Name: Wszczepienie guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z ludzkich komórek płaszcza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj metodę wszczepiania guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z komórek płaszcza. Technika ta umożliwia badanie efektów terapii na ludzkich komórkach chłoniaka in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ligue Genevoise contre le Cancer, Fondation Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 i 2914-02-2012, oraz Swiss National Science Foundation Grant 31003A_156760 i 310030-153456.

Próbki ludzkiej krwi zostały użyte zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez lokalne komisje etyki i eksperymentów na ludziach Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie.
Procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem Etycznym ds. Opieki nad Zwierzętami w Genewie, Szwajcaria oraz Kantonalnym Biurem Weterynaryjnym (numer autoryzacji: GE/26/15).
1. Przygotowanie pierwotnych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) metodą separacji gradientu gęstości
UWAGA: 3 - 5 ml krwi obwodowej uzyskano od pacjentów z MCL w fazie białaczkowej. Rozpoznanie ustalono na podstawie standardowych kryteriów diagnostycznych cytometrii przepływowej (CD5+, CD23−, CD200+, populacja monoklonalnych komórek B), a następnie potwierdzono obecnością translokacji chromosomowej t (11; 14) i nadekspresja cykliny D1. We wszystkich przypadkach monoklonalne limfocyty B stanowiły >90% całkowitej populacji komórek B. Pozostałe komórki to głównie monocyty i niektóre limfocyty T.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć (1:1) 5 ml próbki krwi MCL za pomocą 5 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przed użyciem kilkakrotnie odwróć gradient gęstości (tabela materiałów), aby zapewnić dokładne wymieszanie.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki o gradiencie gęstości do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą aspiratora do pipet.</li>
	<li>Delikatnie nałożyć rozcieńczoną próbkę krwi na pożywkę o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą aspiratora (stosunek krwi do pożywki gradientowej gęstości powinien wynosić 2:1, np. 10 ml krwi na 5 ml pożywki o gradiencie gęstości). Należy uważać, aby nie mieszać dwóch warstw (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, C).</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 400 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonych hamulcach wirówki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety Pasteura delikatnie zassać środkową warstwę (białawy, cienki pierścień oznaczony strzałką (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, E)) zawierającą komórki jednojądrzaste i przenieść je do czystej probówki.</li>
	<li>Mycie komórek jednojądrzastych
	<ol>
		<li>Oszacuj objętość przeniesionej zawiesiny komórkowej i dodaj do niej 3 objętości sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).</li>
		<li>Wymieszać zawiesinę, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę o sile 400 - 500 x g przez 10 - 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant w celu uzyskania osadu komórkowego i ponownie powtórzyć etap płukania.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości, np. 1 lub 2 ml PBS.</li>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznie za pomocą hemocytometru (komora Neubauera).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wzbogacanie komórek B przez negatywny wybór komórek B
<ol>
	<li>Rozcieńczyć komórki w PBS do końcowego stężenia 50 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przenieś komórki do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Dodaj 100 μl koktajlu przeciwciał z zestawu do wzbogacania limfocytów B do 2 ml zawiesiny komórek i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2-1).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Krótko wiruj cząstki magnetyczne dostarczone w zestawie do wzbogacania komórek B przez 30 s (<silna klasa="xfig">Rysunek 2-2). Dodać 150 μl cząstek magnetycznych do 2 ml próbki.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez kolejne 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Doprowadzić objętość próbki do 2,5 ml za pomocą 1x PBS zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Umieść probówkę w magnesie i inkubuj probówkę przez kolejne 3 - 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2-3).</li>
