Name: Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj metodę dożylnej transfekcji wirusa AAV u szczurów w celu szerokiej ekspresji genów w ośrodkowym układzie nerwowym. Technika ta umożliwia badanie chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx, oraz darowiznę na cele charytatywne na badania nad ALS od Thomasa Lawsona, za co jesteśmy wdzięczni. Dziękujemy Elysse Orchard i Donnie Burney za rady i szkolenia. Projekt JAS był wspierany przez Fundację Lied i grant GM103418 National Institutes of Health.

Wszystkie procedury były zgodne z odpowiednimi wytycznymi NIH. Wszystkie procedury były zgodne z protokołami na zwierzętach, które zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w Centrum Nauk o Zdrowiu LSU w Shreveport. Do tej procedury wykorzystano samice szczurów Sprague-Dawley w wieku 6 tygodni.
1. Określ potrzebne dawki/objętości wektora
<ol>
	<li>Zważyć szczury, które mają zostać wstrzyknięte, i określić ilość wektora wirusowego potrzebną dla każdego zwierzęcia na podstawie miana (stężenia) preparatu wektora. Użyj dawek wektorowych, które wcześniej okazały się skuteczne w celu uzyskania efektywnej ekspresji w OUN szczura (patrz Jackson et al.6). 
	UWAGA: W przypadku AAV9 TDP-43 lub AAV9 GFP typowa dawka wynosi od 3 x 1013 do 1 x10 14 genomów wektorowych/kg. Młode dorosłe szczury w wieku 6 tygodni ważą około 150 g.</li>
	<li>Stosować równoważne dawki na kg u wszystkich zwierząt w celu systematycznych porównań. Upewnij się, że objętość nie przekracza standardowej zalecanej objętości wstrzyknięć (250 - 500 μl dla szczura o wadze 250 g). Typowa objętość wstrzyknięcia wynosi 200 μl dla młodego dorosłego szczura.</li>
</ol>
2. Przygotuj stanowisko pracy
<ol>
	<li>Zbierz wszystkie potrzebne materiały: jeden kwadrat folii parafinowej (około 5 x 5 cm) na zwierzę, jedną wacik nasączony alkoholem na zwierzę, gaziki (2-3 na zwierzę), końcówki do pipet i mikropipetę.</li>
	<li>Przygotuj powierzchnię roboczą, czyszcząc powierzchnię 70% etanolem. Umieść poduszkę grzewczą przy temperaturze ustawionej na niską (~37 °C). Umieść podkładkę stołową na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Przygotować znieczulenie gazowe (izofluran). Zapewnij odpowiednie znieczulenie tlenowe i gazowe do zabiegu. Wyczyść komorę indukcyjną i maskę anestezjologiczną 70% etanolem i umieść maskę anestezjologiczną na podkładce stołowej.</li>
</ol>
3. Przygotuj wektor
<ol>
	<li>Rozmrozić wektor w temperaturze pokojowej i oznaczyć jedną sterylną probówkę do mikrowirówek dla każdego zwierzęcia.</li>
	<li>Odpipetować objętość AAV oznaczoną w kroku 1.1 do odpowiedniej probówki i doprowadzić objętość do żądanej objętości iniekcji (w tym przypadku 200 μl) za pomocą roztworu Ringera z mleczanami lub soli fizjologicznej.</li>
	<li>Pulsacyjnie wirować próbkę przez 1 - 2 s, a następnie wirować pulsacyjnie przez 5 sekund, aby sprowadzić próbkę na dno probówki.</li>
	<li>Odpipetować całkowitą objętość wstrzyknięcia dla szczura z probówki na kwadrat filmu parafinowego.</li>
	<li>Umieść igłę o rozmiarze 30 G na strzykawce o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Umieść igłę skosem skierowanym w dół w wektor na folii parafinowej. Odciągnąć tłok strzykawki, aż cały wirus znajdzie się w igle i strzykawce. Należy uważać, aby nie wciągać pęcherzyków powietrza do igły, co staje się łatwiejsze wraz z praktyką.</li>
</ol>
4. Przygotuj szczura
<ol>
	<li>Zwiększ poziom tlenu do 1 l/min i ustaw znieczulenie izofluranem na 5%. Upewnij się, że znieczulenie gazowe przepływa do komory indukcyjnej, sprawdzając wszystkie węże połączeniowe i orientację kurka.</li>
	<li>Umieść szczura w komorze indukcyjnej znieczulenia gazowego na około 3 minuty, aż szczur przestanie reagować.</li>
	<li>Zapewnij odpowiednią głębokość znieczulenia, ściskając palec u nogi. Po uszczypnięciu palca nie powinno być żadnych ruchów w stopie lub nodze.</li>
	<li>Zmniejszyć znieczulenie izofluranem do 2% w celu podtrzymania znieczulenia i wyregulować kran tak, aby znieczulenie płynęło do maski anestezjologicznej.</li>
	<li>Umieść nos szczura w masce anestezjologicznej i ustaw szczura tak, aby leżał na boku.</li>
	<li>Zidentyfikuj boczną żyłę ogonową. 
