Test multipleksowy oparty na kulkach do analizy profili cytokin łzowych
October 13th, 2017
Analiza cytokin filmu łzowego pomaga w badaniu różnych chorób oczu. Testy multipleksowe oparte na kulkach są proste i czułe oraz umożliwiają testowanie wielu celów w próbkach o małych objętościach. W tym miejscu opisujemy protokół profilowania cytokin filmu łzowego za pomocą testu multipleksowego opartego na kulkach.
Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie profili cytokin w próbkach łez ludzkich pobranych przez Schirmer Strips przy użyciu testu multipleksowego opartego na kulkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak rola cytokin w różnych chorobach oczu. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do badania wielu analitów w mniejszych objętościach próbek.
Procedurę zademonstruje Praveen Balne, post-doc z mojego laboratorium. Po zebraniu łez od osoby badanej zgodnie z protokołem tekstowym, przytnij pasek do łez na długość 0,5 centymetra i umieść go w sterylnej 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki. Dodać 30 mikrolitrów buforu do oznaczania i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Następnie odwirować probówkę z ciśnieniem 14 000 g przez jedną minutę. Przenieść supernatant do innej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki i wyrzucić pasek. Następnie umieść probówkę zawierającą próbkę na lodzie i natychmiast użyj wymytej próbki łez do profilowania cytokin.
Aby przeprowadzić test multipleksowy na bazie kulek, doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej i wiruj je przez pięć do 10 sekund. Jeśli eluowane próbki łez były przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed badaniem, rozmrozić zamrożone ekstrakty ze łez na lodzie i odwirować próbki w temperaturze 1000 razy g przez pięć minut. Przygotuj arkusz testowy w konfiguracji pionowej do pracy z ludzkimi wzorcami cytokin QC-1, QC-2 i próbkami.
Dodaj 200 mikrolitrów buforu do płukania 1X do każdego dołka płytki i uszczelnij ją zgrzewarką do płyt. Następnie inkubować płytkę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie zdekantuj bufor myjący 1X, odwracając płytkę i kilkakrotnie postukaj w ręcznik chłonny, aby usunąć resztki buforu do płukania ze studzienek.
Następnie dodaj 25 mikrolitrów każdego działającego wzorca cytokin ludzkich QC-1, QC-2, ślepą próbę z samym buforem testowym i próbki do odpowiednich studzienek. Dodaj 25 mikrolitrów buforu testowego do każdej studzienki. Następnie do studzienek dodaj 25 mikrolitrów roztworu koktajlu kulek przeciwciał 1X.
Ponieważ roztwór kulki przeciwciała jest wrażliwy na światło, uszczelnij płytkę i przykryj ją folią aluminiową i pokrywą płytki, aby chronić przed światłem podczas testu. Inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce przez noc. Następnego dnia umieść płytkę na stojaku na talerze automatycznej magnetycznej myjki do płyt i pozostaw ją na minutę, aby osadzała się koraliki magnetyczne na dnie studzienki.
Odessać zawartość studzienki i dodać 200 mikrolitrów buforu płuczącego na studzienkę za pomocą automatycznej magnetycznej myjki do płyt. Pozostaw płytkę na minutę, a następnie odessaj zawartość studzienki jak poprzednio i powtórz mycie jeszcze raz. Dodaj 25 mikrolitrów roztworu przeciwciał detekcyjnych do każdej studzienki.
Uszczelnij płytę. Przykryj folią aluminiową i przykryj talerzem i inkubuj w temperaturze pokojowej na shakerze przez 60 minut. Następnie dodaj 25 mikrolitrów roztworu fikoerytryny Streptawidyny do każdej studzienki i po uszczelnieniu i przykryciu płytki inkubuj ją w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 30 minut.
Po inkubacji umieścić płytkę na magnetycznej podkładce do płytek i pozostawić na jedną minutę. Następnie odessać zawartość studzienki i dodać 200 mikrolitrów buforu do płukania na studzienkę. Pozostaw na minutę, a następnie odessaj zawartość studzienki przed ponownym powtórzeniem prania.
