Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego
25 sierpnia 2017
Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.
Ogólnym celem tego transferu genów wektora wirusa związanego z adenowirusem jest genetyczna manipulacja mózgiem i rdzeniem kręgowym szczura na szeroką skalę. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transferu genów. Jest to bardzo skuteczny sposób wprowadzania genów in vivo, a zatem bardzo potężna i wszechstronna technika.
Ta procedura jest zarówno szybka, jak i wysoce powtarzalna. Zastosowaliśmy to podejście do transferu genów na szeroką skalę do ekspresji białka związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym w rdzeniu kręgowym szczurów w kilku publikacjach. Mój kolega, Robert Dayton, będzie demonstrował tę procedurę.
Asystować Robertowi będzie Mychal Grames. Zacznij od przygotowania stanowiska pracy, najpierw oczyść powierzchnię 70% etanolem. Następnie umieść poduszkę grzewczą w obszarze roboczym i ustaw ją na ogrzanie do 37 stopni Celsjusza.
Umieść podkładkę stołową na poduszce grzewczej. Sprawdź, czy jest wystarczająca ilość tlenu i izofluranu do zabiegu. Wyczyść komorę indukcyjną i maskę anestezjologiczną 70% etanolem i umieść maskę anestezjologiczną na podkładce stołowej.
Upewnij się, że masz pod ręką następujące elementy: jeden kwadrat folii parafinowej o wymiarach około 5 x 5 centymetrów na zwierzę, jedną wacik nasączony alkoholem i dwie lub trzy gaziki na zwierzę, końcówki do pipet i mikropipetę. Następnie rozmrozić wektor w temperaturze pokojowej i oznaczyć jedną sterylną probówkę do mikrowirówki dla każdego zwierzęcia. Odpipetować wymaganą objętość AAV do odpowiedniej probówki i zwiększyć objętość do pożądanej objętości iniekcji roztworem z mleczanami lub solą fizjologiczną.
Po wirowaniu próbki przez jedną lub dwie sekundy, a następnie wirować pulsacyjnie przez pięć sekund, aby sprowadzić próbkę na dno probówki. Odpipetować całkowitą objętość wtrysku z probówki na kwadrat folii parafinowej. Następnie umieść igłę o rozmiarze 30 na strzykawce o pojemności jednego mililitra.
Umieść igłę skosem skierowanym w dół w wektor na folii parafinowej. Odciągnąć tłok strzykawki, aż cały wirus znajdzie się w igle i strzykawce. Prawidłowo znieczulij szczura za pomocą systemu znieczulającego.
Zapewnij odpowiednią płaszczyznę znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Następnie umieść szczura w obszarze roboczym na boku i utrzymuj znieczulenie za pomocą stożka nosowego. Gdy szczur leży na boku, jedna boczna żyła ogonowa powinna być skierowana do góry.
Wtrysk znajduje się w dwóch trzecich wzdłuż ogona. Przetrzeć miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem. Mocno przytrzymaj ogon nieco powyżej obszaru wstrzyknięcia, jednym palcem bezpośrednio nad boczną żyłą ogonową, spowoduje to rozszerzenie żyły.
Ze skosem skierowanym do góry, wyrównaj igłę z widoczną żyłą ogonową w tym samym kierunku. Przebij skórę nad żyłą ogonową, bardzo uważając, aby druga ręka nie trzymała ogona i nie naciskała na żyłę ogonową. Zwolnij ciśnienie z żyły ogonowej, aby umożliwić normalny przepływ krwi.
Następnie wsuń igłę do żyły. Aby upewnić się, że igła przebiła żyłę ogonową, należy lekko pociągnąć tłok do tyłu. Jeśli igła znajduje się w żyle, krew będzie płynąć do igły.
Po zmianie położenia igły, jeśli jest to wymagane, ustabilizować igłę, przytrzymując koniec strzykawki przy ogonku. Powoli wstrzyknij wektor w ogon z prędkością około 20 mikrolitrów na sekundę. W przypadku złego wstrzyknięcia, zwierzę zostanie tylko częściowo przetransdukowane, a wyniki prawdopodobnie nie będą przydatne.
Jednak przy odrobinie wprawy dobre zastrzyki są bardzo powtarzalne i niezawodne. Jeśli wektor został podany, należy usunąć igłę z ogona i przycisnąć gazik do miejsca wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie na 30 do 60 sekund. Wyłącz znieczulenie izofluranem i tlen.