	<li>Podnieś magnes z rurką na miejscu i jednym ciągłym ruchem zdekantuj rurkę tak, aby wzbogacona zawiesina komórek została zebrana w świeżej probówce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2-4). Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznie za pomocą hemocytometru, aby uzyskać całkowitą wydajność komórek B. 
	UWAGA: Zazwyczaj wydajność wynosi ~105 komórek B / ml dla normalnych komórek B i 5 - 50 x 106 komórek / ml dla MCL.</li>
	<li>Potwierdzenie czystości wzbogacenia limfocytów B
	<ol>
		<li>Weź ~ 50 000 komórek i inkubuj komórki z przeciwciałami anty-CD19/CD20 (rozcieńczenie 1:20) i przeciwciałem anty-CD45 sprzężonym z różnymi fluorochromami (rozcieńczenie 1:10) w temperaturze pokojowej przez 15 - 30 min.</li>
		<li>Przemyć 1 ml 1x PBS + 1% BSA, odwirować komórki przy 400 - 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w ~200 μL PBS.</li>
		<li>Pobrać próbki komórek za pomocą cytometrii przepływowej i przeanalizować pod kątem czystości komórek B. Czystość wynosi przeważnie >90% według tej metody (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rozwój modelu myszy ksenoprzeszczepu
<ol>
	<li>Zawiesić ~40 - 60 x 106 komórek w 150 - 200 μL 1x PBS (objętość wymagana do wstrzyknięcia na mysz).</li>
	<li>Wstrzyknąć dożylnie 150 μl zawiesiny komórkowej (i.v.) do każdej żyły ogonowej 6-7-tygodniowych myszy z niedoborem odporności NOD scid gamma (NSG), niezależnie od płci (<silna klasa = "xfig" >Figura 4A).</li>
	<li>Pozwól myszom rozwinąć ludzkiego chłoniaka przez ~ 10 tygodni. 
	UWAGA: Pierwotne ludzkie komórki chłoniaka potrzebują znacznie więcej czasu, aby rozwinąć guz w porównaniu z ludzkimi liniami komórkowymi chłoniaka (~ 3 tygodnie).</li>
	<li>Kiedy zwierzęta zaczynają wykazywać objawy śmiertelnej choroby, takie jak utrata masy ciała, zmierzwione włosy, zmniejszona aktywność, paraliż kończyn tylnych itp., Poświęć myszy przez uduszenie CO2, a następnie nakłucie serca w celu uzyskania krwi.</li>
	<li>Zbierz różne narządy, takie jak szpik kostny, śledziona i wątroba, przeprowadzając sekcję myszy i zbierz krew obwodową, pobierając krew z serca w momencie poświęcenia do analizy przeszczepu guza (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B - F).</li>
</ol>
4. Analiza chimeryzmu komórek nowotworowych wszczepionych w różne narządy
<ol>
	<li>Po pobraniu różnych narządów przetworzyć je przez mechaniczne rozerwanie w celu wytworzenia zawiesin pojedynczych komórek po lizie czerwonych krwinek (RBC) przy użyciu 200 μl 1x buforu potasu chlorku amonu dla krwi i szpiku kostnego, 500 μl dla śledziony i 2 ml dla wątroby.</li>
	<li>Policz i wybarwij komórki za pomocą przeciwciał specyficznych dla ludzkich limfocytów B, tj. anty-CD19, anty-CD20 i anty-CD45. 
	UWAGA: Myszy NSG nie mają komórek B, dlatego do analizy komórki są barwione markerami komórek B specyficznymi dla ludzi.</li>
	<li>Analizuj komórki pochodzące z każdego narządu za pomocą cytometrii przepływowej, bramkując na komórkach B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).</li>
	<li>Określ ilościowo przeszczepione komórki nowotworowe w różnych narządach pochodzących od myszy, którym wstrzyknięto MCL, na podstawie bramkowanych komórek, jak wskazano w kroku 4.3 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4G) . 
	UWAGA: Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th edition, (2001).</li>
<li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li>
<li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li>
<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
<li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma%3A+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li>
<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badania kliniczne są możliwe dla leków, które są w zaawansowanym stadium rozwoju, ale nie mogą być wykorzystywane do odkrywania leków. Wysiłki mające na celu opracowanie zwierzęcych biorców do ksenotransplantacji komórek ludzkich w celu przetestowania leków na wczesnym etapie rozwoju są już od dawna kontynuowane. W tym miejscu przedstawiamy model zwierzęcy, który pozwala uniknąć odrzucenia przeszczepu u człowieka i może ustanowić model dla chorób ludzkich, takich jak MCL. Jest to obecnie najnowocześniejszy model ksenoprz...

