Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA
12 listopada 2017
Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.
Ogólnym celem tych eksperymentów jest wywołanie uszkodzeń DNA za pomocą miejscowego mikronapromieniowania komórek oraz obserwacja rekrutacji białek biorących udział w procesach naprawy DNA. Ta metoda może pomóc nam zrozumieć bardzo złożone i głębokie pytanie, takie jak, jak normalne i rakowe komórki reagują na uszkodzenie DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że jesteśmy w stanie badać odpowiedź na uszkodzenia DNA w poszczególnych żywych komórkach. Procedurę zademonstrują Sona Legartova, post-doc i Jana Suchankova, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek hoduj komórki HeLa w DMAM uzupełnionym 10% FBS i odpowiednimi antybiotykami. Inkubować komórki w temperaturze 37
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Mikroradiacja laserowa jest cenną techniką badania mechanizmów naprawy DNA w żywych komórkach. Niniejsze badanie przedstawia zoptymalizowaną metodę wykorzystania laserów UVA do indukowania specyficznych uszkodzeń DNA przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowego przebiegu cyklu komórkowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Naprawa DNA
- Biologia komórki
- Mikroirradiacja laserowa
Wstęp
- Zrozumienie naprawy DNA jest kluczowe dla poznania reakcji komórkowych na uszkodzenia.
- Mikroradiacja laserowa umożliwia precyzyjną indukcję uszkodzeń DNA.
- Utrzymanie prawidłowego cyklu komórkowego jest niezbędne do dokładnego badania mechanizmów naprawczych.
- Lasery UVA są skuteczne w wywoływaniu miejscowych uszkodzeń DNA.
Cel badania
- Optymalizacja metody lokalnej mikroirradiacji z użyciem laserów UVA.
- Zbadanie wpływu indukowanych uszkodzeń DNA na progresję cyklu komórkowego.
- Pogłębienie zrozumienia procesów naprawy DNA w żywych komórkach.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie laserów UVA do mikroirradiacji.
- Monitorowanie przebiegu cyklu komórkowego po irradiacji.
- Ocena mechanizmów naprawy DNA w komórkach napromieniowanych.
- Porównanie zachowania komórek prawidłowych i napromieniowanych.
Główne wyniki
- Zoptymalizowana metoda mikroirradiacji skutecznie indukowała uszkodzenia DNA.
- Komórki zachowały prawidłowy przebieg cyklu komórkowego pomimo naświetlania.
- Osiągnięto efektywną ocenę mechanizmów naprawy DNA.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA.
Wnioski
- Zoptymalizowana metoda mikroirradiacji laserem UVA jest skuteczna w badaniu naprawy DNA.
- Utrzymanie prawidłowego cyklu komórkowego jest kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników eksperymentalnych.
- Podejście to może zostać zastosowane w dalszych badaniach nad uszkodzeniami i naprawą DNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zaawansowana mikroskopia konfokalna w połączeniu z mikroirradiacją laserową umożliwia precyzyjną analizę interakcji białko-białko oraz kinetyki naprawy w miejscach uszkodzeń DNA w żywych komórkach. Możliwość ta jest kluczowa dla minimalizowania ryzyka w początkowych hipotezach dotyczących szlaków odpowiedzi na uszkodzenia DNA oraz dla zwiększenia wiarygodności predykcyjnej w walidacji celów terapeutycznych. Podejście to wspiera ciągłość translacyjną, umożliwiając badania mechanistyczne w kontekstach komórkowych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację dynamiki rekrutacji i oddziaływań białek w miejscach uszkodzeń DNA w żywych komórkach.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów naprawy DNA poprzez kwantyfikację kinetyki i zaangażowania szlaków.
- Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez rozróżnianie odpowiedzi zależnych od cyklu komórkowego z wykorzystaniem systemu Fucci.
- Dostarcza dowodów na selektywność szlaków i zaangażowanie celów w modelach istotnych dla przebiegu chorób.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy z żywymi komórkami do ilościowej oceny kinetyki i oddziaływań białek.
- Wspiera standaryzację testów poprzez powtarzalną indukcję uszkodzeń DNA przy określonych parametrach lasera.
- Umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie (high-content screening) modulatorów wpływających na dynamikę białek naprawczych DNA.
- Dostarcza ilościowych wyników za pomocą technik FRAP, FLIM i FLIM-FRET w celu rzetelnej oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Powiązana odkrycia mechanistyczne z fenotypami naprawy DNA istotnymi dla przebiegu choroby w komórkach nowotworowych i prawidłowych.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów poprzez łączenie kinetyki oddziaływań białkowych z efektami komórkowymi po uszkodzeniu.
- Umożliwia postęp z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez dostarczenie danych predykcyjnych na temat modulacji szlaków naprawy.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejsza metodologia integruje etapy od wczesnego odkrywania po identyfikację związków wiodących, wspierając zarówno testowanie hipotez, jak i przesiewy ilościowe w systemach z żywymi komórkami.
- Biologia odkrywcza: zapewnia analizę rekrutacji i oddziaływań białek w miejscach uszkodzeń DNA w czasie rzeczywistym w celu wyjaśnienia przebiegu szlaków sygnałowych.
- Screening: dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników kinetyki i oddziaływań białek na potrzeby opracowywania testów.
- Analityka: wykorzystuje techniki FRAP, FLIM oraz FLIM-FRET do generowania porównawczych danych kinetycznych i dotyczących oddziaływań w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: wiążą mechanistyczne zachowanie białek z fazą cyklu komórkowego i wynikami naprawy DNA w odpowiednich modelach.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: oferuje modułową platformę możliwą do adaptacji do różnych celów naprawy DNA i systemów komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów naprawy DNA i dekonwolucji szlaków.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w zakresie indukcji uszkodzeń DNA w żywych komórkach oraz ilościowej analizy białek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie dowodów mechanistycznych na zaangażowanie celu i modulację szlaku.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i mechanizmów naprawy DNA do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zaawansowanej mikroskopii konfokalnej oraz technikach obrazowania żywych komórek.
- Wymaga dostępu do platform mikroirradiacji laserowej oraz infrastruktury do ilościowego obrazowania.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów irradiacji i protokołów analizy kinetycznej pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do różnych typów komórek może wymagać optymalizacji ustawień lasera oraz markerów cyklu komórkowego.
- Interpretacja danych kinetycznych i interakcji musi uwzględniać fazę cyklu komórkowego oraz rodzaj uszkodzenia DNA.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Cultivation of HeLa-derived Cell Lines
1:48
Cell Transfection
3:21
Induction of Local DNA Lesions and Confocal Microscopy
4:47
Fluorescence Lifetime Image Microscopy
6:24
FRET Efficiency Using the FLIM-FRET Script
7:48
FRAP Analysis
8:50
Results: Analysis of Recruitment of mCherry-tagged PCNA and -53BP1 at DNA Lesions in HeLa Cells
11:00
Conclusion
