Name: Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych osobników oraz ich hodowlę in vitro. Technika umożliwia badanie różnicowania komórek i odpowiedzi immunologicznych na promieniowanie UVB.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant NATIONAL INSTITUTE OF ARTHRITIS AND MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES (R01AR069653 dla Zhang LJ) oraz National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 dla CA).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzane przez UCSD Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Pierwotna izolacja KC myszy i hodowla ze skóry noworodka
<ol>
	<li>Ofiaruj w dniu poporodowym 0-2 noworodki ze szczepu myszy typu dzikiego C57B/6 poprzez ścięcie głowy za pomocą nożyczek. Odetnij kończyny tuż nad stawami nadgarstkowymi i skokowymi, a następnie całkowicie odetnij ogon, pozostawiając mały otwór.</li>
	<li>Aby zdjąć całą skórę, najpierw włóż ostre nożyczki przez otwór na ogonie i przetnij skórę wzdłuż grzbietowej linii środkowej ciała do otworu na szyi. Następnie użyj jednych kleszczy, aby chwycić odsłonięte ciało, a drugich kleszczy, aby chwycić skórę i delikatnie oderwać całą skórę od ciała i kikutów nóg jednym ciągłym ruchem.
	<ol>
		<li>Oderwij skórę jako jeden nienaruszony kawałek i uważaj, aby nie rozbić skóry na kawałki, ponieważ spowoduje to utratę komórek na etapie depazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opłucz obraną skórę 15 ml sterylnego PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego, a następnie umieść skórę każdego szczeniaka w probówce o pojemności 2 ml wypełnionej lodowatym buforem do wytrawiania w dypazie, który zawiera 4 mg/ml dypazy w pożywce wzrostowej KC (podłoże podstawowe KC ma 0,06 mM CaCl2, dGS i antybiotyki/leki przeciwgrzybicze). 
	UWAGA: Wiele izolatów skóry można łączyć i inkubować w jednej probówce o pojemności 15 ml (do 5 skórek na probówkę) zawierającej 12 ml roztworu dypazy. Inkubować rurkę skórną przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C na rotatorze.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że skóra nie jest złożona w probówce, ponieważ spowoduje to niewystarczającą ekspozycję złożonego obszaru na roztwór dyspazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia (po 12-18 godzinach w dyspazie) przenieść skórę wraz z roztworem dyspasy na szalkę Petriego. Przenieś każdy fragment tkanki na nową szalkę Petriego z 15 ml sterylnego PBS, aby zmyć nadmiar dypazy.</li>
	<li>Za pomocą dwóch par kleszczy chwyć skórę z PBS, unieś skórę i przenieś na nową szalkę Petriego naskórkiem do dołu i skórą właściwą do góry. Ostrożnie rozciągnij fałdy skórne tak, aby były całkowicie rozciągnięte na szalce Petriego.</li>
	<li>Umieść 500 μl roztworu trawiącego na bazie trypsyny dla każdej skóry na nowej szalce Petriego. Za pomocą kleszczy powoli unieś skórę właściwą do góry i odsuń ją od naskórka, jednocześnie przytrzymując naskórek w dół. Usuń skórę właściwą jako materiał niebezpieczny biologicznie. Przenieś oddzielony naskórek i unosić się na każdej kropli roztworu trypsyny warstwą podstawową w dół.
	<ol>
		<li>Jeśli naskórek jest pofałdowany na roztworze trypsyny, usuń wszelkie fałdy za pomocą kleszczy, aby zapewnić efektywne trawienie podstawowych KC z nabłonka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować skórę na szalce Petriego w roztworze trypsyny w temperaturze pokojowej (z przykrytą pokrywką) na poziomym wytrząsarce z delikatnym mieszaniem przez 20 minut.</li>
	<li>Dodaj 2 ml uzupełnionej pożywki wzrostowej KC na naskórek (około 1 cala kwadratowego na naskórek) do szalki Petriego. Chwyć naskórek za pomocą kleszczy i energicznie pocieraj naskórek w przód iw tył, aby uwolnić pojedyncze komórki z arkusza naskórka.