	UWAGA: Boczne żyły ogonowe leżą na godzinie około 10 i 2, a grzbietowy wierzchołek ogona na godzinie 12. Gdy szczur leży na boku, boczna żyła ogonowa powinna być skierowana do góry.</li>
	<li>Przetrzeć miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się w dwóch trzecich długości ogona.</li>
</ol>
5. Wstrzyknięcie wektora
<ol>
	<li>Mocno przytrzymać ogon nieco powyżej obszaru wstrzyknięcia jednym palcem bezpośrednio nad boczną żyłą ogonową, co spowoduje rozszerzenie żyły.</li>
	<li>Ze skosem skierowanym do góry, wyrównaj igłę z widoczną żyłą ogonową w tym samym kierunku.</li>
	<li>Przebij skórę nad żyłą ogonową, zachowując szczególną ostrożność, aby druga ręka nie trzymała ogona i nie naciskała na żyłę ogonową.</li>
	<li>Zwolnij ciśnienie z żyły ogonowej, aby umożliwić normalny przepływ krwi.</li>
	<li>Wprowadzić igłę do żyły. Aby upewnić się, że igła przebiła żyłę ogonową, należy lekko pociągnąć tłok do tyłu. Jeśli igła znajduje się w żyle, krew będzie płynąć do igły.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby zmienić położenie igły. Następnie, aby ustabilizować igłę, przesunąć rękę powyżej miejsca wstrzyknięcia poniżej miejsca wstrzyknięcia i przytrzymać koniec strzykawki przy ogonie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć wektor do ogona (około 20 μL/s). 
	UWAGA: Żyła może stracić kolor, gdy wektor przez nią przepływa. Oznaki, że roztwór został wstrzyknięty poza żyłę, obejmują pęcherzyki, blednięcie skóry lub opór podczas wstrzykiwania wektora. Przy odrobinie wprawy można zminimalizować ekspozycję pozanaczyniową.</li>
	<li>Po podaniu wektora należy wyjąć igłę od szczura i przycisnąć gazik do miejsca wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie przez 30 - 60 sekund.</li>
</ol>
6. Sprzątanie
<ol>
	<li>Wyłącz znieczulenie izofluranem i tlen. Monitoruj szczura, aż odzyska przytomność, a następnie włóż go z powrotem do klatki.</li>
	<li>Ostrożnie umieść wszystkie igły w pojemniku na ostre przedmioty. Wszystkie inne materiały jednorazowego użytku, które są potencjalnie skażone AAV, należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne. Wyczyść stanowiska pracy 70% etanolem.</li>
</ol>
7. Oceń odruch ucieczki tylnych kończyn
UWAGA: Deficyty kończyn tylnych zwykle pojawiają się 2 - 6 tygodni po transferze genu TDP-43, w zależności od dawki wektora.
<ol>
	<li>Na płaskiej powierzchni oczyszczonej z gruzu dwoma palcami chwyć ogon szczura w odległości około 2 cm od ciała. Delikatnie podnieś szczura, aż przednie kończyny zwisają, patrząc na brzuszny spód szczura.
	<ol>
		<li>Procedurę należy wykonywać co tydzień przez cały okres eksperymentu po transferze genów (np. do 12 tygodni po transferze genów). 
		UWAGA: W ten sposób należy również ocenić deficyty kończyn przednich, ale deficyty kończyn tylnych są bardziej prawdopodobne w tym modelu, w zależności od zastosowanej dawki wektora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj tylne kończyny przez 10 s. Zwróć uwagę, czy jedna lub obie tylne kończyny zaciskają się w kierunku linii środkowej podczas 10 s.</li>
	<li>Powtórz ten test w sumie trzy razy w odstępie 30 sekund między próbami. Jeśli jedna lub obie kończyny tylne są zaciśnięte w każdej z trzech prób, szczur wykazuje dysfunkcję motoryczną. Zapisz dane (ręcznie w notatkach) jako jednostronny lub obustronny deficyt kończyn tylnych, jeśli we wszystkich trzech próbach występuje konsekwentne zaciskanie.</li>
</ol>
8. Oceń funkcję motoryczną na rotarodzie
<ol>
	<li>Aby ustawić rotarod, umieść podkładkę pod rotarodem i ustaw przyspieszenie na 4 - 40 obrotów na minutę (rpm) w ciągu 2 min (prędkość wzrasta o ~0,3 rpm/s). Przez 12 tygodni przeprowadzaj badania po 2, 4, 8 i 12 tygodniach od transferu genów.</li>
	<li>Pozwól szczurowi zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez 20 minut.</li>
	<li>Aby wyszkolić szczura do korzystania z rotarodu po raz pierwszy, najpierw uruchom rotarod z ustawioną prędkością 4 obr./min, a następnie umieść szczura na rotorodzie. Pozwól szczurowi chodzić przez jeden pełny obrót z prędkością 4 obr./min, a następnie rozpocznij przyspieszanie i pozwól szczurowi chodzić po rotarodzie, aż spadnie. Kontynuuj trening, aż szczur będzie w stanie konsekwentnie chodzić przez co najmniej 40 sekund. Zdrowy, młody dorosły szczur zostanie łatwo wyszkolony w ten sposób.
