem czystego buforu pożywki do hodowli nicieni i powtórz procedurę mycia jeszcze dwa razy.
Następnie przyklej szablon umieszczania roztworu na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Następnie umieść pasek taśmy dwustronnej po obu stronach szablonu wyrównywania płyty. Wyrównaj obwód płytki testowej z okręgiem na szablonie do wyrównywania płytki i dociśnij, aż szablon przylgnie do dolnej części płytki.
Następnie wyrównaj znaczniki elementów szablonu płytki testowej ze znacznikami elementów szablonu umieszczania roztworu na mikroskopie preparacyjnym. Następnie za pomocą pipety P2 umieść jeden mikrolitr buforu M13, każdy w ćwiartkach pierwszej i czwartej. Użyj nowej końcówki, aby umieścić po jednym mikrolitrze 10-milimolowego roztworu CuCl2 każdy w ćwiartkach drugiej i trzeciej.
Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś umyte robaki na płytki testowe, gdy krople roztworu zostaną całkowicie wchłonięte przez agar. Umieść kroplę robaków na obszarach powyżej i poniżej okrągłych leczonych obszarów. Złożyć tkankę cztery razy i użyć krawędzi do wchłonięcia nadmiaru buforu do płukania na płytkach testowych.
Natychmiast ułóż płytki testowe pod kamerami mikroskopowymi w komorze behawioralnej, wyrównując numery rogów szablonu. Odczekaj od dwóch do trzech minut, aby robaki mogły zaaklimatyzować się na płytkach testowych. Następnie kliknij ikonę nagrywania filmu poklatkowego po lewej stronie obrazu z kamery i wprowadź 10 minut jako czas trwania i jedną sekundę jako interwał, aby nagrać 10-minutowy film z jedną klatką na sekundę.
Na koniec kliknij Start, aby rozpocząć nagrywanie wideo. Dla każdej klatki wideo funkcja indeksu preferencji zlicza liczbę pikseli robaka w każdym obszarze zainteresowania i oblicza procent jednego piksela z całkowitej liczby pikseli w obszarze zainteresowania. Wartości indeksu preferencji uzyskane dla różnych par genotypu i leczenia są przedstawione tutaj.
Dodatnia wartość wskaźnika preferencji wskazuje na pociąg do leczenia, podczas gdy ujemna wartość indeksu preferencji wskazuje na wstręt. Wskaźnik preferencji 0,02 uzyskuje się, gdy roztwór buforowy M13 umieszczono zarówno w kontrolnych, jak i eksperymentalnych regionach zainteresowania, wykazując, że nie ma odchylenia przestrzennego. Wykres ten pokazuje również, że robaki N2 zdecydowanie unikały jonów miedzi, co skutkowało indeksem preferencji wynoszącym 0,67.
Ponadto osm-3, które są wadliwe w tworzeniu komórek czuciowych, i mutanty ocr-2, które są wadliwe w odpowiedziach nocyceptywnych za pośrednictwem ASH, wykazały zmniejszone unikanie, a nawet łagodne przyciąganie do jonów miedzi. Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby pracować szybko, ale także płynnie i konsekwentnie. Konfiguracja rejestracji i protokół testu mogą być łatwo dostosowane do scharakteryzowania reakcji behawioralnych opartych na populacji, które wynikają z interakcji między różnymi odmianami sensorycznymi C Elegans.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zestaw do rejestracji zachowań oraz protokół analizy nicieni Caenorhabditis elegans w teście opartym na populacji. Szczegółowo opisano konstrukcję komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego oraz zastosowanie oprogramowania do analizy wideo w celu zautomatyzowanej analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Mutanty genetyczne
Wstęp
- Zrozumienie preferencji chemosensorycznych u C. elegans może dostarczyć cennych informacji na temat neurobiologii.
- Zautomatyzowana analiza umożliwia szybszą i bardziej zestandaryzowaną ocenę zachowań.
- Testy oparte na populacjach pozwalają na monitorowanie wielu powtórzeń w identycznych warunkach.
- Metoda ta usprawnia badanie dynamiki czasowej odpowiedzi na rozpuszczalne sygnały.
Cel badania
- Ilościowe określenie preferencji chemosensorycznych C. elegans wobec związków rozpuszczalnych.
- Wsparcie badań z zakresu neurobiologii poprzez ulepszone techniki analizy behawioralnej.
- Zaprezentowanie sposobu montażu i wykorzystania komory behawioralnej w eksperymentach.
Zastosowane metody
- Konstrukcja komory behawioralnej z wykorzystaniem profili aluminiowych i arkuszy poliestrowych.
- Wielokamerowy system akwizycji wideo do rejestracji zachowań nicieni.
- Zautomatyzowana analiza wideo w celu ilościowego określenia odpowiedzi na związki rozpuszczalne.
- Przygotowanie płytek testowych z pożywką do wzrostu nicieni na potrzeby eksperymentów.
Główne wyniki
- Układ umożliwia jednoczesne przeprowadzanie testów wielu powtórzeń.
- Zautomatyzowana analiza dostarcza spójnych i wiarygodnych danych na temat odpowiedzi behawioralnych.
