Name: Test multipleksowy oparty na kulkach do analizy profili cytokin łzowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę testu multipleksowego opartego na kulkach do analizy profili cytokin łzowych u ludzi. Technika ta umożliwia badanie wielu analitów przy minimalnej objętości próbki, co jest kluczowe w okulistyce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace badawcze były wspierane przez grant Centrum z Tan Tock Seng Hospital Personalized Seed Funding Program 2015; Grant pilotażowy Singapurskiego Instytutu Badań Oka i prezentacja szpitala Tan Tock Seng w celu uzyskania dotacji z Funduszu.

Protokoły użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Szpitala Tan Tock Seng w Singapurze.
1. Analiza cytokin łzowych
<ol>
	<li>Kolekcja łez:
	<ol>
		<li>Poproś badanego, aby usiadł wygodnie na krześle do badań i oparł głowę o zagłówek.</li>
		<li>Poproś badanego, aby spojrzał w górę, ostrożnie otwórz paski Schirmera (wykonane z bibuły filtracyjnej Whatman nr 41) i umieść zaokrąglony koniec paska na dolnej sklepieniu oka i poinstruuj badanego, aby zamknął oczy na 5 minut. Podczas zbierania łez należy zachować szczególną ostrożność, aby zminimalizować kontakt z powierzchnią oka. 30</li>
		<li>Poproś badanego, aby otworzył oczy w celu wyjęcia paska i umieszczenia go w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Natychmiast przenieść probówkę do laboratorium lub przechowywać w temperaturze -80o C do czasu przeprowadzenia badań w celu profilowania cytokin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elucja próbki łez z paska przepływu łez:
	<ol>
		<li>Przytnij pasek do łez na długość 0,5 cm (w celu ujednolicenia ilości łez do badania) i umieść go w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 30 μl buforu do oznaczania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie odwirować probówkę przy 14 000 x g przez 1 minutę.</li>
		<li>Przenieść supernatant do innej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wyrzucić pasek. Umieścić próbkę zawierającą probówkę na lodzie i natychmiast użyć wymytej próbki łez do profilowania cytokin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynników: 
	UWAGA: Czterdzieści jeden analitów, które mają być badane w każdej próbce za pomocą testu multipleksowego na bazie kulek, to: interleukina (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, białko indukowane IFN-gamma 10 (IP-10, CXCL10), chemokina pochodząca z makrofagów (MDC), białko zapalne makrofagów (MIP)-1α i MIP-1β, białko chemotaktyczne monocytów (MCP)-1, MCP-3, czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α), TNF-β, onkogen regulowany wzrostem (GRO), czynnik wzrostu guza alfa (TGF-α), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)-2, płytkowy czynnik wzrostu (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), eotaksyna, fraktalkina, rozpuszczalny ligand CD40 (sCD40L), Ligand kinazy tyrozynowej 3 podobny do FMS (Flt-3L) i regulowany po aktywacji, normalne białko wyrażane i wydzielane przez komórki T (RANTES).
	<ol>
		<li>Doprowadzić fiolki z roztworem kulek przeciwciała (50X) do temperatury pokojowej (20 - 25 oC) i wirować fiolki przez 1 minutę.</li>
		<li>Policz liczbę dołków wymaganych do testu i oblicz ilość całkowitego roztworu koktajlu kulek przeciwciał (25 μl na studzienkę) i każdego roztworu kulki przeciwciała (50X) wymaganego do testu.</li>
		<li>Przygotuj roztwór koktajlowy, dodając obliczoną ilość każdego roztworu kulki przeciwciała i napełnij do pożądanej objętości końcowej, dodając pozostałą ilość rozcieńczalnika do kulek. Upewnij się, że końcowe stężenie każdego przeciwciała w koktajlu wynosi 1X. Zawsze przygotuj co najmniej 20% dodatkowej objętości roztworu koktajlowego na wypadek błędów w pipetowaniu. 
		UWAGA: Na przykład, do testu 96-dołkowego przygotuj 3000 μl roztworu koktajlu kulek przeciwciał. Wymagana ilość każdego roztworu kulki przeciwciała = 3000/stężenie podstawowe każdego roztworu kulki przeciwciała; 3000/50 = 60 μl każdego roztworu kulki przeciwciała
		<ol>
			<li>Dodać 60 μl każdego z 41 roztworów kulek przeciwciał (60 X 41 = 2460 μL) do butelki koktajlowej i dodać 540 μl roztworu rozcieńczalnika do kulek do mieszaniny kulek przeciwciał, aby uzyskać 3000 μL końcowego roztworu roboczego (1X).</li>
			<li>Przed użyciem należy dokładnie wymieszać roztwór koktajlu kulkowego. Po wykonaniu testu pozostałą objętość przechowywać w temperaturze 2-8 oC przez okres do 30 dni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj kontrole jakości (QC), dodając 250 μl wody dejonizowanej do zapasów QC 1 i QC 2.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając butelki i wiruj przez 10 sekund. Przenieś roztwór do odpowiednio oznakowanych probówek do mikrowirówek z polipropylenu i przechowuj pozostały roztwór w temperaturze -20 °C, który może być używany do 30 dni.</li>
		<li>Przygotować bufor do płukania, dodając 270 ml wody dejonizowanej do 30 ml 10-krotnego roztworu buforowego do przemywania i dobrze wymieszać (przed rozcieńczeniem doprowadzić 10-krotny bufor do temperatury pokojowej i rozpuścić wszystkie osady soli przez mieszanie). Niewykorzystany bufor do płukania (1X) należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C, który może być używany do 30 dni.</li>
		<li>Przygotować standardowy zapas cytokin ludzkich (10 000 pg/ml wszystkich analitów), dodając 250 μl wody dejonizowanej do fiolki podstawowej. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając i wiruj fiolkę przez 10 sekund. Odstawić na 10 minut i przenieść roztwór podstawowy do odpowiednio oznakowanych probówek wirówkowych z polipropylenu. Po wykonaniu testu należy przechowywać pozostały roztwór w temperaturze -20 °C, który może być używany przez okres do 30 dni.</li>
		<li>Przygotuj robocze wzorce cytokin ludzkich przez 5-krotne seryjne rozcieńczenia (50 μL -> 200 μL) z buforem testowym, aby uzyskać 2000, 400, 80, 16 i 3,2 pg/ml.</li>
		<li>Po przygotowaniu wzorca należy użyć wzorców roboczych w ciągu 60 minut i użyć buforu do oznaczania jako ślepej próby/tła (-pg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Profilowanie cytokin za pomocą testu multipleksowego opartego na kulkach:
	<ol>