Monitoruj szczura, aż odzyska przytomność, a następnie włóż go z powrotem do klatki. Materiały, które mogą być skażone AAV, należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne i oczyścić stanowisko pracy 70% etanolem. Uzyskaj 50-mikronowe skrawki koronalne z utrwalonego i chronionego kriogenicznie mózgu zwierzęcia, któremu wstrzyknięto AAV, za pomocą przesuwanego mikrotomu ze stopniem zamrażania.
Po barwieniu immunologicznym pod kątem GFP i zamontowaniu na szkiełkach, należy wykonać mikrofotografię każdej sekcji w zdefiniowanym obszarze zainteresowania za pomocą soczewki o małym powiększeniu za pomocą mikroskopu. Zachowaj takie same ustawienia kamery dla wszystkich próbek, które mają być analizowane, i zapisz dane jako pliki TIFF. Otwórz mikrofotografię w powszechnie dostępnym programie Scion Image.
Otworzą się dwa okna, zamknij okno wskazane jako kolor indeksu. Wybierz opcje, a następnie plasterek gęstości. Zakres odcieni zostanie oznaczony kolorem czerwonym w oknie tabeli przeglądów.
W oknie użyj kursora, aby wypełnić tylko określone oznaczenie GFP i zatrzymaj się, gdy niespecyficzne tło zacznie być wybierane na obrazie. Następnie kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę. W czwartym wierszu powinny być napisane jednostki, z listy rozwijanej wybierz piksele, a następnie kliknij OK.
Aby zmierzyć obszar fluorescencyjny, kliknij przycisk Analizuj, a następnie zmierz. Następnie kliknij przycisk Analizuj i pokaż wyniki. Pojawi się okno wyników, a pomiar obszaru fluorescencyjnego będzie znajdował się pod nagłówkiem oznaczonym obszarem.
Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów uśrednij wartości z trzech do sześciu sekcji na zwierzę. Użyj odpowiedniego testu statystycznego, aby porównać wydukowane obszary między grupami. Ten reprezentatywny obraz pokazuje immunofluorescencję GFP w móżdżku szczura, cztery tygodnie po wstrzyknięciu do żyły ogonowej GFP AAV 9.
Oprogramowanie do analizy obrazu zostało wykorzystane do selektywnego podświetlenia obszaru fluorescencyjnego i ilościowego określenia podświetlonych pikseli. To jest obraz GFP zwierzęcia bez transdukcji. Analiza tego obrazu, przy użyciu tych samych parametrów dla zwierzęcia, któremu wstrzyknięto GFP, wykrywa bardzo niski poziom sygnału tła.
Po opanowaniu wstrzyknięcie można wykonać w ciągu około pięciu minut na szczura. Podsumowując, technika ta opisuje sposób skutecznego wprowadzania genów do OUN szczura, jednorazowe dostarczenie genu powoduje trwałą ekspresję i długoterminowe efekty. Co najważniejsze, ośrodkowy układ nerwowy jest manipulowany z peryferii.
Stosunkowo nieinwazyjne dożylne wstrzyknięcie wektorowe dociera do mózgu i rdzenia kręgowego, OUN.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę szerokozakresowego dostarczania genów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u szczurów z wykorzystaniem wektora wirusa towarzyszącego adenowirusom. Technika ta ma na celu naśladowanie chorób atakujących rdzeń kręgowy i umożliwia dostarczenie białek terapeutycznych poprzez pojedynczą podaż obwodową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Neurobiologia
- Tworzenie wektorów
Wprowadzenie
- Wektory wirusów towarzyszących adenowirusom są skuteczne w transferze genów in vivo.
- Dostarczanie genów może pomóc w zrozumieniu chorób neurologicznych.
- Wcześniejsze badania wykorzystywały tę metodę w różnych zastosowaniach.
- Technika ta jest znana z wysokiej wydajności i powtarzalności.
Cel badania
- W celu genetycznej manipulacji mózgiem i rdzeniem kręgowym szczura.
- Aby zbadać potencjał transferu genów w leczeniu chorób OUN.
- Aby zapewnić szybką i wszechstronną metodę wprowadzania genów.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie wektorów wirusów adeno-zależnych do transferu genów.
- Podanie obwodowe w celu uzyskania rozległej transdukcji.
- Zastosowanie metody w celu ekspresji białek związanych z chorobą.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez współpracownika.