- Metoda ta rejestruje dynamikę czasową reakcji C. elegans na bodźce.
- Wykazano łatwość montażu i obsługi komory behawioralnej.
Wnioski
- Niniejszy protokół zwiększa efektywność badań behawioralnych u C. elegans.
- Zautomatyzowana analiza wideo jest cennym narzędziem w badaniach z zakresu neurobiologii.
- Konstrukcja komory behawioralnej jest praktyczna dla różnych układów eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia wysokoprzepustową, zestandaryzowaną kwantyfikację chemosensorycznych odpowiedzi na poziomie populacji u C. elegans, wspierając wczesną walidację celów oraz przesiewy fenotypowe. Dzięki automatyzacji akwizycji i analizy wideo, redukuje ona zmienność eksperymentalną i zwiększa przepustowość kampanii przesiewowych związków chemicznych oraz badań genetycznych. Podejście to dostarcza ilościowych wyników w formie indeksu preferencji (PI), co ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów neuroaktywnych oraz zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację przyciągania lub odpychania od związków rozpuszczalnych za pomocą pomiarów indeksu preferencji.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów za pomocą powtarzalnych, populacyjnych odczytów behawioralnych, które wyjaśniają interakcje między genem a związkiem.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane ilościowe pomagające w selekcji portfela związków poprzez odróżnienie związków aktywnych od nieaktywnych na podstawie fenotypów unikania lub przyciągania.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na opracowanie ustandaryzowanych, powtarzalnych testów behawioralnych kompatybilnych z formatami płytek wielodołkowych i zautomatyzowanymi systemami obrazowania.
- Skalowalność: Umożliwia jednoczesne przeprowadzanie analiz wielu powtórzeń w identycznych warunkach, co zwiększa przepustowość przesiewową dla bibliotek mutantów lub zbiorów związków.
- Standaryzacja wyników: Generuje wartości indeksu preferencji (PI) jako ilościowe, znormalizowane odczyty odpowiednie do selekcji hitów i modelowania zależności dawka-odpowiedź.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badań nad chorobami: Ułatwia badanie szlaków chemosensorycznych zachowanych u różnych gatunków nicieni, co wspiera walidację celów terapeutycznych międzygatunkowo.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia przesiew fenotypowy mutantów genetycznych powiązanych z przetwarzaniem sensorycznym, co dostarcza danych do mechanistycznych modeli zaburzeń neurologicznych.
- Predykcyjna redukcja ryzyka: Pozwala uchwycić dynamikę czasową odpowiedzi populacyjnych, pomagając odróżnić zachowania ostre od adaptacyjnych i redukując liczbę wyników fałszywie dodatnich w procesie optymalizacji związków wiodących.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając ilościowych fenotypów behawioralnych, które łączą perturbacje genetyczne z odpowiedzią na związki, co wspiera identyfikację związków wiodących poprzez zstandaryzowany, multipleksowy screening.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących funkcji genów w chemosensoryce poprzez pomiar unikania lub przyciągania w skali populacji w odpowiedzi na rozpuszczalne sygnały chemiczne.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki zautomatyzowanej analizie wideo, co minimalizuje błąd operatora i zwiększa wiarygodność danych.
- Analityka: Generuje wartości indeksu preferencji (PI) jako wyniki ilościowe, które umożliwiają porównania między genotypami, grupami traktowanymi i punktami czasowymi.
- Badania translacyjne: Wspierają ciągłość procesu od odkrycia genu do walidacji fenotypowej poprzez powiązanie mutantów genów sensorycznych ze zmienionymi odpowiedziami chemosensorycznymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania mutantów genetycznych i bibliotek chemicznych w wielu projektach dzięki modułowej konstrukcji i zautomatyzowanemu odczytowi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki ilościowemu fenotypowaniu behawioralnemu w oparciu o populację.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki zautomatyzowanej analizie wideo oraz paralelizacji wielokamerowej, co skraca czas pracy manualnej i zmniejsza zmienność międzyeksperymentalną.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje go/no-go w identyfikacji wiodących cząsteczek, dostarczając jasnych, mierzalnych odczytów fenotypowych, które redukują odsetek niepowodzeń na późnych etapach wynikających ze słabego oddziaływania na cel.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków i celów genetycznych z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne dane z wysokoprzepustowego screeningu behawioralnego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z C. elegans, projektowaniu testów behawioralnych oraz podstawowej obsłudze oprogramowania do analizy wideo.
- Zależne od konfiguracji mikroskopii wielokamerowej, kontrolowanej komory środowiskowej oraz potoków analizy obrazu służących do obliczania indeksu preferencji.
- Wymagana jest standaryzacja przygotowania nicieni, gęstości wysiewu oraz czasu aklimatyzacji w celu zapewnienia spójności testów w kolejnych próbach.
- Adaptacja do innych gatunków nicieni lub innych modalności sensorycznych może wymagać korekt w konstrukcji areny, sposobie dostarczania bodźca lub parametrach śledzenia.
- Metoda nie nadaje się do badania chemotaksji w gradientach ani do testów z bardzo małą liczbą nicieni ze względu na ograniczenia przestrzenne i zależność odczytu od wielkości populacji.