	<ol>
		<li>W przypadku szczura z zauważalnym upośledzeniem motorycznym, które może uniemożliwić szczurowi osiągnięcie wyjściowego opóźnienia do upadku wynoszącego 40 s, należy zapewnić szczurowi 3 - 5 prób treningu przed rozpoczęciem punktacji rotarod.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby rozpocząć testowanie rotarod, umieść szczura na rotarodze i rozpocznij przyspieszanie rotarodu. Zwróć uwagę na czas, w którym szczur spada z rotorodu; To jest opóźnienie do spadku. Jeśli szczur pozostanie na rotarodzie po 120 s, zakończ sesję w tym momencie, usuń szczura z rotarodu i zapisz opóźnienie upadku wynoszące 120 s.</li>
	<li>Powtórz test jeszcze dwa razy, w sumie trzy próby. Aby zminimalizować efekt zmęczenia, należy rozmieścić próby w odstępie co najmniej 5 minut. Uśrednij wyniki trzech prób. Nieupośledzony dorosły szczur zazwyczaj ma średni czas oczekiwania na upadek wynoszący > 40 sekund.</li>
	<li>Umieść szczura z powrotem w klatce i oczyść rotarod i okolice 70% etanolem.</li>
</ol>
9. Kwantyfikacja ekspresji GFP w móżdżku
<ol>
	<li>Znieczulić szczury i perfuzję solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie 4% paraformaldehydem. Wypreparuj mózg i rdzeń kręgowy i zanurz tkanki w utrwalaczu przez noc, a następnie przenieś je do 30% roztworu sacharozy. Po zrównoważeniu wytnij 50 μm przekroje koronalne na przesuwanym mikrotomie ze stopniem zamrażania4,5,6.</li>
	<li>Wybierz 3-6 sekcji móżdżku, które są równomiernie rozmieszczone w robaku, centralnym płacie móżdżku. Oznacz fluorescencyjnie GFP, aby zmaksymalizować sygnał. Użyj przeciwciała pierwszorzędowego dla GFP w stosunku 1:500 i użyj sprzężonego przeciwciała drugorzędowego Alexa-488 w rozcieńczeniu 1:3004,5,6. 
	UWAGA: Zobacz referencje 4,5,6, aby uzyskać więcej informacji na temat procedur pobierania próbek, sekcji i barwienia.</li>
	<li>Wykonaj mikrofotografię każdej sekcji w zdefiniowanym obszarze zainteresowania za pomocą soczewki o małym powiększeniu za pomocą mikroskopu. Użyj obiektywu 2.5X (N.A. 0.12) i zestawu filtrów 10, 450-490/515-565 wzbudzenie/emisja). Utrzymuj ustawienia aparatu (czasy ekspozycji, np. 2 s) takie same dla wszystkich próbek, które mają być analizowane. Zapisz jako plik . Plik TIF.</li>
	<li>Otwórz mikrofotografię w powszechnie dostępnym programie do tworzenia obrazów Scion; otworzą się dwa okna. Zamknij okno oznaczone jako "Kolor indeksowany".</li>
	<li>Wybierz "Opcje", a następnie "Wycinek gęstości"; zakres odcieni zostanie zaznaczony na czerwono w oknie tabeli przeglądowej (LUT). W oknie użyj kursora, aby wypełnić tylko określone oznaczenie GFP i zatrzymaj się, gdy niespecyficzne tło zacznie być wybierane na obrazie. 
	UWAGA: Spowoduje to podświetlenie obszaru fluorescencyjnego na mikrofotografii, który ma zostać określony ilościowo. Ustawienia powinny być zoptymalizowane, aby uchwycić wszystkie widocznie fluorescencyjne komórki. Przy odrobinie wprawy metoda ta pozwala precyzyjnie podkreślić określoną fluorescencję.</li>
	<li>Przed pomiarem powierzchni fluorescencyjnej należy najpierw upewnić się, że wykonane pomiary są we właściwych jednostkach (pikselach). Aby to zrobić, kliknij "Analizuj", a następnie "Ustaw skalę"; w czwartym wierszu powinno być napisane "Jednostki". Z listy rozwijanej wybierz piksele do pomiaru w pikselach, a następnie kliknij "OK". Przełącz opcje analizy na "Uwzględnij otwory wewnętrzne", aby zapewnić uwzględnienie całego korpusu komórki w analizie.</li>
	<li>Aby zmierzyć obszar fluorescencyjny, kliknij "Analizuj", a następnie kliknij "Zmierz". Aby zobaczyć tę wartość, kliknij "Analizuj", a następnie kliknij "Pokaż wyniki"; Pojawi się okno wyników. Pomiar obszaru fluorescencyjnego będzie znajdował się pod nagłówkiem oznaczonym "Obszar".</li>
	<li>Aby zapewnić standaryzację pomiarów, nie zmieniaj podświetlonych wartości w oknie LUT.</li>
	<li>Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów należy uśrednić wartości dla każdego zwierzęcia (od 3 do 6 sekcji na zwierzę). Użyj odpowiedniego testu statystycznego, aby porównać wydukowane obszary między grupami. 6</li>
</ol>