		<li>Doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej i wiruj przez 5-10 sekund przed dodaniem ich do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Jeśli eluowane próbki łez są przechowywane w temperaturze -80oC przed badaniem, zamrożone ekstrakty ze łez rozmrozić na lodzie i odwirować przy 1000 X g przez 5 minut.</li>
		<li>Przygotuj arkusz testowy w konfiguracji pionowej do pracy z ludzkimi wzorcami cytokin [0 (ślepa), 3,2, 16, 80, 400, 2,000 i 10,000 pg/mL], QC1, QC2 i próbki.</li>
		<li>Dodać 200 μL buforu do płukania 1X do każdego dołka płytki, uszczelnić ją zgrzewarką do płytek i trzymać na wytrząsarce płytek w temperaturze pokojowej (20-25 oC) przez 10 minut.</li>
		<li>Zdekantuj 1X bufor myjący, odwracając płytkę i kilkakrotnie uderz nią o chłonne ręczniki, aby usunąć resztki buforu do płukania w studzienkach.</li>
		<li>Dodać 25 μl każdego działającego wzorca cytokin ludzkich, QC1, QC2, ślepej próby (bufor do oznaczania) i próbek do odpowiednich studzienek.</li>
		<li>Dodać 25 μl buforu do oznaczania do każdego dołka.</li>
		<li>Dodaj 25 μl roztworu koktajlu kulek przeciwciał 1X do każdej studzienki. Ponieważ roztwór kulki przeciwciała jest wrażliwy na światło, uszczelnij płytkę uszczelniaczem do płytek i przykryj ją folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem podczas testu.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 4 oC przez noc na shakerze.</li>
		<li>Umieść płytkę na stojaku na talerze automatycznej magnetycznej myjki do płyt. Pozostaw na 1 minutę, aby osadzać kulki magnetyczne na dnie studzienki i zassać zawartość studzienki. Dodać 200 μl buforu do płukania na studzienkę i pozostawić na 1 minutę, a następnie odessać zawartość studzienki. Powtórz pranie jeszcze raz (w przypadku mycia talerzy postępuj zgodnie z instrukcjami producenta zestawu).</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 25 μl roztworu przeciwciał wykrywających, uszczelnić płytkę, przykryć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut na shakerze.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 25 μl roztworu Streptawidyny-Fikoerytryny, uszczelnić płytkę, przykryć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut na shakerze.</li>
		<li>Umieść płytkę na magnetycznej podkładce do płyt. Pozostaw na 1 minutę, a następnie odessaj zawartość studzienki. Dodać 200 μl buforu do płukania na studzienkę. Pozostaw na 1 minutę, a następnie odessaj zawartość studzienki. Powtórz pranie jeszcze raz.</li>
		<li>Dodać 150 μl płynu osłonkowego do każdej studzienki i umieścić płytkę na wytrząsarce na 5 minut w temperaturze pokojowej w celu ponownego zawieszenia kulek przeciwciała.</li>
		<li>Natychmiast odczytaj płytkę za pomocą czytnika płytek do testów multipleksowych na bazie kulek i przeanalizuj stężenia cytokin za pomocą 5-parametrowego algorytmu dopasowania krzywej. Schematyczny schemat przepływu profilowania cytokin łzowych jest pokazany na Rysunek 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczyt tabliczki znamionowej (ustawienie przyrządu) i analiza danych:
	<ol>
		<li>Włącz czytnik multipleksów na bazie perełek i wstępnie ogrzej laser przez 30 minut.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do testowania multipleksowego opartego na koralikach. W zakładce "Automatyczna konserwacja" wybierz opcję "Kalibracja-weryfikacja". Wirować każdą fiolkę z odczynnikiem z kulkami kalibracyjnymi i weryfikacyjnymi przez 30 sekund. Umieść 5 kropli każdego odczynnika w wyznaczonych studzienkach. Napełnij wyznaczone zbiorniki wodą dejonizowaną i 70% etanolem.</li>
		<li>Tworzenie nowego protokołu
		<ol>
			<li>Otwórz stronę "Protokoły", a następnie zakładkę "Protokoły". Kliknij "Utwórz nowy protokół"; otworzy się zakładka "Ustawienia".</li>
			<li>W polu "Nazwa" wpisz nazwę protokołu.</li>
			<li>Wpisz opis w polu po prawej stronie pola "Nazwa".</li>
			<li>W polu "Wersja" wpisz wersję protokołu.</li>
			<li>W polu "Producent" wpisz informacje o producencie protokołu.</li>
			<li>Zdefiniuj ustawienia w sekcji "Ustawienia pozyskiwania" w następujący sposób. Ustaw "Objętość": 100 μL, "Limit czasu": 60 s; "Bramkowanie DD": od 8 000 do 15 000; "Zysk reportera": standardowy PMT; 'Rodzaj koralika': Koralik magnetyczny.</li>
			<li>Zdefiniuj ustawienia w sekcji 'Ustawienia analizy', wybierając 'Ilościowy' jako typ analizy. Ustaw "liczbę norm": 6; 'liczba urządzeń sterujących': 0; Zaznaczyć pole 'Średnia powtórzeń'; 
			Zaznacz pole "Analizuj wyniki podczas pobierania próbek".</li>
			<li>Kliknij "Dalej"; otworzy się zakładka 'Anality', kliknij na żądane anality (ID kulki) w ponumerowanej siatce analitu.</li>
			<li>Kliknij i wpisz odpowiednią nazwę analitu w kolumnie "Nazwa" po prawej stronie siatki analitu (nazwy analitów i odpowiadające im szczegóły dotyczące regionu kulki zostały wymienione w Tabeli 1).</li>
			<li>Kliknij i wpisz żądaną jednostkę miary (np. pg/ml) w polu "Jednostki" po lewej stronie przycisku "Zastosuj wszystko". Następnie kliknij "Zastosuj wszystko".</li>
			<li>Kliknij i wpisz żądaną liczbę kulek dla każdego analitu (np. 50) w polu "Liczba". Kliknij "Zastosuj wszystko".</li>
			<li>Kliknij "Dalej"; otworzy się zakładka Układ płyty. Zaznacz studzienki dla standardów i wybierz "2" w obszarze liczby powtórzeń i kliknij przycisk "S" Standard. Powtórz ten krok dla studzienek tła "B" i próbek "U".</li>
			<li>Kliknij "Zapisz".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tworzenie nowych standardów/partii kontrolnych
		<ol>
			<li>Otwórz stronę "Protokoły", a następnie zakładkę "Standardy i kontrole". Kliknij "Utwórz nowe partie standardowe/kontrolne".</li>
			<li>Otwórz pole "Wybierz protokół". Wybierz protokół, który został utworzony w kroku 1.5.3.</li>
			<li>Wprowadź odpowiednio informacje o normach: numer zestawu Std/Ctrl, nazwę zestawu Std/Ctrl, datę wygaśnięcia i producenta.</li>
			<li>Wprowadź wartość najwyższego standardu dla każdego analitu (tj. 10000 pg/ml). Wpisz 5 w rozcieńczeniu i kliknij "Zastosuj wszystko", aby automatycznie wygenerować oczekiwane stężenia dla pozostałych wzorców.</li>
			<li>Kliknij "Zapisz".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tworzenie nowej partii na podstawie istniejącego protokołu
		<ol>
			<li>Otwórz stronę "Partie" i kliknij "Utwórz nową kartę partii na podstawie istniejącego protokołu".</li>