Limfocyty z natury odgrywają główną rolę w nadzorze immunologicznym, a transport limfocytów jest kluczowym krokiem w budowaniu odporności swoistej dla antygenu1,2. Proces ten obejmuje migrację naiwnych limfocytów T z grasicy do krwiobiegu, a stamtąd do wtórnych narządów limfatycznych, w tym węzłów chłonnych, plam Peyera lub śledziony, gdzie spotykają się z pokrewnymi antygenami. Limfocyty B różnicują się w szpiku kostnym i migrują jako komórki naiwne do pęcherzyków wtórnych narządów limfatycznych3. Niektóre z tych limfocytów B wiążą antygen ze swoim receptorem i są aktywowane przez specyficzne limfocyty T. Proliferacja i różnicowanie tych limfocytów B popycha nieaktywowane, naiwne limfocyty B do strefy płaszcza pęcherzyka. Aktywowane komórki mogą następnie różnicować się w limfocyty B pamięci, które patrolują organizm, lub dojrzewać do komórek plazmatycznych wydzielających immunoglobulinę, które migrują do szpiku kostnego4.
MCL występuje, gdy naiwne limfocyty B w strefie płaszcza przekształcają się w guz. Te komórki chłoniaka znajdują się w mikrośrodowisku narządów limfatycznych i namnażają się niezależnie od specyficznej kontroli limfocytów T. Jednak na pewnym etapie zagęszczenia uciekają z tej niszy i krążą ponownie w krwiobiegu w poszukiwaniu nisz w innych narządach. Biorąc pod uwagę złożoność cząsteczek adhezyjnych oraz rozwiązłość chemokin i ich receptorów, mechanizm tego transportu komórkowego in vivo jest słabo poznany, co utrudnia terapię. Potrzebne są nowe metody, aby skutecznie zablokować ten proces migracji, aby zapobiec przedostawaniu się komórek B chłoniaka do nowych mikrośrodowisk.
MCL jest jednym z najtrudniejszych do leczenia nowotworów złośliwych komórek B. Rozwój nowotworowego fenotypu MCL jest wynikiem wieloetapowej kaskady, charakteryzującej się nabyciem unikalnych właściwości biologicznych. W momencie rozpoznania u większości pacjentów (70%) występuje już choroba rozsiana, przy czym w większości przypadków występuje pozawęzłowe zajęcie śledziony, szpiku kostnego i/lub przewodu pokarmowego5,6. U leczonych pacjentów nawroty opornych nowotworów w ciągu kilku lat są powszechne, mimo że konwencjonalna chemioterapia wywołuje wysokie wskaźniki remisji w krótkim okresie7,8. W tym miejscu przedstawiamy nowy model choroby, który może pomóc w zrozumieniu rozprzestrzeniania się MCL i leżącej u jego podstaw biologii: stworzyliśmy ludzki model ksenoprzeszczepu MCL u myszy, który pochodzi z pierwotnych komórek nowotworowych pacjentów. Mamy nadzieję, że model ten przyczyni się do opracowania strategii terapeutycznych przeciwko rozsiewowi MCL i być może dostarczy nowych perspektyw klinicznych dla optymalnej diagnostyki i leczenia pacjentów z nawrotem choroby.