<ol><li>Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injections+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansive+gene+transfer+in+the+rat+CNS+rapidly+produces+amyotrophic+lateral+sclerosis+relevant+sequelae+when+TDP-43+is+overexpressed%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed.</a> Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).</li>
<li>Dayton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+forelimb+impairment+in+rats+expressing+a+pathological+TDP-43+25+kDa+C-terminal+fragment+to+mimic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9+supports+wide-scale+transduction+of+the+CNS+and+TDP-43+disease+modeling+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther.+Methods+Clin.+Dev%22%5BJournal%5D)">AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats.</a> Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).</li>
<li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+targeting%2C+better+efficiency+for+wide-scale+neuronal+transduction+with+the+synapsin+promoter+and+AAV-PHP.B%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B.</a> Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).</li>
<li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+respiratory+changes+at+end+stage+in+a+FUS-induced+disease+state+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li>
<li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+vector+%26%2334%3Bmagic+bullet%26%2334%3B%3A+targeted+expression+in+the+central+nervous+system+after+peripheral+delivery+using+the+synapsin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Gene vector &#34;magic bullet&#34;: targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).</li>
<li>van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+embolism%3A+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Physiol.+Funct.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Gas embolism: pathophysiology and treatment.</a> Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przetestowano różne drogi dostarczania pod kątem wektorów AAV: domiąższowe, śródmózgowo-komorowe, dooponowe, dożylne, donosowe, domięśniowe itp. Każda trasa może mieć określone zalety, ale i wady. Podawanie AAV do żył ogonowych dorosłym szczurom jest niezawodną metodą osiągania spójnej transdukcji OUN. Metoda iniekcji obwodowej pozwala uniknąć wprowadzenia kaniuli iniekcyjnej do tkanek OUN i dlatego jest minimalnie inwazyjna. Efektywna ekspresja OUN, którą można osiągnąć tą metodą, jest największą zaletą tej techniki. In...