Główne wyniki
- Pomyślna ekspresja białek związanych z bocianym stwardnieniem mięśniowym.
- Wykazana skuteczność dostarczania genów do rdzenia kręgowego.
- Walidacja metody w wielu publikacjach.
- Podkreślenie wszechstronności techniki transferu genów.
Wnioski
- Metoda ta jest potężnym narzędziem w badaniach nad ośrodkowym układem nerwowym.
- Dostarcza ona wiedzy na temat zastosowań terapii genowej.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć jej potencjał terapeutyczny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia wydajną, szerokozakresową transdukcję ośrodkowego układu nerwowego u szczurów poprzez dożylne podanie AAV, co wspiera przedkliniczną walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w modelach chorób neurodegeneracyjnych. Podejście to zapewnia powtarzalną, nieinwazyjną drogę do uzyskania szerokiej ekspresji transgenu w mózgu i rdzeniu kręgowym, ułatwiając weryfikację hipotez w neurogenetyce oraz badania nad dostarczaniem białek terapeutycznych. Znaczenie tej metody polega na przyspieszeniu przedklinicznych procesów badawczych poprzez zmniejszenie zmienności biologicznej i zwiększenie pewności prognostycznej w zakresie angażowania celów oraz modulacji szlaków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych dzięki szerokiej ekspresji transgenu w ośrodkowym układzie nerwowym w fizjologicznie istotnym modelu szczura.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu, umożliwiając trwałą ekspresję transgenu po jednorazowym podaniu obwodowym.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność dotyczącą celu poprzez wykazanie zależnej od dawki transdukcji w obrębie obszarów mózgu i rdzenia kręgowego.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje mierzalne odczyty ekspresji transgenu poprzez ilościowe oznaczenie fluorescencji GFP w określonych obszarach OUN.
- Powtarzalność: Zapewnia wysoce spójne poziomy transdukcji u różnych osobników, co umożliwia niezawodną standaryzację analizy.
- Skalowalność: Kompatybilna z badaniami na wielu zwierzętach dzięki szybkiej procedurze iniekcji (~5 minut na szczura) i minimalnej zmienności technicznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modelowanie chorób: Naśladuje rozległą patologię obserwowaną w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak ALS, poprzez transdukcję całego rdzenia kręgowego.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając długotrwałą ekspresję transgenu w celu oceny fenotypowej.
- Zgodność z biomarkerami: Wspiera ocenę dostarczania białek terapeutycznych oraz stopnia oddziaływania na cele w obrębie ośrodkowego układu nerwowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesne testowanie hipotez dotyczących celów terapeutycznych, skalowalny rozwój testów oraz podłużną ocenę fenotypową w systemach istotnych dla danej choroby.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozległą dostarczalność transgenów do OUN.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki ekspresji transgenów do oceny związków lub konstruktów.
- Analityka: Umożliwia ilościowe określanie wydajności transdukcji w oparciu o fluorescencję przy użyciu narzędzi do analizy obrazu.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie rozległej patologii OUN oraz ekspresji białek terapeutycznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do transferu genów celowanych w OUN dla wielu celów i modalności terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez umożliwienie spójnej, szerokozakresowej transdukcji OUN w celu walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki szybkiemu, ściśle określonemu protokołowi wstrzykiwania dożylnego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wiarygodnych przedklinicznych danych dotyczących transdukcji OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera postępy w badaniach z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez walidację zaangażowania celu w istotnym dla choroby modelu szczura.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z gryzoniami, wykonywaniu wstrzykiwań dożylnych oraz stosowaniu technik aseptycznych.
- Zależy od dostępu do produkcji wektorów AAV, sprzętu do znieczulania oraz systemów obrazowania fluorescencyjnego.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w zakresie objętości wstrzykiwanej dawki, miana wektora oraz okresów inkubacji po wstrzyknięciu.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów do różnych serotypów, promotorów i ładunków transgenów.
- Ograniczone przez potencjalne odpowiedzi immunologiczne na AAV oraz zmienną dostępność żyły ogonowej u poszczególnych zwierząt.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Preparation for Injection
2:47
Vector Injection
4:55
Quantification of GFP Expression in the Cerebellum
6:48
Rapid Quantification of the GFP-positive Fluorescent Area in the Cerebellum After Intravenous AAV Administration to the Rat
7:30
Conclusion