	<ol>
		<li>Obserwuj, jak podłoże staje się coraz bardziej mętne, gdy komórki są odłączane od naskórka. Przechylić szalkę Petriego, aby zebrać i przenieść zawiesinę komórek do nowej probówki, pozostawiając pozostały arkusz naskórka na szalce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz jeszcze dwa razy pocieranie arkusza naskórka po dodaniu 2 ml pożywki wzrostowej KC i połącz zawiesiny komórkowe w tej samej probówce.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować roztwór komórkowy kilka razy w górę i w dół, aby rozbić wszelkie grudki komórek, za pomocą odpowiedniej pipety serologicznej, a następnie przepuścić go przez filtr 100 μm do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowane komórki przez 5 minut przy 180 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnej pożywki wzrostowej KC/naskórka.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: KC mogą spontanicznie różnicować się w zawiesinie, dlatego komórki należy posiać jak najszybciej po izolacji, aby zapewnić optymalną wydajność komórek. Zalecamy umieszczenie komórek na lodzie podczas liczenia, ponieważ zmniejszy to tempo spontanicznego różnicowania KC.</li>
	<li>Zasiać komórki o gęstości 5 x 104/cm2 w pożywce KC w szalkach hodowlanych wstępnie pokrytych produktem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), który wspomaga przyczepianie komórek. 
	UWAGA: Używamy dostępnego na rynku (np. Attachment Factor, który jest materiałem powlekającym na bazie żelatyny (szczegóły w Tabeli Materiałów). Komórki hodowano w wilgotnym inkubatorze z 5% smoczkiemCO2 w temperaturze 37 °C, a świeże podłoże uzupełniano co drugi dzień.
	<ol>
		<li>W celu powlekania pokryć szalki hodowlane materiałem powlekającym do mocowania komórek, podgrzanym do temperatury pokojowej przez 10 minut do 2 godzin przed wysiewem komórek. Usuń współczynnik przyłączenia tuż przed dodaniem zawiesiny komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę 24 godziny po początkowym posiewie w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek i zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną pożądane zbieganie przed eksperymentem.</li>
</ol>
2. Izolacja KC pierwotnej myszy od skóry dorosłego ogona
<ol>
	<li>Ofiarować dorosłą mysz C57BL/6 (najlepiej w wieku od 6 do 15 tygodni; samca lub samicę) zgodnie z przepisami obowiązującymi w obiekcie dla zwierząt. Odetnij ogon od korpusu od podstawy ogona i odetnij ~2 mm końcówki ogona, tak aby na końcu był widoczny otwór.</li>
	<li>Aby zdjąć skórę ogona, najpierw użyj ostrego ostrza, aby przeciąć skórę ogona od podstawy do końca ogona. Następnie użyj jednych kleszczy, aby chwycić odsłoniętą kość ogonową, a drugich kleszczy, aby chwycić skórę i delikatnie oderwij skórę ogona od kości jednym ciągłym ruchem. Odetnij obraną skórę od linii środkowej, tak aby każdy kawałek miał mniej niż 2-3 cm długości.</li>
	<li>Opłucz obraną skórę 15 ml sterylnego PBS na 10 cm szalce Petriego, a następnie umieść skórę z każdego ogona w probówce o pojemności 2 ml wypełnionej lodowatym buforem do wytrawiania w postaci dypazy (4 mg/ml dypazy w pożywce wzrostowej KC). 
	UWAGA: Wiele kawałków skóry można również łączyć i inkubować w jednej probówce o pojemności 15 ml (do 5 ogonków na probówkę) zawierającej 12 ml roztworu dypazy.
	<ol>
		<li>Inkubować rurkę skórną przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C na rotatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj kroki od 1.4 do 1.13, aby wyizolować zawiesinę jednokomórkową z naskórka ogona.</li>
	<li>Wysiewać dorosłe komórki o gęstości 10 x 104/cm2 (liczone za pomocą hematocytometru) w pożywce wzrostowej KC w szalkach hodowlanych wstępnie pokrytych kolagenem. 