Rekombinowane wektory wirusa związanego z adenowirusem (AAV) są niezbędnymi narzędziami do badań nad OUN, ponieważ są tak skuteczne w transdukcji neuronów in vivo. Wektory AAV są bardzo wszechstronne w badaniu różnych transgenów i izoform białek, różnych tkanek, różnych gatunków gospodarzy i różnych dróg podawania. Na przykład, AAV może być podawany myszom przez obwodowe, stosunkowo nieinwazyjne, dożylne wstrzyknięcie w celu transdukcji neuronów przez OUN, jak po raz pierwszy opisano w Foust i wsp. oraz Duque i wsp. (patrz artykuł JOVE autorstwa Gombasha i wsp. (2014)). 1,2,3 To podejście do dostarczania genów jest stosowane u szczurów w celu efektywnej ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) lub białka związanego z ALS, białka wiążącego DNA odpowiedzi transaktywnej o masie 43 kDa (TDP-43) w OUN. 4,5,6,7,8,9 Praca na szczurach jest znacząca, ponieważ parametry fizjologiczne i metaboliczne szczura są bliższe ludziom w porównaniu z myszami, a ponadto istnieją testy behawioralne i toksykologiczne zaprojektowane specjalnie dla szczurów. Co więcej, dostępnych staje się więcej transgenicznych linii szczurów, które można wykorzystać w badaniach nad transferem genów AAV.
Szczegółowo opisano metody ekspansywnego transferu genów OUN u szczurów oraz szybkiej, wiarygodnej kwantyfikacji wyników. Szeroko zakrojona transdukcja OUN jest stosowana do naśladowania symptomatologii ALS u szczurów poprzez ekspresję TDP-43 w całym rdzeniu kręgowym. Metoda polega na wstrzyknięciu wektora TDP-43 do żyły ogonowej młodym dorosłym szczurom, jak zastosowano w Jackson i wsp.6,8,9 Po kilku tygodniach, deficyty motoryczne wywołane TDP-43 są oceniane za pomocą dwóch metod: odruchu ucieczki i rotarodu, jak to było w Dayton i wsp. oraz Jackson i wsp.5,6,7,9 Dla kontrolnego wektora GFP, w analizie pośmiertnej, obszar fluorescencyjny móżdżku jest obliczany jako wskaźnik efektywności transdukcji, jak to jest używane w Jackson et al.6,8 Analiza móżdżku okazała się szybkim i wiarygodnym wskaźnikiem stopnia transdukcji OUN po dostarczeniu genu obwodowego i powinna być stosowana do różnych podejść próbujących transferu genów z obwodu do centrum.