			<li>Wpisz nazwę partii w polu "Nazwa partii" i wpisz opis partii w polu "Wprowadź opis opcjonalny".</li>
			<li>Kliknij wygenerowany wcześniej protokół (w kroku 1.5.3).</li>
			<li>Kliknij "Dalej"; następna zakładka, która się otworzy, to zakładka "Stds & Ctrls". Wyświetl szczegóły standardów testowych i wybierz "Dalej".</li>
			<li>Na karcie "Układ płyty" przypisz polecenia studni dla tej partii i kliknij "Zapisz", aby zapisać informacje o partii na liście "Oczekująca partia".</li>
			<li>Załaduj płytkę do czytnika płytek multipleksowych na bazie kulek, potrząsaj nią przez 5 minut i uruchom partię z listy oczekujących partii. Pozyskane dane zostaną zapisane w formacie pliku .csv.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Przekonwertuj plik .csv wygenerowany za pomocą oprogramowania do testowania multipleksowego opartego na koralikach do formatu pliku .rbx (plik danych wyników) za pomocą oprogramowania do konwersji rbx. Uruchom oprogramowanie do konwersji, wybierz plik .csv w obszarze wybierz plik(i) xPONENT i kliknij przycisk "generuj"; Plik .rbx zostanie zapisany w wybranym folderze wyjściowym.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie analityczne i otwórz plik .rbx.</li>
		<li>Zoptymalizuj krzywe standardowe za pomocą dopasowania krzywej 4PL/5PL.
		<ol>
			W <li>zakładce 'Krzywa standardowa' wybierz następujące opcje: 'Typ regresji': 'Logistic-5PL'; 'Transformacja osi': 'Log(x) - Liniowa(y)'; zaznacz pole 'Pokaż linie zakresu Conc Range'; zaznacz pole 'Pokaż nieznane próbki'; Zaznacz pole "Pokaż próbki kontrolne"; Zaznacz pole "Zastosuj do wszystkich analitów"; Zaznacz pole "Pokaż raport po optymalizacji".</li>
			<li>Kliknij przycisk "Optymalizuj", aby uzyskać automatyczną optymalizację.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oznacz przykładowe tożsamości na karcie "Wprowadź informacje o próbce".</li>
		<li>Uzyskaj zaobserwowane stężenia w zakładce "Tabela raportu" i kliknij "eksportuj tabelę raportu", aby wygenerować dane w pliku arkusza kalkulacyjnego do dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+The+Lacrimal+Gland+and+Its+Role+in+Dry+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye.</a> J Ophthalmol. 7542929, (2016).</li>
<li>von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tears+as+a+source+of+biomarkers+for+ocular+and+systemic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases.</a> Exp Eye Res. , 126-137 (2013).</li>
<li>Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+repertoire+of+tears+as+a+source+of+biomarkers%3A+beyond+ocular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).</li>
<li>Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tear+proteomics+and+peptidomics+in+ophthalmology%3A+Toward+the+translation+of+proteomic+biomarkers+into+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice.</a> J Proteomics. 150, 359-367 (2017).</li>
<li>Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+fluid+biomarkers+in+ocular+and+systemic+disease%3A+potential+use+for+predictive%2C+preventive+and+personalised+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+J%22%5BJournal%5D)">Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine.</a> EPMA J. 7, 15(2016).</li>
<li>Rentka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+array+and+multiplex+bead+analysis+of+tear+cytokines+in+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis.</a> Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).</li>
<li>Zhou, L., Beuerman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+analysis+in+ocular+surface+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Tear analysis in ocular surface diseases.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).</li>
<li>Jackson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+Interferon-Gamma+as+a+Biomarker+for+Evaporative+Dry+Eye+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).</li>
<li>Agrawal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+cytokines+profile+in+tear+film+of+dry+eye+disease+%28DED%29+patients+with+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection.</a> Cytokine. 88, 77-84 (2016).</li>
<li>Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+levels+of+interferon-gamma%2C+interleukin+%28IL%29+-2%2C+IL-4+and+IL-5+in+patients+with+vernal+keratoconjunctivitis%2C+atopic+keratoconjunctivitis+and+allergic+conjunctivitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis.</a> Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).</li>
<li>Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cytokines+in+human+tear+specimens+in+seasonal+and+chronic+allergic+eye+disease+and+in+conjunctival+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures.</a> Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).</li>
<li>Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+chemokines+in+immune-based+ocular+surface+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation.</a> Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).</li>
<li>Carreño, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+and+chemokine+tear+levels+in+patients+with+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis.</a> Acta Ophthalmol. , (2016).</li>
<li>Bjerrum, K. B., Prause, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+and+concentration+of+tear+proteins+studied+by+SDS+gel+electrophoresis.+Presentation+of+a+new+method+with+special+reference+to+dry+eye+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).</li>
<li>Saijyothi, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+electrophoretic+analysis+of+human+tears%3A+collection+method+in+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome.</a> Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).</li>
<li>Thakur, A., Willcox, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+and+lipid+inflammatory+mediator+profile+of+human+tears+during+contact+lens+associated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases.</a> Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).</li>
<li>Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+cytokine+profile+as+a+noninvasive+biomarker+of+inflammation+for+ocular+surface+diseases%3A+standard+operating+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).</li>