<table><tbody><tr><td>Pożywka Ficoll-paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>do separacji komórek jednojądrzastych</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Technologie Gibco-Life</td><td>61870-010</td><td>do rozcieńczania próbki krwi</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>mycie komórek</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>do przygotowania PBS z 1% BSA stosowany w myciu komórek podczas izolacji</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>Beckman Coulter</td><td>B49212</td><td>ludzki marker komórek B</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21693</td><td>ludzki marker komórek pan-B</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3607</td><td>ludzki marker komórek pan-B</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN A70203</td><td>ludzki marker</td></tr> <tr>komórek T<td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>Białko powierzchniowe komórki zwykle nieobecne w MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>Marker pan-leukocytów</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>Białko powierzchniowe komórki zwykle nieobecne u myszy MCL</td></tr><tr><td>NOD scid gamma (NSG)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td>użyte do opracowania ksenoprzeszczepów MCL w tym badaniu</td></tr><tr><td>Easy sep Zestaw do wzbogacania ludzkich komórek B Technologie</td><td>komórek macierzystych</td><td>19054</td><td>stosowany do wzbogacania komórek B w celu uzyskania czystych komórek do wstrzykiwania myszom</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>Navios</td><td>używany do charakteryzowania próbki MCL i badania narządów do wszczepienia MCL:</td></tr><tr><td>1X bufor potasu chlorku amonu,</td><td></td><td></td><td>bufor do czerwonej krwi (NH4Cl, 8,024 mg / l; KHCO3 1,001 mg/l; EDTA. Na2 i middot; 2H2O 3,722 mg/l )</td></tr></tbody></table>

wszczepienie guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z ludzkich komórek płaszcza

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B limfocyty są kluczowymi graczami w krążeniu komórek odpornościowych i głównie domują i rezydują w narządach limfatycznych. Podczas gdy normalne limfocyty B namnażają się tylko wtedy, gdy są stymulowane przez limfocyty T, onkogenne komórki B przeżywają i rozwijają się autonomicznie w nieokreślonych niszach narządowych. Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) jest jednym z takich zaburzeń z komórek B, w którym mediana przeżycia pacjentów wynosi 4 - 5 lat. Wymaga to skutecznych mechanizmów, za pomocą których blokowane jest naprowadzanie i wszczepianie tych komórek w celu zwiększenia przeżywalności i długowieczności pacjentów. W związku z tym niezwykle ważne jest opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu w celu zbadania skuteczności terapii MCL poprzez blokowanie mechanizmu naprowadzania in vivo. Od dawna trwają prace nad opracowaniem zwierzęcych biorców ksenotransplantacji komórek ludzkich w celu przetestowania leków na wczesnym etapie, ponieważ odpowiednie przedkliniczne modele myszy mają kluczowe znaczenie dla badań przesiewowych nowych środków terapeutycznych. Ten model zwierzęcy został opracowany w celu uniknięcia odrzucenia przeszczepu u ludzi i ustanowienia modelu dla chorób u ludzi, a także może być niezwykle przydatnym narzędziem do badania progresji choroby różnych typów chłoniaka oraz do przeprowadzania badań przedklinicznych potencjalnych leków na nowotwory hematologiczne, takie jak MCL. Stworzyliśmy mysi model ksenoprzeszczepu, który będzie służył jako doskonałe źródło do badania i opracowywania nowatorskich podejść terapeutycznych w MCL.

W manuskrypcie opisano zoptymalizowany protokół skutecznego opracowania mysiego modelu ksenoprzeszczepu dla engraftmentu komórek MCL. Przygotowanie czystej populacji komórek (w tym przypadku komórek MCL) jest kluczowe dla pomyślnego wytworzenia ksenoprzeszczepów MCL. Rycina 1 przedstawia etapy preparatywne izolacji komórek mononuklearnych z krwi pacjenta z MCL za pomocą separacji gradientem gęstości. Komórki mononuklearne są następnie przetwarzane w celu uzys...

Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) jest trudnym do leczenia zaburzeniem komórek B i równie trudno jest stworzyć mysi model ksenoprzeszczepu pierwotnego MCL w celu zbadania i opracowania terapii. W tym miejscu opisujemy udane wprowadzenie ksenoprzeszczepów MCL u myszy, aby pomóc zrozumieć ich biologię.

Wszczepienie guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z ludzkich komórek płaszcza

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Ogólnym celem tej metody jest stworzenie ksenogennego modelu mysiego dla chłoniaka z komórek płaszcza w celu opracowania strategii leczenia tej choroby. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie hematoonkologii, takie jak wynik terapeutyczny różnych strategii leczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie wpływu leków na ludzkie komórki chłoniaka in vivo.Zastosowanie tej techniki ma istotne znaczenie dla terapii chłoniaka komórkowego płaszcza, ponieważ wykorzystanie tego modelu pozwala w sposób wykonalny i wygodny badać wpływ terapii na komórki pochodzące od pacjentów. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat aspektów terapeutycznych chłoniaka komórkowego płaszcza, może ona zostać zastosowana również do badania różnych typów chłoniaków. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na trudność w uzyskaniu ksenograftów pochodzących od pacjentów.Kiedy po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł opracowania tej metody, chcieliśmy zbadać migrację limfocytów B in vivo oraz wpływ niektórych terapii na ten proces. Rozcieńczyć 12 ml próbki krwi pacjenta z chłoniakiem z komórek płaszcza równymi objętościami pożywki RPMI 1640. Następnie kilkukrotnie odwrócić probówkę z mediami do gradientu gęstości przed użyciem.Odpiessać 15 ml medium do gradientu gęstości do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Za pomocą aspiratora ostrożnie i powoli nanieść rozcieńczoną próbkę krwi na wierzch medium do gradientu gęstości, unikając wymieszania obu warstw. Następnie wyłączyć hamulec i wirować próbkę krwi przy 400g przez 40 minut w temperaturze pokojowej.Za pomocą sterylnej pipety Pasteura odessać mononuklearne komórki krwi z warstwy środkowej i przenieść je do czystej probówki. Aby przemyć komórki mononuklearne, dodać trzy objętości sterylnego roztworu Phosphate Buffered Saline o pojedynczym stężeniu z 1% płodowej surowicy bydlęcej do szacowanej objętości zawiesiny komórkowej. Kilkukrotnie pipetować zawiesinę komórkową w celu właściwego wymieszania.Następnie odwiruj próbkę przy 400-500g przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odlej supernatant i przemyj osad komórkowy roztworem Phosphate Buffered Saline o pojedynczej mocy z dodatkiem 1% bovine serum albumin. Odwiruj próbkę.Następnie odlej supernatant i resuspender komórki w jednym lub dwóch mililitrach soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Następnie policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Rozcieńcz komórki w PBS, a następnie przelej je pipetą do polistyrenowej probówki o pojemności pięciu mililitrów i dodaj 100 µL koktajlu przeciwciał do zawiesiny komórkowej.Kilkukrotnie i delikatnie pipetuj zawiesinę komórkową, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 10 minut. W międzyczasie wymieszaj na wirówce typu vortex cząsteczki magnetyczne z zestawu do wzbogacania limfocytów B przez 30 sekund.Następnie dodaj 150 µL cząsteczek magnetycznych do 2 mL zawiesiny komórkowej. Inkubuj mieszaninę komórek i cząsteczek magnetycznych w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Doprowadź objętość próbki do 2,5 mL, następnie umieść probówkę w magnesie i inkubuj przez kolejne trzy do pięciu minut.Po inkubacji, jednym ciągłym ruchem, przelej zawiesinę komórkową z probówki przymocowanej do magnesu do nowej probówki. Następnie, za pomocą automatycznego licznika komórek, wyznacz całkowitą liczbę uzyskanych limfocytów B w zawiesinie. Aby potwierdzić czystość wzbogaconych limfocytów B, inkubuj około 50 000 komórek z przeciwciałami anty-CD19, CD20 i anty-CD45 sprzężonymi z różnymi fluorochromami