<table><tbody><tr><td>Waga</td><td>Pelouze</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro Nalgene</td><td>Thermo Scientific</td><td>12014000</td><td>4000 ml</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Lleczanowy roztwór Ringera</td><td>Baxter Healthcare</td><td>0338-0114-04</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>128101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>22624415</td><td></td></tr><tr><td>Folia laboratoryjna</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309626</td><td>W zestawie igła 25 g dołączona. Zastąp igłą 27-30 g do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Igła 30 g</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>66794-013-25</td><td>Isoflurane USP 250 mL</td></tr><tr><td>Maska anestezjologiczna</td><td>Kopf Instruments</td><td>906</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Henry Schein</td><td>100-2524</td><td>2" x 2" (5cm x 5cm)</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0816</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Gilson</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator do znieczulenia gazowego</td><td>SurgiVet</td><td>4214322</td><td>Classic T3</td></tr><tr><td>Gazowy znieczulacz</td><td>SurgiVet</td><td>32373B10</td><td>Enviro-PURE</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Sears</td><td>17280</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka stołowa</td><td>VWR</td><td>56617-006</td><td></td></tr><tr><td>Aparat Rotarod</td><td>Panlab/Harvard</td><td>76-0772</td><td>4 szczury / 4 myszy</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2401</td><td>140 proof</td></tr><tr><td>70% Isopropanol</td><td>VWR</td><td>89108-160</td><td></td></tr><tr><td>Scion Image</td><td>Scion Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Przeciwciało poliklonalne</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Przeciwciało pierwotne - rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>Przeciwciało drugorzędowe - rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>Mikroskop Axioskop 40</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Wektory wirusa związanego z adenowirusem (AAV) są kluczowym odczynnikiem w neuronaukach do grupowania, regularnie, interspacedowanych, krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR), optogenetyki, celowania w cre-lox, itp. Celem tego manuskryptu jest pomoc badaczowi próbującemu ekspansywnemu transferowi genów ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u szczura poprzez wstrzyknięcie AAV do żyły ogonowej. Ekspresja na szeroką skalę jest istotna w stanach z rozległą patologią, a model szczurzy jest istotny ze względu na jego większy rozmiar i fizjologiczne podobieństwa do ludzi w porównaniu z myszami. W tym przykładowym zastosowaniu transdukcja neuronalna na szeroką skalę jest używana do naśladowania choroby neurodegeneracyjnej, która wpływa na cały rdzeń kręgowy, stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). Wydajna, zakrojona na szeroką skalę transdukcja OUN może być również wykorzystywana do dostarczania terapeutycznych czynników białkowych w badaniach przedklinicznych. Po kilkutygodniowym okresie odciągania pokarmu po wstrzyknięciu ocenia się efekty transdukcji. W przypadku wektora kontrolnego białka zielonej fluorescencji (GFP) ilość GFP w móżdżku jest szacowana szybko i niezawodnie za pomocą podstawowego programu obrazowania. W przypadku fenotypów chorób motorycznych, które są indukowane przez białko związane z ALS transaktywne białko wiążące DNA o masie 43 kDa (TDP-43), deficyty są oceniane przez odruch ucieczki i rotarod. Poza modelowaniem chorób i terapią genową istnieje wiele potencjalnych zastosowań opisanego tutaj celowania genowego na szeroką skalę. Rozszerzone zastosowanie tej metody pomoże w przyspieszeniu testowania hipotez w neuronaukach i neurogenetyce.

