Name: Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Poznaj zaawansowaną mikroskopię konfokalną do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA. Ta metoda umożliwia obserwację naprawy DNA w żywych komórkach HeLa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Agencję Grantową Republiki Czeskiej, projekt P302-12-G157. Eksperymenty były również wspierane przez Czesko-Norweski Program Badawczy CZ09, który jest nadzorowany przez fundusze norweskie, oraz przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej (numer grantu: 7F14369).

<ol><li>Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+damage+to+cellular+DNA%3A+direct+and+photosensitized+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions.</a> Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).</li>
<li>Cooke, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+of+UV-induced+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair.</a> J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).</li>
<li>Lahtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+irradiation+does+not+induce+detectable+changes+in+DNA+methylation+directly+following+exposure+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44858(2012).</li>
<li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+chromosome+aberrations+in+the+human+interphase+nucleus+by+visualization+of+specific+target+DNAs+with+radioactive+and+non-radioactive+in+situ+hybridization+techniques%3A+diagnosis+of+trisomy+18+with+probe+L1.84%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84.</a> Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).</li>
<li>Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+UV+microirradiation+of+interphase+nuclei+and+post-treatment+with+caffeine.+A+new+approach+to+establish+the+arrangement+of+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes.</a> Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).</li>
<li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Oct4+protein+to+UV-damaged+chromatin+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (12), e27281(2011).</li>
<li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1beta-dependent+recruitment+of+UBF1+to+irradiated+chromatin+occurs+simultaneously+with+CPDs%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs.</a> Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39(2014).</li>
<li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microscopy+techniques+used+for+comparison+of+UVA-+and+gamma-irradiation-induced+DNA+damage+in+the+cell+nucleus+and+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biol+%28Praha%29%22%5BJournal%5D)">Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus.</a> Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).</li>
<li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+is+recruited+to+various+types+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage.</a> J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).</li>
<li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coilin+is+rapidly+recruited+to+UVA-induced+DNA+lesions+and+gamma-radiation+affects+localized+movement+of+Cajal+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies.</a> Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).</li>
<li>Franek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Image+Acquisition+and+Analytical+Techniques+for+Studies+of+Living+Cells+and+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).</li>
<li>Lemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+conventional+fluorescent+markers+for+far-field+fluorescence+localization+nanoscopy+allows+resolution+in+the+10-nm+range%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range.</a> J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).</li>
<li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Lakowitz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowitz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+and+polarization-resolved+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology.</a> Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).</li>
<li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+properties+of+aequorin%2C+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan%2C+Aequorea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li>
<li>Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+cellular+proteins+that+bind+to+wild-type+but+not+mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).</li>
<li>Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Binding+protein+53BP1+is+required+for+DNA+damage+responses+and+tumor+suppression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice.</a> Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).</li>
<li>Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+order+in+HeLa+cells+changes+during+mitosis+and+early+G1%2C+but+is+stably+maintained+during+subsequent+interphase+stages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages.</a> J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+silhouette+of+individual+cells+in+S%2FG2%2FM+phases+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence.</a> Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).</li>
<li>Sorokin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+movement+and+morphology+of+UBF1-positive+nucleolar+regions+are+changed+by+gamma-irradiation+in+G2+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle.</a> Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).</li>
<li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET%3A+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS One. 7 (11), e49593(2012).</li>
<li>Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+detectors+improved+time-lapse+confocal+microscopy+of+PML+and+53BP1+nuclear+body+colocalization+in+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions.</a> Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).</li>
<li>Suchankova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+kinetics+of+DNA+repair+protein+accumulation+at+DNA+lesions+and+cell+cycle-dependent+formation+of+gammaH2AX-+and+NBS1-positive+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci.</a> Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).</li>
<li>Bártová, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+is+recruited+to+irradiated+chromatin+in+late+S+phase+and+is+most+pronounced+in+G2+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle.</a> Protoplasma. , (2017).</li>
<li>Krejci, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Translational+Modifications+of+Histones+in+Human+Sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm.</a> J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).</li>
<li>Chou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+localization+screen+reveals+poly+%28ADP+ribose%29-regulated+recruitment+of+the+repressive+polycomb+and+NuRD+complexes+to+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).</li>
<li>Sustackova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation-dependent+nuclear+arrangement+and+recruitment+of+BMI1+protein+to+UV-damaged+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin.</a> J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).</li>
<li>Smirnov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+replication+and+transcription+domains+in+nucleoli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of replication and transcription domains in nucleoli.</a> J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).</li>
<li>Bastiaens, P. I., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).</li>
<li>Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+interactions+using+Forster+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Methods. 66 (2), 200-207 (2014).</li>
<li>Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23867337">High-resolution multiphoton cryomicroscopy.</a> Methods. 66 (2), 230-236 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Techniki mikroskopowe stanowią podstawowe narzędzia w laboratoriach badawczych. W niniejszej pracy przedstawiono krótki opis metod stosowanych do badania rekrutacji i kinetyki białek w uszkodzeniach DNA. Zwróciliśmy szczególną uwagę na nasze doświadczenia eksperymentalne w dziedzinie miejscowego mikronapromieniania żywych komórek i omawiamy badanie kinetyki białek za pomocą FRAP i interakcji białko-białko w uszkodzeniach DNA za pomocą akceptorowo-wybielającego FRET28 i jego zaawansowanej modyfikac...