Dodaj 150 mikrolitrów płynu osłonkowego do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę na wytrząsarce na pięć minut w temperaturze pokojowej, aby ponownie zawiesić kulki przeciwciał przed przystąpieniem do odczytu płytki i analizy stężeń cytokin. Aby odczytać tabliczkę testową zgodnie z protokołem tekstowym, otwórz stronę partii i kliknij kartę Utwórz nową partię na podstawie istniejącego protokołu.
W polu Nazwa partii wpisz nazwę partii, a następnie wpisz opis partii w polu Wprowadź opcjonalny opis. Kliknij na wcześniej wygenerowany protokół, a następnie kliknij dalej. Następna karta, która zostanie otwarta, to karta Standardy i kontrolki.
Wyświetl szczegółowe informacje o wzorcach testowych i wybierz pozycję Dalej. Na karcie układu blachy przypisz polecenia studzienek dla partii i kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać informacje o partii na liście oczekujących partii. Załaduj płytkę do czytnika płytek do testów multipleksowych na bazie kulek i uruchom partię z listy oczekujących partii.
Uruchom oprogramowanie do konwersji RBX i w obszarze wybierz pliki wykładników wybierz plik csv wygenerowany z oprogramowania do testowania multipleksowego opartego na koralikach. Następnie kliknij przycisk generuj. Plik rbx zostanie zapisany w wybranym folderze wyjściowym.
Teraz uruchom oprogramowanie analityczne i otwórz plik rbx. Następnie, korzystając z dopasowania krzywej 4PL-5PL, zoptymalizuj krzywe standardowe. Aby zoptymalizować krzywe standardowe, wybierz następujące opcje na karcie krzywej standardowej, typ regresji, logistyka 5PL i uzyskaj dostęp do dziennika transformacji X, liniowego Y. Następnie zaznacz następujące pola, pokaż linie zakresu stężeń, pokaż nieznane próbki, pokaż próbki kontrolne, zastosuj dla wszystkich analitów i pokaż raport po optymalizacji.
Kliknij przycisk optymalizacji, aby uzyskać automatyczną optymalizację. Na karcie Wprowadzanie przykładowych informacji oznacz przykładowe tożsamości. Na koniec uzyskaj zaobserwowane stężenia w zakładce tabela raportu i kliknij eksport tabeli raportu, aby wygenerować dane w pliku arkusza kalkulacyjnego do dalszej analizy.
Próbki łez pobrano z ośmiorga oczu czterech zdrowych mężczyzn w wieku od 36 do 52 lat. Spośród 41 cytokin analizowanych za pomocą testu multipleksowego opartego na koralikach, 31 wykryto we wszystkich próbkach łez. Na przykład IL-17A, MIP-1b i TNFa wykryto w siedmiu oczach czterech osób, a IL-4 wykryto w sześciu oczach czterech osób.
Ponadto interferon gamma wykryto w sześciu oczach trzech osób. Interleukinę-1a wykryto w pięciu oczach trzech osób. Eotaksynę i interleukinę-9 wykryto w trzech oczach dwóch osób.
Interleukinę-3 wykryto w jednym oku, a MIP-1a nie wykryto w żadnej z próbek. Średnie plus minus odchylenia standardowego stężeń 41 wykrytych cytokin przedstawiono na tym wykresie punktowym. Interleukina-1ra wykazywała wysoką ekspresję we wszystkich próbkach.
Cytokiny IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, fraktykina, interleukina-a, EGF, PDGF-BB, VEGF i G-CSF były również silnie eksprymowane na poziomie nanogramów na mililitr, a pozostałe cytokiny ulegały ekspresji na poziomie pikogramów na mililitr. Jak widać tutaj, najniższym zmierzonym stężeniem cytokin łzowych był TNF-a ze średnim plus minus odchyleniem standardowym wynoszącym 27,25 plus minus 19,97 pikogramów na mililitr. Na 31 cytokin, które wykryto we wszystkich próbkach, żadna nie wykazała statystycznie istotnej różnicy w stężeniu między prawym i lewym okiem za pomocą testu T.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 1-1/2 dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test multipleksowy na bazie kulek do profilowania cytokin łzowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje analizę profili cytokin w próbkach łez ludzkich za pomocą wielokrotnego testu opartego na kulkach. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania roli cytokin w chorobach oczu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Oftalmologia
- Profilowanie cytokin
- Wielokrotne testy oparte na kulkach
Tło
- Cytokiny w błonie łzowej są ważne dla zrozumienia chorób oczu.