w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut.Następnie komórki należy przemyć 1 ml pojedynczej stężenia roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i 1% albuminy surowicy bydlęcej. Komórki wiruj przy 400-500g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odlej supernatant i zawieś osad w 200 µL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).Przeanalizuj czystość limfocytów B za pomocą cytometrii przepływowej; stosując tę metodę, czystość zazwyczaj przekracza 90%. Zzawieś komórki w 150 µL roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) o pojedynczej mocy. Następnie wstrzyknij zawiesinę komórkową dożylnie do żyły ogonowej myszy w wieku od sześciu do siedmiu tygodni, niezależnie od ich płci.Dożylne wstrzyknięcie komórek chłoniaka wyizolowanych z krwi pacjenta do ogona myszy jest również kluczowe dla zapewnienia skutecznego przyjęcia przeszczepu. Po uśmierceniu myszy w komorze z dwutlenkiem węgla należy pobrać poszczególne organy. Następnie organy poddaje się rozdrabnianiu mechanicznemu na filtrze o rozmiarze 70 µm za pomocą tłoka strzykawki w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.Odwiruj wszystkie próbki, z wyjątkiem krwi, przy 400–500g przez pięć minut, a następnie odlej nadsącz. Do lizy krwi, szpiku kostnego, śledziony i komórek wątroby użyj buforu chlorkowo-amoniakowo-potasowego o pojedynczym stężeniu. Przed analizą na cytometrze przepływowym istotne jest przefiltrowanie komórek pochodzących z organów izolowanych od myszy w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, co zapobiega zapychaniu się urządzenia.Do barwienia komórek należy użyć przeciwciał specyficznych dla limfocytów B, takich jak anty-CD19, CD20 i CD45. Analiza cytometryczna z przepływem potwierdziła, że limfocyty B pochodzące z każdego organu były dodatnie pod kątem przeciwciał CD19, CD20 i CD45. Na podstawie wyselekcjonowanych populacji komórek (gating) należy określić liczbę komórek nowotworowych specyficznych dla organu oraz komórek przeszczepionych, uzyskanych z myszy z indukowanym chłoniakiem z komórek płaszcza.W niniejszym badaniu przeprowadzono cytometrię przepływową w celu oceny czystości limfocytów B przed i po wzbogaceniu w przypadku chłoniaka z komórek płaszcza. Do charakterystyki mononuklearnych komórek chłoniaka z komórek płaszcza wykorzystano specyficzne markery limfocytów B, takie jak CD45, CD19, CD5, CD200, CD20 Kappa i Lambda. Analiza cytometryczna wykazała obecność komórek wykazujących pozytywne barwienie dla CD45, CD19, CD20 oraz CD5.Następnie wyselekcjonowano je do charakterystyki. Wybrano również komórki, które nie wybarwiły się dla CD23 i CD200. Stopień specyficznego dla narządu wszczepienia badano poprzez dalszą analizę narządów metodą cytometrii przepływowej, a następnie analizę obecności limfocytów B.Przedstawiono tutaj porównawczą reprezentację wzorca wszczepienia uzyskanego od dwóch pacjentów z wykorzystaniem organów takich jak śledziona, szpik kostny i wątroba. Po opanowaniu techniki ta może być przeprowadzona w ciągu trzech tygodni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wzbogacać PBMC używane do ksenoprzeszczepów, a także regularnie kontrolować myszy pod kątem życiowych oznak choroby, takich jak zmierzwiona sierść, zgarbione plecy, paraliż tylnych kończyn i utrata masy ciała.Po zastosowaniu tej procedury ksenoprzeszczepy można wykorzystać w innych typach chłoniaków, na przykład w celu realizacji medycyny personalizowanej. Po opracowaniu ta technika może utorować drogę innym badaczom w dziedzinie hematoonkologii do zbadania sposobów ustanawiania chłoniaka z komórek płaszcza pochodzącego od pacjentów u immunodeficyjnych myszy NOD SCID. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak oczyszczać PBMC pochodzące od pacjentów i wykorzystywać je do ksenoprzeszczepów u immunodeficyjnych myszy w celu zrozumienia strategii terapeutycznych.Prosimy nie zapominać, że praca z pierwotnymi próbkami ludzkiej krwi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tych procedur należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek.

