Ocena upośledzenia pamięci przestrzennej w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu przy użyciu promienistego labiryntu z bieżnika wodnego

Ogólnym celem niniejszego protokołu Radial Water Tread Maze jest badanie pamięci przestrzennej w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu przy użyciu poznawczego zadania dostosowanego do myszy, które nie wymaga pływania. Metoda ta może być szczególnie użyteczna podczas badania funkcji poznawczych w modelach mysich, w których deficyty motoryczne i/lub brak motywacji sprawiają, że protokoły testów poznawczych oparte na pływaniu, takie jak labirynt wodny Morrisa, są niepraktyczne. Choć metoda ta może dostarczyć informacji o różnicach między grupami i funkcjach poznawczych w modelu urazowego uszkodzenia mózgu u myszy z kontrolowanym uderzeniem korowym, może być ona również przydatna do pomiaru funkcji poznawczych u myszy starszych oraz w modelach transgenicznych, które wykazują słabe wyniki w testach opartych na pływaniu.

We wszystkich dniach testowych należy wykonać następujące kroki przygotowawcze. Po pierwsze, należy pozwolić myszom na aklimatyzację w pomieszczeniu testowym, w ich klatkach domowych, przez co najmniej 30 minut. Okrągły labirynt posiada wskazówki wizualne wzdłuż wewnętrznych ścian.

Ruchoma skrzynka ucieczkowa umieszczona przy jednym z dziewięciu różnych otworów wyjścia. Podczas aklimatyzacji myszy należy zdezynfekować wyjścia oraz skrzynkę, używając sprayu z 70% ethanol.

Utrzymanie stałej temperatury wody pomiędzy próbami jest bardzo ważne. Dlatego należy mierzyć ją dokładnie i w razie potrzeby korygować. Teraz umieść skrzynkę ucieczkową przy jednym z dziewięciu otworów wyjściowych.

Należy użyć źródła ciepła, aby utrzymać w pudełku odpowiednią temperaturę, najlepiej wykorzystując podkładkę grzewczą. Należy również zabezpieczyć pudełko przed dostępem światła. Pudełko z pułapką powinno być zawsze ciemne, ciepłe i względnie bezzapachowe.

Źródło światła prawdopodobnie również służy jako sygnał, dlatego nie należy zmieniać jego położenia pomiędzy próbami. Delikatnie wyjmij mysz testową z klatki, trzymając ją za ogon, i umieść ją w centrum aparatury. Następnie niezwłocznie rozpocznij pomiar czasu potrzebnego myszy na znalezienie wyjścia.

Jeśli mysz wejdzie do otworu kończącego i nie powróci samoczynnie do labiryntu po 20 sekundach, nie należy przerywać próby. Zamiast tego należy ręcznie skierować mysz z powrotem do centrum labiryntu i pozwolić jej ukończyć próbę. Jeśli po trzech minutach mysz nie opuści labiryntu, próbę należy ocenić jako nieudaną, a czas zarejestrować jako trzy minuty.

Następnie ręcznie, ostrożnie prowadź zwierzę najprostszą drogą do wyjścia. Po dotarciu do skrzynki ucieczkowej pozwól myszy pozostać w niej przez jedną minutę. Następnie przenieś ją z powrotem do klatki macierzystej, podczas gdy labirynt jest resetowany.

Pomiędzy próbami należy dokładnie zdezynfekować pudło ucieczkowe oraz wyjścia, rozpylając 70% ethanol, aby zapobiec wykorzystywaniu przez mysz starych wskazówek zapachowych do zlokalizowania prawidłowej drogi ucieczki. Można to wykonać bardzo szybko. Następnie należy powtórzyć próbę na tej samej myszy jeszcze dwa razy, tak aby łącznie przeprowadzić trzy kolejne próby.

Każdy dzień testowy składa się z trzech prób na jedną mysz. Nie więcej i nie mniej. Oprócz dezynfekcji, należy opróżnić labirynt i wymienić wodę pomiędzy testami z różnymi myszami.

Należy upewnić się, że temperatura wody utrzymuje się w zakresie od 12 do 14 stopni Celsjusza. Aby dostosować temperaturę wody z kranu do tego zakresu, należy użyć pojemników z lodem lub chłodniejszej wody. W dniach pomiędzy testami ważne jest upewnienie się, że wskazówki wizualne w labiryncie oraz w przestrzeni wokół niego pozostają niezmienne.

Pełny schemat testowania obejmuje pięć kolejnych dni badań, prowadzonych w ten sam sposób. Piąty dzień uznaje się za pomiar retencji pamięci. Jeśli między szóstym a jedenastym dniem nie zostaną przeprowadzone żadne testy, badanie w dwunastym dniu może służyć do pomiaru pamięci długotrwałej.

Do zbadania deficytów pamięci przestrzennej zależnych od urazu u myszy poddanych kontrolowanemu uderzeniu kory indukującemu urazowe uszkodzenie mózgu lub operacji pozorowanej wykorzystano radialny labirynt wodny. Operacja TBI została szczegółowo opisana w protokole tekstowym oraz w artykule JoVE autorstwa Romina, Gao i Chena z 2014 roku. W skrócie, uraz wywołano za pomocą uderzenia kory napędzanego solenoidem z trzymilimetrową wypukłą końcówką.

Grupy kontrolne (sham) zostały poddane operacji, ale nie zostały poddane działaniu urządzenia. W 35. dniu po zabiegu przeprowadzono opisany schemat testowy. Wszystkie myszy spełniły kryteria testu oceniającego chęć ucieczki z labiryntu.

Z tego względu wszystkie zostały uwzględnione w analizie. Wyniki wskazują na wyraźną różnicę między myszami z TBI a kontrolą pozorowaną. Latencja ucieczki była istotnie dłuższa u myszy z urazem w pierwszym dniu treningu oraz w obu dniach testów pamięci.

Zatem opisany TBI wpłynął na zdolność zwierzęcia do uczenia się. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak prawidłowo przeprowadzić testy poznawcze, wykorzystując specyficzny dla myszy test poznania przestrzennego. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, badanie może zająć mniej niż 15 minut na zwierzę.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że rozmieszczenie wskazówek wizualnych oraz temperatura wody muszą pozostać niezmienne we wszystkich próbach.