<li>Topcu-Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+tear+and+serum+inflammatory+cytokines+in+patients+with+rosacea+using+multiplex+bead+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Immunol+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology.</a> Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).</li>
<li>Hagan, S., Tomlinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+fluid+biomarker+profiling%3A+a+review+of+multiplex+bead+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis.</a> Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).</li>
<li>Choi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+inflammatory+profiles+in+pulmonary+tuberculosis+and+their+association+with+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response.</a> J Proteomics. 149, 23-30 (2016).</li>
<li>Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+cerebrospinal+fluid+biomarkers+using+microsphere-based+xMAP+multiplex+technology+for+early+detection+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease.</a> Methods. 56 (4), 484-493 (2012).</li>
<li>Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+the+quantification+of+cytokines+present+at+low+concentrations+in+small+human+mucosal+tissue+samples+using+Luminex+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays.</a> J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).</li>
<li>Inic-Kanada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ophthalmic+sponges+and+extraction+buffers+for+quantifying+cytokine+profiles+in+tears+using+Luminex+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology.</a> Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).</li>
<li>Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+multiplex+commercial+kits+to+quantify+cytokine+and+chemokine+responses+in+culture+supernatants+from+Plasmodium+falciparum+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations.</a> PLoS One. 8 (1), e52587(2013).</li>
<li>Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+multiplex+immunoassays%2C+used+for+determination+of+adiponectin%2C+resistin%2C+leptin%2C+and+ghrelin+from+human+blood+samples%2C+in+comparison+to+ELISA+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays.</a> Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+comparison+of+luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA%3A+determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).</li>
<li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus%2C+diphtheria%2C+and+Haemophilus+influenzae+Type+b%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).</li>
<li>Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+multiplexed+fluorescent+covalent+microsphere+immunoassay+and+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+measurement+of+human+immunoglobulin+G+antibodies+to+anthrax+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).</li>
<li>Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+xMAP+and+ELISA+assays+for+detecting+cerebrospinal+fluid+biomarkers+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).</li>
<li>Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+cytokine+response+to+multipurpose+solutions+for+contact+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses.</a> Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+definition+and+classification+of+dry+eye+disease%3A+report+of+the+Definition+and+Classification+Subcommittee+of+the+International+Dry+Eye+WorkShop+%282007%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+ocular+surface%22%5BJournal%5D)">The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007).</a> The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).</li>
<li>Stenger, S., Röllinghoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytokines+in+the+innate+immune+response+to+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens.</a> Ann Rheum Dis. 60, (2001).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+protein+array+analysis+of+the+tear+film+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Optom+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody protein array analysis of the tear film cytokines.</a> Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).</li>
<li>Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility%2C+reliability+and+reproducibility+of+immunoassay+multiplex+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits.</a> Methods. 61 (1), 23-29 (2013).</li>
<li>Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+tear+inflammatory+mediators%3A+A+comparison+between+the+microarray+and+Luminex+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods.</a> Mol Vis. 22, 177-188 (2016).</li>
<li>Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+analysis+of+closed%2C+open%2C+and+reflex+eye+tear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins.</a> Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).</li>
<li>Saijyothi, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+electrophoretic+analysis+of+human+tears%3A+collection+method+in+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome.</a> Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).</li>
<li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li>
<li>Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+luminex+assays+to+measure+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The use of luminex assays to measure cytokines.</a> J Invest Dermatol. 135 (4), e31(2015).</li>
<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).</li>
<li>Berthoud, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+kits+to+measure+cytokine+responses+to+Plasmodium+falciparum+by+multiplex+microsphere+suspension+array+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology.</a> Malar J. 10, 115(2011).</li>
<li>Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokine+profiling+of+tears+from+dry+eye+patients+by+means+of+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).</li>
<li>Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+array+characterization+of+inflammatory+mediators+in+allergic+and+normal+tears+in+the+open+and+closed+eye+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments.</a> Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Brak interesów finansowych lub konfliktu interesów.