	UWAGA: Używamy dostępnego na rynku zestawu do powlekania na bazie kolagenu (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów). Komórki hodowano w wilgotnym inkubatorze z 5% smoczkiemCO2 w temperaturze 37 °C, a świeże podłoże uzupełniano co drugi dzień. Ogólnie rzecz biorąc, szalki hodowlane powinny być pokryte kolagenem na 30 minut do 1 godziny przed wysiewem komórek. Obserwujemy, że istnieje znaczne wzmocnienie przyczepiania dorosłego KC do naczynia po pokryciu kolagenem w porównaniu z czynnikiem przyczepienia, który jest materiałem powlekającym na bazie żelatyny.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę 24 godziny po początkowym posiewie w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek i zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną pożądane zbieganie przed eksperymentem.</li>
</ol>
3. Różnicowanie KC in vitro przez wysoką zawartość wapnia
<ol>
	<li>Aby wywołać różnicowanie końcowe, dodać CaCl2 do 0,2 mM w pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Alternatywnie, zagłodź wyhodowane KC przez noc bez dodatku suplementów wzrostu w pożywce podstawowej KC o niskiej zawartości wapnia przed dodaniem wysokiej zawartości wapnia. 
	UWAGA: Głód czynnika wzrostu zwiększy zaangażowanie komórek we wczesne różnicowanie i indukcję markerów wczesnego różnicowania, takich jak K105.</li>
</ol>
4. Śmierć komórek za pośrednictwem promieniowania UVB i uwalnianie TNFα z KC
<ol>
	<li>Hodować mysie KC w pożywce wzrostowej KC (w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C) z codzienną wymianą pożywki, aż komórki osiągną zbieżność. Bezpośrednio przed naświetlaniem promieniowaniem UVB należy usunąć pożywkę wzrostową i zastąpić ją 500 μl PBS. Następnie poddaj komórki działaniu 25 mJ/cm2 UVB lub pozorowanej kontroli (bez UVB). 
	UWAGA: Naświetlanie UVB odbywa się za pomocą ręcznych lamp UVB z dwiema żarówkami o mocy 8 W (312 nm), jak opisano wcześniej10. Po naświetlaniu promieniowaniem UVB PBS jest odsysany i dodawana jest świeża pożywka.</li>
	<li>Zmierz i określ ilościowo żywotność komórek za pomocą testu żywotności komórek CCK-8 po 6, 8 i 24 godzinach po leczeniu UVB zgodnie z instrukcją producenta11.</li>
	<li>Zbierz kondycjonowaną pożywkę z KC poddanych działaniu UVB w żądanych punktach czasowych i zmierz TNFα uwolniony w kondycjonowanym podłożu przez mysi zestaw ELISA TNF (Mono/Mono) zgodnie z instrukcją producenta7,12.</li>
</ol>

<ol><li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2%2B+and+K%2B+gradients+in+murine+epidermis%3A+quantitative+measurement+using+PIXE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li>
<li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis%3A+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li>
<li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+is+a+dynamic+regulator+of+epidermal+proliferation+and+differentiation+by+integrating+EGFR+and+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).</li>
<li>Lai, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+regulate+Toll-like+receptor+3-dependent+inflammation+after+skin+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury.</a> Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).</li>
<li>Bernard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+radiation+damages+self+noncoding+RNA+and+is+detected+by+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3.</a> Nat Med. 18 (8), (2012).</li>
<li>Zhang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Peptide+LL37+and+MAVS+Signaling+Drive+Interferon-beta+Production+by+Epidermal+Keratinocytes+during+Skin+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury.</a> Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-Like+Receptor+3+Activation+Is+Required+for+Normal+Skin+Barrier+Repair+Following+UV+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3+activation+is+required+for+normal+skin+barrier+repair+following+UV+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Zillessen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+role+of+dipeptidyl+peptidase+4+%28DPP4%29+in+primary+human+%28pre%29adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes.</a> Sci Rep. 6, 23074(2016).</li>
<li>Wells, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage-inducible+C-type+lectin%2C+mincle%2C+is+an+essential+component+of+the+innate+immune+response+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans.</a> J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).</li>
<li>Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+actin+polymerization+is+the+driving+force+for+epithelial+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion.</a> Cell. 100 (2), 209-219 (2000).</li>
<li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+receptor+p55+plays+a+pivotal+role+in+murine+keratinocyte+apoptosis+induced+by+ultraviolet+B+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation.</a> J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+utilization+of+epidermal+keratinocytes+for+oncogene+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research.</a> Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).</li>
<li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse keratinocytes.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15502164">Primary mouse keratinocyte culture.</a> Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).</li>
<li>Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+murine+epidermal+differentiation+markers+is+tightly+regulated+by+restricted+extracellular+calcium+concentrations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro.</a> J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).</li>
<li>Yuspa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+for+proliferation+and+differentiation+in+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).</li>
<li>Fang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li>
<li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+cell+cycle+exit%2C+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes%3A+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li>
<li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+1.2+mmol%2Fl+calcium%2C+triamcinolone+acetonide%2C+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Naskórek skóry pełni funkcję krytycznej bariery oddzielającej i chroniącej organizm przed środowiskiem zewnętrznym i uszkodzeniami spowodowanymi utratą wody, patogenami, ciepłem i promieniowaniem UV. KC są dominującą linią komórkową naskórka, a pierwotna hodowla KC naskórka jest użytecznym narzędziem do badania i zrozumienia biologicznych procesów tworzenia bariery i reakcji KC na zniewagi środowiskowe in vitro.