- Wielokrotne testy oparte na kulkach pozwalają na wrażliwe badanie wielu celowań.
- Można wykorzystać małe objętości próbek do analizy.
- Ta technika może zapewnić wgląd w procesy zapalne w oku.
Cel badania
- Profilowanie cytokin w ludzkich próbkach łez.
- Badanie roli cytokin w chorobach oczu.
- Przedstawienie metody, która wymaga minimalnej objętości próbki.
Stosowane metody
- Zbieranie próbek łez za pomocą pasków Schirmera.
- Przygotowanie próbek w sterylnych mikroprobówkach.
- Inkubacja z buforem testowym.
- Wykorzystanie wielokrotnych testów opartych na kulkach do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna analiza profili cytokin w próbkach łez.
- Wykazanie efektywności metody przy użyciu małych objętości próbek.
- Wgląd w role cytokin w zdrowiu i chorobach oczu.
- Potencjalne zastosowania w klinicznej oftalmologii.
Wnioski
- Wielokrotny test oparty na kulkach jest skuteczny w analizie cytokin w błonie łzowej.
- Ta metoda może poprawić zrozumienie chorób oczu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole dla dalszych badań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Bead-based multiplex assays enable sensitive, multiplexed cytokine profiling from minimally invasive tear samples, supporting biomarker discovery in ocular surface disorders. This approach provides quantitative, reproducible data for target validation and mechanistic de-risking in ophthalmology R&D. The method’s compatibility with low sample volumes facilitates early-stage screening and translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cytokine networks to clarify inflammatory pathways in ocular disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting multiple analytes in limited sample volumes from Schirmer strip collections.
- Predictive Value: Generates concentration data for cytokines like IL-1ra, TNF-a, and IFN-gamma to inform target prioritization and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized cytokine profiles using QC-1 and QC-2 human cytokine controls for assay reproducibility.
- Operational Value: Enables high-sensitivity detection of 31 cytokines in tear extracts with picogram-to-nanogram per milliliter dynamic range.
- Scalability: Compatible with automated magnetic plate washing and RBX conversion for batch processing and data export.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links tear cytokine expression to ocular surface health, supporting translational biomarker alignment in dry eye and vernal conjunctivitis models.
- Operational Value: Provides disease-relevant system data from human tear samples to inform preclinical continuity and risk-adjusted advancement decisions.
- Predictive Confidence: Enables comparison of cytokine levels across conditions using 4PL-5PL curve fitting and statistical analysis (e.g., T-test) to assess significance.
Pipeline & Workflow Integration
The bead-based multiplex assay integrates into the ophthalmology discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, enabling cytokine profiling as a reusable analytics platform.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytokine roles in ocular inflammation via multiplexed detection of 41 cytokines from tear samples.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized wash, incubation, and detection steps using antibody bead cocktails and streptavidin-phycoerythrin.
- Analytics: Generates quantitative cytokine concentrations via optimized standard curves and exportable report tables for cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects discovery-phase cytokine profiling to preclinical relevance through detection of biomarkers like IP-10, VEGF, and G-CSF in human tears.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol for tear sample preparation and multiplex analysis applicable across ocular disease indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through multiplexed cytokine detection and reduction of mechanistic ambiguity in ocular surface disorders.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and sensitivity enabled by bead-based multiplex technology and controlled assay conditions.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying cytokine expression patterns linked to pathological mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on cytokine profile data from accessible, non-invasive samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay handling, cytokine biology, and multiplex data analysis.
- Dependent on bead-based multiplex plate readers, magnetic washers, and RBX conversion software.
- Necessitates standardization of sample collection (Schirmer strips), elution, and storage (−80°C) across sites.
- Involves adaptation considerations for different tear sample volumes and cytokine panels.
- Limited by the need for light protection during antibody bead incubation and strict adherence to wash and incubation times.