Cytokiny to małe białka wydzielane przez komórki i silne modulatory immunologiczne regulujące odpowiedź immunologiczną. 32 Profile ekspresji różnych cytokin w próbkach łez są związane z różnymi stanami patologicznymi oka, a badania nad profilami cytokin pomagają zrozumieć mechanizmy patogenezy choroby, określić stan zdrowia oczu, nasilenie choroby, rozpoznanie i progresję. 2,5 Niższe stężenia białka i małe objętości próbek to główne wyzwan...

Łzy są wytwarzane przez gruczoł łzowy i dodatkowe gruczoły i pokrywają zewnętrzną powierzchnię oka. Film łzowy składa się z zewnętrznej warstwy lipidowej i wewnętrznej warstwy wodnej, która zawiera rozpuszczalne białka, mucyny i mucyny związane z błoną. Łzy zapobiegają inwazji drobnoustrojów, dostarczają składniki odżywcze i zapewniają nawilżenie powierzchni oka. Łzy działają jak interfejs między powietrzem a tkanką w celu transportu tlenu do rogówki. 1 Film łzowy składa się z białek, węglowodanów, lipidów i elektrolitów. Związek między białkami łez a chorobami oczu i ogólnoustrojowymi, takimi jak jaskra, zespół suchego oka, wiosenne zapalenie spojówek, cukrzyca, orbitopatia związana z tarczycą i rak został zidentyfikowany w kilku badaniach. 2,3,4 Próbki łez mogą być pobierane za pomocą probówek mikrokapilarnych lub pasków przepływowych (paski Schirmera). Dodatkowo test Schirmera jest standardowym zabiegiem wykonywanym w klinikach chirurgii rogówki i chirurgii refrakcyjnej, którego wyniki mogą być wykorzystane do analizy cytokin. Nieinwazyjne pobieranie próbek, dostępność próbki biologicznej oraz związek składu łez z różnymi stanami fizjologicznymi i patologicznymi sprawiają, że film łzowy jest potencjalnym źródłem biomarkerów wielu chorób oczu i ogólnoustrojowych. 4,5,6
Cytokiny łzowe odgrywają ważną rolę w badaniu zdrowia powierzchni oka i stanów zapalnych różnych chorób oczu. 7 Nieprawidłowe stężenia kilku cytokin w próbkach łez były związane z zespołem suchego oka, wiosennym zapaleniem rogówki i spojówki (VKC), atopowym zapaleniem rogówki i spojówki (AKC), sezonowym alergicznym zapaleniem spojówek i zapaleniem błony naczyniowej oka. 8,9,10,11,12,13 Białka łez mogą być analizowane tradycyjnymi metodami, takimi jak spektrometria mas, western blotting i testy immunoenzymatyczne (ELISA). 14,15 Jednak ograniczeniami tych metod są słaba czułość i większa objętość próbki wymagana do analizy wielu cytokin łzowych u każdego pacjenta. 16,17 Testy multipleksowe oparte na koralikach zostały opracowane do analizy wielu analitów w złożonych próbkach mieszanin i z powodzeniem stosowane na próbkach łez do analizy wielu cytokin w różnych chorobach. 6,18 Połączenie technik testu ELISA typu sandwich i cytometrii przepływowej sprawia, że testy te stają się bardziej czułe niż ELISA do oznaczania ilościowego wielu analitów w jednej próbce. 19 Ta metoda może być stosowana na różnych próbkach klinicznych i supernatantach z hodowli komórkowych i pomaga w badaniu odpowiedzi immunologicznych w kilku stanach patofizjologicznych. 20,21,22,23,24
Istnieje kilka badań porównujących testy multipleksowe oparte na koralikach z testem ELISA i wykazały korelację między tymi metodami. Loo i wsp. porównali test multipleksowy oparty na kulkach z konwencjonalnym testem ELISA w celu wykrycia adiponektyny, rezystyny, leptyny i greliny w próbkach ludzkiej surowicy lub osocza i stwierdzili silną korelację (r>0,9) między testami. 25 Dupont i wsp. stwierdzili silną korelację między testami multipleksowymi opartymi na koralikach a testem ELISA w wykrywaniu IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-Υ i TNF-α w krwi pełnej stymulowanej fitohemaglutyniną i lipopolisacharydem pobranej od kobiet w ciąży. 26 Pickering i wsp. stwierdzili kolejną silną korelację między testem multipleksowym opartym na kulkach a testem ELISA w wykrywaniu przeciwciał surowicy przeciwko polisacharydowi Haemophilus influenza typu b (r=0,96), toksoidom Clostridium tetani (r=0,96) i Corynebacterium diphtheriae (r=0,91). 27 Biagini i wsp. stwierdzili wysoką dodatnią korelację (r=0,852) między testem multipleksowym opartym na koralikach a testem ELISA w wykrywaniu Bacillus anthracis anty-PA IgG w próbkach surowicy. 28 Wang i wsp. stwierdzili korelację między testem multipleksowym opartym na koralikach a testem ELISA w wykrywaniu biomarkerów choroby Alzheimera: amyloidu-β 42 (r=0,77), całkowitego tau (r=0,94) i tau fosforylowanego na aminokwasie 181 (r=0,82) w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego. 29 Badania te wykazały możliwość zastosowania testów multipleksowych opartych na perełkach na różnych próbkach klinicznych, mniejsze wymagania dotyczące objętości próbki oraz korelację ze standardowym ELISA, co czyni testy multipleksowe oparte na koralikach obiecującą alternatywą dla tradycyjnych metod ELISA do wykrywania wielu analitów w różnych typach próbek w różnych fenotypach choroby. Tutaj opisujemy znormalizowany protokół testu multipleksowego opartego na kulkach do profilowania cytokin dla 41 analitów w próbkach łez pobranych od zdrowych osób przy użyciu pasków Schirmera.