Tutaj opisujemy metody izolacji i hodowli pierwotnych naskórkowych KC ze ...

Skóra jest największym organem w ciele, a naskórek jest najbardziej zewnętrzną warstwą. Naskórek odgrywa kluczową rolę w tworzeniu nienaruszonej bariery naskórkowej oddzielającej organizm od środowiska, a tym samym zapobiega utracie wody i zapewnia ochronę przed szkodliwymi czynnikami środowiskowymi, takimi jak alergeny, patogeny i ekspozycja na promieniowanie UVB. Naskórek rozwija się z pojedynczej warstwy niezróżnicowanych keratynocytów podstawnych (KC) w wielowarstwowy nabłonek warstwowy składający się z warstwy podstawnej, a następnie warstwy kolczystej, warstwy ziarnistej i warstwy rogowej naskórka. Podstawowe KC, składające się zarówno z komórek macierzystych naskórka, jak i komórek wzmacniających tranzyt, są proliferacyjne i niezróżnicowane. Gdy podstawowe KC opuszczają cykl komórkowy, komórki zobowiązują się do różnicowania i stopniowo migrują w kierunku powierzchni naskórka, czemu towarzyszy dojrzewanie połączeń komórka-komórka i tworzenie bariery przepuszczalności naskórka (EPB). KC w warstwie kolczystej wyrażają wczesne markery różnicowania, takie jak keratyna 10 (K10); gdy KC migrują do warstwy ziarnistej, komórki wyrażają późne markery różnicowania, takie jak filagryna (FLG), lorycyna (LOR) i inwolukryna (INV). W warstwie rogowej naskórka KC stają się terminalnie zróżnicowanymi korneocytami, które ostatecznie są zrzucane przez złuszczanie, gdy zastępują je nowe komórki.
Wapń jest uważany za najbardziej fizjologiczny czynnik w naskórku i w podobny sposób wywołuje różnicowanie in vitro i in vivo. W normalnym naskórku skóry jony wapnia tworzą charakterystyczny "gradient stężeń", zwiększając swoje stężenie w kierunku powierzchni skóry1,2,3. Stężenie wapnia wzrasta od niskich poziomów w najniższych podwarstwach (warstwa podstawowa i kolczysta) do szczytu w górnej warstwie ziarnistej, a następnie spada do znikomych poziomów w najbardziej powierzchownej warstwie (warstwa rogowa naskórka). Gradient wapnia rozwija się również równolegle z pojawieniem się bariery przepuszczalności składników, która potwierdza, że sygnalizacja wapniowa odgrywa kluczową rolę w różnicowaniu KC. W warunkach in vitro niski poziom wapnia (0,02-0,1 mM) utrzymuje proliferację podstawowych KC jako monowarstwy, podczas gdy wysoki poziom wapnia (>0,1 mM) indukuje szybkie i nieodwracalne zaangażowanie komórek w końcowe różnicowanie, co wykazano przez tworzenie ścisłych połączeń i indukcję LOR i INV po leczeniu wysokim poziomem wapnia do podstawowych KC4,5.