Upośledzenia motoryczne wywołane przez TDP-43 powinny pojawić się w ciągu 2 – 6 tygodni, w zależności od zastosowanej dawki AAV TDP-43 (Rysunek 1). Nieudane wstrzyknięcia do żyły ogonowej skutkują częściowymi lub brakiem upośledzeń; AAV musi przedostać się do krwiobiegu, aby wywołać efekt. Prawidłowe wstrzyknięcie AAV GFP spowoduje ekspresję GFP w całym mózgu i rdzeniu kręgowym w sposób zależny od dawki wektora. Przy zastosowaniu silnego rekombinowanego promo...

Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Ogólnym celem tego transferu genów za pomocą wektora wirusa towarzyszącego adenowirusom jest manipulacja genetyczna mózgu i rdzenia kręgowego szczura na szeroką skalę. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie transferu genów. Jest to bardzo wydajny sposób wprowadzania genów in-vivo, a tym samym technika niezwykle potężna i wszechstronna.Procedura ta jest szybka i wysoce powtarzalna. W kilku publikacjach wykorzystaliśmy to szerokozakresowe podejście do transferu genów w celu ekspresji białka związanego z bocznym stwardnieniem zanikowym w całym rdzeniu kręgowym szczurów. Procedurę zaprezentuje mój kolega, Robert Dayton.Mychal Grames będzie pomagać Robertowi. Należy rozpocząć od przygotowania stanowiska pracy; najpierw oczyścić powierzchnię 70% ethanol. Następnie umieścić matę grzewczą w obszarze roboczym i ustawić temperaturę na 37 degree celsius.Umieść matę laboratoryjną na podkładce grzewczej. Sprawdź, czy ilość tlenu i izofluranu jest wystarczająca do przeprowadzenia procedury. Oczyść komorę indukcyjną i maskę anestezjologiczną 70% etanolem, a następnie połóż maskę anestezjologiczną na macie laboratoryjnej.Należy przygotować następujące materiały: kwadrat folii parafinowej o wymiarach około 5 x 5 centymetrów na każde zwierzę, jeden alkoholowy wacik przygotowawczy oraz dwa lub trzy gaziki na każde zwierzę, końcówki do pipet oraz mikropipetę. Następnie rozmrozić wektor w temperaturze pokojowej i oznakować sterylną probówkę do mikrocentryfugi dla każdego zwierzęcia. Do odpowiedniej probówki nanieść pipetą wymaganą objętość AAV, a następnie uzupełnić objętość do pożądanego poziomu iniekcji za pomocą roztworu Ringera z mleczanem lub soli fizjologicznej.Po wymieszaniu próbki w wstrząsarze wierzchołkowym przez jedną lub dwie sekundy, przeprowadź krótkie wirowanie przez pięć sekund, aby zebrać próbkę na dnie probówki. Odpipetuj całkowitą objętość do wstrzyknięcia z probówki na kwadrat folii parafinowej. Następnie załóż igłę o rozmiarze 30 G na strzykawkę o pojemności 1 ml.Wprowadź igłę ściętą skierowaną w dół do wektora na folii parafinowej. Odciągnij tłok strzykawki, aż cały wirus znajdzie się w igle i strzykawce. Prawidłowo znieczul szczura, korzystając z systemu anestezji.Upewnij się, że osiągnięto odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając brak reakcji na uciśnięcie palca u nogi. Następnie umieść szczura na boku w obszarze roboczym i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski nosowej. Przy szczurze leżącym na boku jedna z bocznych żył ogonowych powinna być skierowana do góry.Iniekcję wykonuje się w dwóch trzecich długości ogona. Miejsce wstrzyknięcia należy przetrzeć gazikiem nasączonym alkoholem. Ogon należy mocno trzymać nieco powyżej miejsca iniekcji, kładąc jeden palec bezpośrednio nad boczną żyłą ogonową, co spowoduje rozszerzenie żyły.Ustawiając ścięcie igły skierowane do góry, wyrównaj ją z widoczną żyłą ogonową w tym samym kierunku. Przebij skórę nad żyłą ogonową, zachowując szczególną ostrożność, aby nie nakłuć drugiej ręki trzymającej ogon i nie uciskać żyły ogonowej. Zwolnij ucisk z żyły ogonowej, aby umożliwić normalny przepływ krwi.Następnie wprowadź igłę do żyły. Aby upewnić się, że igła przebiła żyłę ogonową, lekko cofnij tłok. Jeśli igła znajduje się w żyle, do jej wnętrza zacznie wpływać krew.Po ewentualnej korekcie położenia igły, ustabilizuj ją, dociskając koniec strzykawki do ogona. Powoli wstrzyknij wektor do ogona z prędkością około 20 µL na sekundę. W przypadku nieprawidłowego wstrzyknięcia zwierzę zostanie jedynie częściowo transdukowane, a uzyskane wyniki prawdopodobnie nie będą użyteczne.Jednakże przy odpowiedniej praktyce, prawidłowe iniekcje są bardzo powtarzalne i niezawodne. Po podaniu wektora należy wyjąć igłę z ogona i przez 30 do 60 sekund dociskać gazik do miejsca wstrzyknięcia, aby pomóc zahamować krwawienie. Wyłączyć znieczulenie izofluranem oraz dopływ tlenu.Monitoruj szczura do momentu odzyskania przez niego przytomności, a następnie umieść go z powrotem w klatce. Materiały, które mogą być zanieczyszczone AAV, utylizuj w odpowiednim pojemniku na odpady biologiczne, a stanowisko pracy przemyj 70% etanolem. Z utrwalonego i krioprotektowanego mózgu zwierzęcia po iniekcji AAV pobierz koronalne skrawki o grubości 50 mikronów, korzystając z mikrotomu ślizgowego z platformą mrożącą.Po przeprowadzeniu immunobarwienia na GFP i zamknięciu preparatów na szkiełkach, należy wykonać mikrofotografie każdego przekroju w zdefiniowanym obszarze zainteresowania, korzystając z mikroskopu z obiektywem o małym powiększeniu. Ustawienia kamery powinny pozostać niezmienne dla wszystkich analizowanych próbek, a dane należy zapisać w formacie plików TIFF. Następnie otwórz mikrofotografie w powszechnie dostępnym programie Scion Image.Otworzą się dwa okna; zamknij okno oznaczone jako index color. Wybierz opcje, a następnie density slice. Zakres odcieni zostanie zaznaczony na czerwono w oknie tabeli wyszukiwania (look up table).W oknie za pomocą kursora zaznacz wyłącznie specyficzne znakowanie GFP i przerwij czynność w momencie, gdy na obrazie zacznie pojawiać się niespecyficzne tło. Następnie kliknij analyze i ustaw skalę. W czwartej linii powinna znajdować się opcja units; z listy rozwijanej wybierz pixels, a następnie kliknij okay.Aby zmierzyć obszar fluorescencyjny, należy kliknąć analyze, a następnie measure. Następnie należy kliknąć analyze i show results. Pojawi się okno z wynikami, a pomiar obszaru fluorescencyjnego będzie znajdować się pod nagłówkiem area.Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów wyciągnij średnią z wartości uzyskanych z trzech do sześciu przekrojów na zwierzę. Użyj odpowiedniego testu statystycznego, aby porównać obszary transdukcji pomiędzy grupami. Ten reprezentatywny obraz przedstawia immunofluorescencję GFP w móżdżku szczura, cztery tygodnie po wstrzyknięciu AAV 9 GFP do żyły ogonowej.Do selektywnego wyróżnienia obszaru fluorescencyjnego i kwantyfikacji wyróżnionych pikseli wykorzystano oprogramowanie do analizy obrazu. Jest to obraz GFP pochodzący od zwierzęcia nietransdukowanego. Analiza tego obrazu, z zastosowaniem tych samych parametrów co w przypadku zwierzęcia z wstrzykniętym GFP, wykazuje bardzo niski poziom sygnału tła.Po opanowaniu metody, iniekcja może być wykonana w około pięciu minut na szczura. Podsumowując, technika ta opisuje sposób na efektywne wprowadzanie genów do OUN szczura; jednorazowe dostarczenie genu zapewnia trwałą ekspresję i długofalowe efekty. Co najważniejsze, manipulacja ośrodkowym układem nerwowym odbywa się obwodowo.Stosunkowo nieinwazyjna dożylna iniekcja wektora dociera do mózgu i rdzenia kręgowego, czyli do OUN.