<table><tbody><tr><td>Panel z kulkami magnetycznymi cytokiny / chemokiny Milliplex MAP -1 zestaw</td><td>Merck, USA</td><td>HCYTOMAG-60K-41</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd Flexmap 3D luminex&nbsp;</td><td>Luminex Corp, Austin, Teksas, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie xPonant&nbsp;</td><td>Luminex Corp, Austin, Teksas, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie RBXGenerator</td><td>BIO-RAD, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex Manager 6.1</td><td>BIO-RAD, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do płytek</td><td>Corning, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TECAN Myjka do mikropłytek</td><td>Tecan, Szwajcaria</td><td>HydroSpeed</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries inc, Stany Zjednoczone</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Mettler Toledo, CA, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Axygen, Stany Zjednoczone</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Pasek testowy przepływu łez Schirmera</td><td>Pielęgnacja i leczenie oczu, USA</td><td>101657</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kalibracji 3D Flexmap</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-028</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do weryfikacji 3D</td><td>Flexmap Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-029</td><td></td></tr><tr>Fotel <td></td><td></td><td></td><td>do badania wzroku</td></tr></tbody></table>

test multipleksowy oparty na kulkach do analizy profili cytokin łzowych

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Film łzowy to złożona mieszanina lipidów, białek i minerałów, która pokrywa zewnętrzną powierzchnię oka, zapewniając w ten sposób nawilżenie, odżywienie i ochronę leżących pod spodem komórek. Analiza łez jest nowym obszarem identyfikacji biomarkerów do przewidywania, diagnozowania i rokowania różnych chorób oczu. Łzy są łatwo dostępne, a ich zbieranie jest nieinwazyjne. W związku z tym coraz większe znaczenie zyskują technologie identyfikacji wielu analitów we łzach w celu zbadania zmian w składzie białek lub metabolitów oraz ich związku ze stanami patologicznymi. Cytokiny łzowe są idealnymi biomarkerami do badania zdrowia powierzchni oka, a także pomagają w zrozumieniu mechanizmów różnych zaburzeń powierzchni oka, takich jak zespół suchego oka i wiosenne zapalenie spojówek. Testy multipleksowe oparte na kulkach mają zdolność wykrywania wielu analitów w niewielkiej ilości próbki z wyższą czułością. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany protokół pobierania, ekstrakcji i analizy profilowania cytokin z łez za pomocą testu multipleksowego opartego na kulkach.

Próbki łez pobrano z 8 oczu 4 zdrowych ochotników przy użyciu pasków do pobierania łez, a poziomy cytokin analizowano zgodnie z wyżej opisanym protokołem. Wszyscy badani byli mężczyznami w wieku odpowiednio 36, 42, 44 i 52 lat. Stan zdrowia powierzchni oka oraz obecność zespołu suchego oka oceniono za pomocą testów klinicznych (czas zerwania filmu łzowego, test Schirmera, barwienie rogówki, barwienie spojówki, badanie powiek i gruczołów Meiboma, oznaki łzowe rogówki oraz objawy i symptomy...

Analiza cytokin filmu łzowego pomaga w badaniu różnych chorób oczu. Testy multipleksowe oparte na kulkach są proste i czułe oraz umożliwiają testowanie wielu celów w próbkach o małych objętościach. W tym miejscu opisujemy protokół profilowania cytokin filmu łzowego za pomocą testu multipleksowego opartego na kulkach.