Uszkodzenia DNA prowadzą do pojawienia się uszkodzeń DNA składających się z dimerów pirymidyny cyklobutanu (CPD), 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny oraz jedno- lub dwuniciowych pęknięć1,2. γ-promienie są formą promieniowania jonizującego o największej energii i wysokiej penetracji, dlatego to źródło promieniowania jest szeroko stosowane w radioterapii3. Z drugiej strony, eksperymentalnie wywołane uszkodzenie DNA spowodowane przez lasery UV naśladuje naturalną ekspozycję na światło UV. Mikronaświetlanie promieniowaniem UVA, jako metoda mikroskopowa, stanowi eksperymentalne narzędzie do badania uszkodzeń DNA w poszczególnych żywych komórkach. Mikronapromienianie zastosowano po raz pierwszy 40 lat temu w celu ujawnienia organizacji regionów chromosomowych4,5. Technika ta jest w dużym stopniu zależna od właściwości funkcjonalnych mikroskopów konfokalnych lub od ograniczeń technicznych nowoczesnej nanoskopii. Aby wywołać uszkodzenia DNA, komórki mogą być wstępnie uwrażliwione przez 5' bromodeoksyurydynę (BrdU) lub Hoechst 33342 przed naświetlaniem UV. Bártová i wsp.6 wcześniej opisywał etap presensytyzacji, a ostatnio zoptymalizowaliśmy tę technikę mikronaświetlania, aby uniknąć śmierci komórki lub apoptozy. Na przykład zastosowanie lasera UV o długości fali 405 nm (bez presensytyzacji Hoechst 33342) prowadzi do indukcji 53BP1-dodatnich pęknięć dwuniciowych (DSB) kosztem dimerów cyklobutanowo-pirymidynowych (CPD). Z drugiej strony, etapy presensytyzacji w połączeniu z mikronaświetlaniem UV indukują jednocześnie bardzo wysokie poziomy CPD i DSB7,8. Metodologia ta jest trudna do zastosowania do badania pojedynczego szlaku naprawy DNA.
Dzięki mikronapromienianiu możliwe jest analizowanie rekrutacji białek, kinetyki i interakcji w uszkodzeniach DNA w żywych komórkach. Przykład tej metody został opublikowany przez Luijsterburga i wsp.9 dla białka heterochromatyny 1β, a ostatnio po raz pierwszy wykazaliśmy, że czynnik pluripotencji Oct4 i białko związane z ciałami Cajala, coilin, są rekrutowane do zmian DNA wywołanych promieniowaniem UV6,10. Kinetykę białek w tych uszkodzeniach DNA można również badać za pomocą technik FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)11,12,13 lub FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)14,15. Metody te mają potencjał, aby ujawnić prostą dyfuzję białek w uszkodzeniach DNA lub interakcjach białko-białko. Użytecznym narzędziem do dodatkowej charakterystyki białek jest FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) lub jego połączenie z technologią FRET (FRET-FLIM)16. Metody te umożliwiają badanie procesów zachodzących w żywych komórkach, w których stabilnie lub przejściowo dochodzi do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania, oznaczonego cząsteczką fluorescencyjną17. Tutaj pokazano przykład wykładniczego czasu rozpadu (τ) dla białka p53 znakowanego GFP i jego partnera interakcji, 53BP1 znakowanego mCherry, odgrywającego ważną rolę w odpowiedzi na uszkodzenie DNA18,19. Parametr τ, czyli czas życia fluorochromu dostarczony przez obliczenia FLIM, jest specyficzny dla danego barwnika fluorescencyjnego, jego zdolności wiązania i środowiska komórkowego. Dlatego ta metoda może nam pokazać różnice między subpopulacjami białek, ich zdolności wiązania i właściwości funkcjonalne po, na przykład, uszkodzeniu DNA.
Tutaj przedstawiono zarys metodologicznych podejść zaawansowanych technik mikroskopowych, które są używane w naszym laboratorium do badania specyficznej dla czasu rekrutacji białek, kinetyki, dyfuzji i interakcji białko-białko w miejscu mikronapromieniowanej chromatyny. Przedstawiono metodologię krok po kroku indukcji lokalnych zmian DNA w żywych komórkach oraz opis metodologii przydatnych do badań zdarzeń związanych z uszkodzeniem DNA w lokalnie indukowanych zmianach DNA wywołanych przez lasery UV.