methods-tips-for-intravenous-administration-adeno-associated-virus-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

Ten film pokazuje proces wstrzykiwania wektora wirusowego do istoty czarnej szczura w celu modelowania choroby Parkinsona. Przedstawiono w nim etapy przygotowania szczura, mikrowstrzyknięcia wektora wirusowego do istoty czarnej oraz procedury odzyskiwania.

Wstrzyknięcie wektora wirusowego do istoty czarnej szczura w celu modelowania chorób neurodegeneracyjnych

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Źródło: Grames, M. S., et al. Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (AAV) u szczurów. Po wstrzyknięciu do żyły ogonowej bocznej wirus dostaje się do krwiobiegu, krąży w sercu i dociera do mózgu, gdzie dostaje się do neuronów i ułatwia produkcję białka docelowego do zastosowań...

 Dożylne podawanie rekombinowanych wektorów wirusa związanego z adenowirusem w modelu szczurzym 

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób lokalne dostarczanie genów za pośrednictwem wektorów wirusowych zapewnia atrakcyjny sposób ekspresji transgenów w ośrodkowym układzie nerwowym.  Protokół określa wszystkie kluczowe kroki w celu wykonania wstrzyknięcia wektora wirusowego w istotę czarną szczura w celu opracowania opartego na wektorze wirusowym modelu zwierzęcego dla choroby Parkinsona.

Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Przedstawiamy protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego u szczurów, umożliwiający dostarczanie leku bezpośrednio do nerwu bez powikłań po wstrzyknięciu. Metoda ta ma zastosowanie w przedklinicznych badaniach neurologicznych obejmujących manipulację autonomicznego układu nerwowego. Może być stosowany do bezpośredniego wstrzykiwania nerwów dla innych nerwów u szczurów i innych gatunków, z niezbędnymi modyfikacjami.

Protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego dla szczurów

Poznaj metodę dożylnej transfekcji wirusa AAV u szczurów w celu szerokiej ekspresji genów w ośrodkowym układzie nerwowym. Technika ta umożliwia badanie chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Przeglądaj więcej filmów