Test multipleksowy oparty na kulkach do analizy profili cytokin łzowych

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest badanie profili cytokin w próbkach łez ludzkich pobranych za pomocą pasków Schirmera przy użyciu koralikowego testu multipleksowego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu okulistyki, takie jak rola cytokin w różnych chorobach oczu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego badania wielu analitów w mniejszych objętościach próbek.Procedurę zaprezentuje Praveen Balne, stażysta podoktorski z mojego laboratorium. Po pobraniu łez od badanego zgodnie z protokołem tekstowym, odetnij pasek do zbierania łez do długości 0,5 centymetra i umieść go w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 30 µL buforu do analizy i inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie odwiruj probówkę z prędkością 14 000 ×g przez jedną minutę. Przenieś nadsącz do drugiej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, a pasek wyrzuć. Następnie umieść probówkę z próbką na lodzie i niezwłocznie wykorzystaj eluat z łez do profilowania cytokin.Aby przeprowadzić koralikowy test multipleksowy, należy doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej i wymieszać je w wirówce vortex przez 5 do 10 sekund. Jeśli eluowane próbki łez były przechowywane w temperaturze -80 °C przed analizą, zamrożone ekstrakty z łez należy rozmrozić na lodzie, a następnie odwirować próbki z prędkością 1 000 ×g przez pięć minut. Przygotować arkusz analizy w konfiguracji pionowej dla roboczych standardów cytokin ludzkich QC-1, QC-2 oraz próbek.Do każdego dołka płytki należy dodać 200 µL 1X buforu do płukania, a następnie szczelnie zamknąć ją za pomocą uszczelniacza do płytek. Następnie płytkę inkubuje się na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Potem należy odlać 1X bufor do płukania poprzez odwrócenie płytki i kilka razy opukać ją o ręcznik chłonny, aby usunąć wszelkie pozostałości buforu do płukania z dołków.Następnie do odpowiednich dołków należy dodać po 25 µL każdego roboczego standardu cytokin ludzkich QC-1, QC-2, próbę ślepą zawierającą wyłącznie bufor do analizy oraz próbki. Do każdego dołka należy dodać 25 µL buforu do analizy. Następnie do dołków dodaje się 25 µL roztworu 1X koktajlu kulek z przeciwciałami.Ponieważ roztwór kulek z przeciwciałami jest światłoczuły, należy uszczelnić płytkę i przykryć ją folią aluminiową oraz pokrywą do płytek, aby chronić ją przed światłem podczas analizy. Inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsius na wytrząsarce przez noc. Następnego dnia umieścić płytkę w uchwycie automatycznej myjki do płytek magnetycznych i pozostawić ją na jedną minutę, aby kuleczki magnetyczne osiadły na dnie dołka.Odssać zawartość studzienek i dodać 200 µL buforu do mycia na każdą studzienkę, korzystając z automatycznej magnetycznej myjki do płytek. Pozostawić płytkę na jedną minutę, a następnie odessać zawartość studzienek w ten sam sposób i powtórzyć mycie jeszcze raz. Do każdej studzienki dodać 25 µL roztworu przeciwciała detekcyjnego.Uszczel płytkę. Przykryj ją folią aluminiową oraz pokrywą i inkubuj w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 60 minut. Następnie dodaj 25 µL roztworu streptawidyny znakowanej fykoerytryną do każdej studzienki, a po uszczelnieniu i przykryciu płytki inkubuj ją w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 30 minut.Po inkubacji należy umieścić płytkę w magnetycznej myjce do płytek i pozostawić ją na jedną minutę. Następnie należy odessać zawartość studni i dodać 200 µL buforu do mycia do każdej studni. Pozostawić na jedną minutę, a następnie odessać zawartość studni i powtórzyć proces mycia jeszcze raz.Do każdej studni należy dodać 150 µL płynu osłonowego. Następnie płytkę należy umieścić na wytrząsarce na pięć minut w temperaturze pokojowej, aby resuspendować kuleczki z przeciwciałami przed przystąpieniem do odczytu płytki i analizy stężeń cytokin. Aby odczytać płytkę testową zgodnie z protokołem tekstowym, należy otworzyć stronę partii i kliknąć kartę utworzenia nowej partii na podstawie istniejącego protokołu.W polu nazwy partii wpisz nazwę partii, a w polu opcjonalnego opisu wpisz opis partii. Kliknij wcześniej wygenerowany protokół, a następnie kliknij dalej. Następnie otworzy się karta standardów i kontroli.Przejrzyj szczegóły standardów analizy i wybierz opcję „dalej”. W zakładce układu płytki przypisz polecenia dla danej partii i kliknij „zapisz”, aby dodać informacje o partii do listy partii oczekujących. Włóż płytkę do czytnika płytek do analiz wieloparametrowych opartych na koralikach i uruchom partię z listy partii oczekujących.Uruchom oprogramowanie do konwersji RBX i w sekcji wyboru plików z wykładnikami zaznacz plik csv wygenerowany przez oprogramowanie do analizy testów multipleksowych opartych na koralikach. Następnie kliknij przycisk generuj. Plik rbx zostanie zapisany w wybranym folderze wyjściowym.Następnie uruchom oprogramowanie analityczne i otwórz plik rbx. W zależności od dopasowania krzywej 4PL-5PL zoptymalizuj krzywe wzorcowe. Aby zoptymalizować krzywe wzorcowe, w zakładce krzywej wzorcowej wybierz następujące opcje: typ regresji – logistyczna 5PL oraz transformacja – log X, linear Y. Następnie zaznacz następujące pola: pokaż linie zakresu stężeń, pokaż nieznane próbki, pokaż próbki kontrolne, zastosuj do wszystkich analitów oraz pokaż raport po optymalizacji.Kliknij przycisk optymalizuj, aby przeprowadzić automatyczną optymalizację. W zakładce wprowadź informacje o próbkach określ tożsamość próbek. Na koniec odczytaj zaobserwowane stężenia w zakładce tabela raportu i kliknij eksportuj tabelę raportu, aby wygenerować dane w pliku arkusza kalkulacyjnego do dalszej analizy.Próbki łez pobrano z ośmiu oczu czterech zdrowych mężczyzn w wieku od 36 do 52 lat. Z 41 cytokin analizowanych za pomocą wielokanałowego testu koralikowego (bead-based multiplex assay), 31 wykryto we wszystkich próbkach łez. Na przykład IL-17A, MIP-1b i TNFa wykryto w siedmiu oczach czterech badanych, a IL-4 wykryto w sześciu oczach czterech badanych.Dodatkowo, interferon gamma wykryto w sześciu gałkach ocznych u trzech badanych. Interleukinę-1a wykryto w pięciu gałkach ocznych u trzech badanych. Eotaksynę oraz interleukinę-9 wykryto w trzech gałkach ocznych u dwóch badanych.Interleukina-3 została wykryta w jednym oku, natomiast MIP-1a nie stwierdzono w żadnej z próbek. Średnie stężenia z odchyleniem standardowym dla 41 wykrytych cytokin przedstawiono na tym wykresie rozrzutu. Interleukina-1ra wykazywała wysoką ekspresję we wszystkich próbkach.Cytokiny IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, fraktalkina, interleukina-a, EGF, PDGF-BB, VEGF oraz G-CSF były również wykazane na wysokim poziomie rzędu nanogramów na mililitr, natomiast pozostałe cytokiny występowały na poziomie pikogramów na mililitr. Jak widać tutaj, najniższe zmierzone stężenie cytokiny w łzach odnotowano dla TNF-a, ze średnią wraz z odchyleniem standardowym wynoszącą 27,25 ± 19,97 pg/ml. Wśród 31 cytokin wykrytych we wszystkich próbkach żadna z nich nie wykazała statystycznie istotnej różnicy w stężeniu między prawym a lewym okiem w teście T.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura zajmuje 1,5 dnia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania wielotorowego analizy multiplex opartej na kuleczkach w celu profilowania cytokin w łzach.