tumor-engraftment-xenograft-mouse-model-human-mantle-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano metodę niezawodnego przeszczepiania ludzkich komórek złośliwego guza pochewki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Omówiono również wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do wykazania prawidłowego przyjęcia przeszczepów nowotworowych oraz kryteria losowego przydziału zwierząt do grup badawczych.

Ortotopowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do testowania potencjalnych środków terapeutycznych in vivo

Ten film demonstruje test do generowania humanizowanego modelu myszy ksenoprzeszczepu. Myszom z obniżoną odpornością wstrzykuje się cyklofosfamid, aby spowodować wyczerpanie komórek odpornościowych. Komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta zmieszane z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) w hydrożelu są wstrzykiwane podskórnie myszy, tworząc guz z naciekającymi limfocytami T.

Technika generowania ludzkiego, humanizowanego modelu myszy ksenoprzeszczepu wszczepionego w PBMC

Ksenografty ludzkich nowotworów u myszy z niedoborem odporności są cennymi narzędziami do badania biologii raka.  Opisano specyficzne protokoły generowania ksenoprzeszczepów podskórnych i wewnątrzwątrobowych z ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego lub fragmentów guza.  Regeneracja wątroby wywołana częściową hepatektomią u myszy biorców jest przedstawiana jako strategia ułatwiająca wszczepienie wewnątrzwątrobowe.

Wytwarzanie podskórnych i wewnątrzwątrobowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka wątrobowokomórkowego u myszy z niedoborem odporności

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Opisujemy ludzką komórkę jednojądrzastą krwi obwodowej (PBMC) — humanizowany model myszy ksenoprzeszczepu do translacyjnych badań immunoonkologicznych. Protokół ten może służyć jako ogólna wskazówka do ustanawiania i charakteryzowania podobnych modeli oceny terapii I-O.

Humanizowany model ksenoprzeszczepu z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) do badań immunoonkologicznych translacyjnych (I-O)

Obecny protokół opisuje metody tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) i pierwotnych linii komórek rakowych z próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań w zakresie biologii nowotworów.

Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Ortotopowe modele myszy z przerzutowym czerniakiem błony naczyniowej oka ludzkiej wątroby zostały stworzone przy użyciu technik chirurgicznej implantacji ortotopowej z technikami wstrzykiwania kawałków guza pochodzących od pacjenta i igieł z hodowanymi ludzkimi liniami komórkowymi czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej.

Generowanie ortotopowej platformy ksenoprzeszczepu ludzkiego czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej wątroby u myszy z niedoborem odporności

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Obecny protokół opisuje, jak przeszczepić ludzką skórę nieotyłym myszom z cukrzycą (NOD)-scid z receptorem łańcucha gamma interleukiny-2 (NSG). W raporcie zawarto szczegółowy opis przygotowania skóry ludzkiej do przeszczepu, przygotowania myszy do przeszczepu, przeszczepu skóry ludzkiej o podzielonej grubości oraz procedury rekonwalescencji po przeszczepie.

Model skóry ksenoprzeszczepu do manipulowania ludzkimi odpowiedziami immunologicznymi in vivo

Poznaj metodę wszczepiania guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z komórek płaszcza. Technika ta umożliwia badanie efektów terapii na ludzkich komórkach chłoniaka in vivo.

Wszczepienie guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z ludzkich komórek płaszcza

Przeglądaj więcej filmów