<table><tbody><tr><td>Cell culting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2TM</td><td></td></tr><tr><td>ES-D3 [D3]</td><td>ATCC</td><td>CRL-11632TM</td><td></td></tr><tr><td>Komórki</td><td></td><td></td> HeLa-Fucci <td>http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN-Biotech</td><td>P03-0710</td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoka glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SV30180.03</td><td></td></tr><tr><td>ES Cell FBS</td><td>Gibco</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>mLIF (czynnik inhibitora białaczki myszy)</td><td>Merck Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>MTG (1-tioglicerol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Biosera</td><td>XC-A4122/100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna - EDTA</td><td>Biosera</td><td>XC-T1717/100</td><td>rozcieńczyć 1 i razy; PBS w stosunku 1:6</td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórek nunclon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7866</td><td>hodowla mESC Komórki D3</td></tr> <tr><td>i mikro;-Dish 35m+A15:I35m Grid-500</td><td>Ibidi GmbH</td><td>81166</td><td>naczynie mikroskopowe</td></tr><tr><td>0,2% Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>rozcieńczyć w wodzie destylowanej i autoklawowane</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy<</td><td>strong>Komentarze</td></tr><tr><td>Transfekcja komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-p53 plazmid</td><td>Addgene</td><td>12091</td><td></td></tr><tr><td>mCherry-PCNA plazmid</td><td></td><td></td><td>hojny prezent od Cristiny Cardoso, Technische Universit&auml; t Darmstadt</td></tr><tr><td>mCherry-53BP1 plazmid</td><td>Addgene</td><td>19835</td><td></td></tr><tr><td>Metafecetene</td><td>Biontex Laboratories GmbH</td><td>T020&ndash; 2.0</td><td></td></tr><tr><td>10 i razy; PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>do użytku transfekcyjnego 1 i razy; PBS rozcieńczony w wodzie wolnej od nukleaz</td></tr><tr><td>5-bromo-2'-deoksy-urydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica TCS SP5</td> Mikroskop <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser światła białego</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355-nm laser</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td>moc lasera 80 mW</td></tr><tr><td>Laser 405 nm</td> Moc lasera <td>Leica Microsystems</td><td></td><td>50 mW</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Barwienie immunofluorescencyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krytko</td><td>VWR International Ltd</td><td>631-1580</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194854</td><td></td></tr><tr><td>Saponina z kory quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>53BP1</td><td>Abcam</td><td>AB21083</td><td>przeciwciało</td></tr> <tr><td>pierwszorzędoweAlexaFluore 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27040</td><td>przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories Ltd</td><td>Podłoże montażowe</td> <td>H-1000</td></tr></tbody></table>

zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w dna

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Lokalne mikropromieniowanie za pomocą laserów stanowi użyteczne narzędzie do badań procesów związanych z naprawą DNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy metodologiczne podejście do analizy kinetyki białek w uszkodzeniach DNA w czasie lub interakcji białko-białko na miejscowo napromieniowanej chromatynie. Pokazujemy również, jak rozpoznawać poszczególne fazy cyklu komórkowego za pomocą systemu komórkowego Fucci do badania kinetyki białek zależnych od cyklu komórkowego w uszkodzeniach DNA. Przedstawiono również opis metodologiczny zastosowania dwóch laserów UV (355 nm i 405 nm) do wywoływania różnych typów uszkodzeń DNA. Tylko komórki naświetlane laserem diodowym o długości fali 405 nm normalnie przechodziły mitozę i były pozbawione dimerów cyklobutanu pirymidyny (CPD). Pokazujemy również, w jaki sposób mikronapromieniowane komórki mogą zostać utrwalone w danym punkcie czasowym w celu przeprowadzenia immunodetekcji interesujących nas endogennych białek. W badaniach naprawy DNA dodatkowo opisujemy zastosowanie metod biofizycznych, w tym FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) i FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) w komórkach z spontanicznie występującymi ogniskami uszkodzenia DNA. Pokazujemy również zastosowanie FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) w badaniach eksperymentalnych oddziaływań białko-białko.

Wykorzystując zaawansowaną mikroskopię konfokalną, zaobserwowaliśmy akumulację białek 53BP1 i PCNA znakowanych mCherry w miejscach uszkodzeń DNA. Analizy przeprowadzono poprzez lokalne mikronapromieniowanie żywych komórek. Aby rozpoznać wzorce rozmieszczenia w jądrze białek związanych z naprawą DNA w poszczególnych fazach cyklu komórkowego, zastosowaliśmy system komórkowy Fucci, który umożliwia określenie faz G1, wczesnej S oraz G2 cyklu komórkowego (Rycina 1...

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Ogólnym celem tych eksperymentów jest wywołanie uszkodzeń DNA za pomocą lokalnego mikonaświetlania komórek oraz obserwacja rekrutacji białek zaangażowanych w procesy naprawy DNA. Ta metoda może pomóc nam zrozumieć bardzo złożone i istotne zagadnienie, takie jak sposób, w jaki zdrowe komórki oraz komórki nowotworowe reagują na uszkodzenia DNA. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania odpowiedzi na uszkodzenia DNA w pojedynczych żywych komórkach. Procedurę zaprezentują Sona Legartova, pracownik postdoktorski, oraz Jana Suchankova, doktorantka z mojej pracowni. Na początek należy hodować komórki HeLa w DMAM uzupełnionym o 10% FBS i odpowiednie antybiotyki. Inkubować komórki w temperaturze 37

advanced-confocal-microscopy-techniques-to-study-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Tutaj pokazano badanie różnych podejść do rozpoznawania zmian DNA za pomocą obrazowania AFM pojedynczej cząsteczki na przykładzie systemu naprawy wycinania nukleotydów. Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz szczegóły doświadczalne i analityczne dla doświadczeń AFM.

Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Poznaj zaawansowaną mikroskopię konfokalną do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA. Ta metoda umożliwia obserwację naprawy DNA w żywych komórkach HeLa.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Przeglądaj więcej filmów