bead-based-multiplex-assay-for-analysis-of-tear-cytokine-profiles

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film ilustruje test multipleksowy oparty na koralikach do analizy cytokin w ludzkich łzach. Metoda ta pozwala na jednoczesną analizę wielu cytokin z jednej próbki, zapewniając zwiększoną czułość do badania odpowiedzi immunologicznych w różnych stanach patofizjologicznych.

Test oparty na kulkach multipleksowych do analizy cytokin w próbkach ludzkich łez

Ten film demonstruje test immunologiczny oparty na multipleksie do ilościowego oznaczania wielu celów cytokin w próbce. Mieszanina odrębnych mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin służy do wiązania cytokin obecnych w próbce. Reporterki znakowane streptawidyną są unieruchamiane na związanych cytokinach za pomocą biotynylowanych przeciwciał wykrywających. Cytometria przepływowa identyfikuje związane cytokiny na podstawie unikalnych rozmiarów i intensywności wewnętrznej...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do ilościowego określania wielu celów cytokin

Opisujemy procedurę profilowania białek śliny za pomocą multipleksowanych układów przeciwciał opartych na mikrosferach. Przeciwciała monoklonalne zostały kowalencyjnie połączone z mikrosferami polimerowymi o wielkości 4,5 μm kodowanymi barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu chemii karmodiimidu. Zmodyfikowane mikrosfery zdeponowano w mikrostudzienkach światłowodowych w celu zmierzenia poziomu białka w ślinie za pomocą fluorescencyjnych testów immunologicznych typu sandwich.

Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

Ten protokół opisuje kwantyfikację wielu celów cytokin jednocześnie w supernatantach hodowli tkankowej pobranych ze stymulowanych mysich splenocytów przy użyciu platformy testów immunologicznych opartych na multipleksie i cytometru przepływowego.

Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Ten protokół opisuje metodę pobierania próbek łez za pomocą pasków Schirmera oraz zintegrowany ilościowy przepływ pracy do odkrywania nieinwazyjnych biomarkerów białka łez. Proces przygotowania próbki do wychwytywania zawiesiny umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie próbki do rozdarcia oraz analizę spektrometryczną mas, co skutkuje wyższą wydajnością odzyskiwania peptydów i identyfikacją białek niż standardowe procedury w roztworze.

Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

Użycie referencyjnych odczynników do testów uwalniania cytokin pozwala na bardziej powtarzalne i standaryzowane profile bezpieczeństwa in vitro immunoterapeutycznych przeciwciał monoklonalnych. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób testy uwalniania cytokin mogą być stosowane wraz z referencyjnym panelem odczynników do przewidywania bezpieczeństwa niektórych terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych.

Stosowanie odczynników referencyjnych w celu potwierdzenia odporności testów uwalniania cytokin w celu przewidywania bezpieczeństwa przeciwciał monoklonalnych

W tym artykule opisano protokół pobierania i wykrywania miR-15a z łez jako nowego narzędzia diagnostycznego retinopatii cukrzycowej.

MiR-15a pochodzący z łez egzosomowy jako nowe narzędzie diagnostyczne retinopatii cukrzycowej

Identyfikacja biomarkerów RNA i białek z łez w modelach mysich jest bardzo obiecująca dla wczesnej diagnostyki różnych chorób. Manuskrypt ten zawiera kompleksowy protokół optymalizacji skuteczności i efektywności izolacji mRNA i białek z łez myszy.

Optymalizacja zbierania łez u myszy do analizy mRNA i białek

Protokół ten opisuje unikalny protokół kliniczny pobierania próbek ludzkiego płynu łezowego za pomocą czerwonych nici fenolowych oraz workflow oparty na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej (LC-MS/MS) w celu odkrycia profilu lipidomicznego łz. Prosta metoda bifazowej separacji metyloter-butyloeteru (MTBE)/metanolu umożliwia szybką ekstrakcję lipidów łzowych z wysoką odbudową i odkryciem biomarkerów łz.

Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów

Ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę enzymatycznego testu immunopochłaniania (ELISA) do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu i testosteronu w ludzkiej cieczy łzowej pobranej za pomocą mikrokapillark. Takie podejście umożliwia minimalnie inwazyjne pomiary stężenia hormonów w łzach.

Wykrywanie hormonów płciowych w błonie łzowej człowieka za pomocą enzymatycznych testów immunopochłaniających

Poznaj metodę testu multipleksowego opartego na kulkach do analizy profili cytokin łzowych u ludzi. Technika ta umożliwia badanie wielu analitów przy minimalnej objętości próbki, co jest kluczowe w okulistyce.

Test multipleksowy oparty na kulkach do analizy profili cytokin łzowych

Przeglądaj więcej filmów