Oprócz tworzenia bariery, naskórkowe KC są również ważnym składnikiem wrodzonego układu odpornościowego skóry. W odpowiedzi na patogeny lub wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP) uwalniane po napromieniowaniu UVB lub urazie, KC mogą wytwarzać duże ilości cytokin zapalnych, takich jak TNFα, IL6 i IFNβ, co prowadzi do aktywacji układu odpornościowego6,7,8,9. Chociaż do usunięcia patogenu wymagana jest właściwa sygnalizacja zapalna z KC, niekontrolowana reakcja zapalna może wywołać rozwój autozapalnych chorób skóry, takich jak łuszczyca i trądzik różowaty6,8.
Ogólnie, KC odgrywają istotną rolę w utrzymaniu nienaruszonej bariery skórnej i inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej na inwazję patogenów lub zniewagi środowiska. Dlatego pierwotna hodowla naskórkowych KC jest przydatną techniką do badania biologii nabłonka, różnicowania KC, a także stymulowanych przez KC wrodzonych odpowiedzi immunologicznych. Izolacja i hodowla pierwotnych naskórkowych KC myszy może być trudnym procesem ze względu na podatność i wrażliwość KC na różne zewnętrzne stymulanty. Tutaj opisujemy metodę izolowania i hodowli KC ze skóry noworodków myszy lub skóry ogona dorosłej myszy. Do izolacji dorosłych KC nie używamy skóry grzbietowej myszy, ponieważ wyizolowanie wystarczającej ilości żywotnych KC z tej tkanki może być trudne z następujących powodów: Po pierwsze, dorosła skóra grzbietowa w spoczynkowej fazie cyklu włosa (telogen) składa się z cienkiego naskórka z zaledwie 1-2 warstwami komórek, co prowadzi do niskiej wydajności komórek i nieefektywnego oddzielenia naskórka od skóry właściwej, co jest krytycznym krokiem dla udanej izolacji KC. Po drugie, wysoka gęstość mieszków włosowych, która jest obecna na skórze grzbietowej osoby dorosłej, dodatkowo przyczynia się do trudności w oddzieleniu naskórka od skóry właściwej. Zamiast tego rutynowo używamy skóry ogona jako źródła KC dla dorosłych myszy, ponieważ nabłonek ten jest grubszy i składa się z 3-5 warstw KC naskórka. Ma również niższą gęstość mieszków włosowych, co nie zakłóca separacji naskórka, umożliwiając w ten sposób izolację KC od skóry ogona dorosłej myszy, niezależnie od wieku i etapu cyklu włosów myszy. Izolowane noworodkowe KC wysiewa się do szalek hodowlanych pokrytych żelatyną, podczas gdy naczynia pokryte kolagenem są używane do wysiewu izolowanych dorosłych KC ze względu na upośledzoną zdolność dorosłych komórek do przylegania w porównaniu z ich noworodkowymi odpowiednikami. Aby hodować myszy KC, podłoże podstawowe o niskiej zawartości wapnia jest uzupełniane dGS, który zawiera naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), bydlęcą transferynę, insulinopodobny czynnik wzrostu c1 (IGF1), prostaglandynę E2 (PGE2), albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i hydrokortyzon. Między 2-4 dniami po początkowym posiewie większość zróżnicowanych KC może zostać zmyta podczas codziennych zmian podłoża, a pozostałe przylegające komórki wykazują typową morfologię kostki brukowej4, rozmnażają się i nie wyrażają wczesnego markera różnicowania K10.

<table><tbody><tr><td>Noworodki C57BL/6 lub dorosłe myszy typu dzikiego</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Myszy typu dzikiego (pierwotnie zakupione od Jackson Laboratory) są hodowane i utrzymywane w wiwarium dla zwierząt w UCSD.</td></tr><tr><td>Pożywka podstawowa KC (EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>MEPICF500</td><td>podłoże podstawowe do hodowli keratynocytów z 0,06 mM CaCl2</td></tr><tr><td>Defined Growth Supplement (dGS)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S0125</td><td>zdefiniowane suplementy wzrostu dla podłoża hodowlanego</td></tr><tr><td>Proszek do dyspazy</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>17105041</td><td>enzym do dysocjacji naskórka od skóry właściwej</td></tr><tr><td>Czynnik przyłączenia</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>materiał powlekający na bazie żelatyny</td></tr><tr><td>Coating Matrix</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>Materiał powłokowy na bazie kolagenu</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>Delikatny enzym podobny do trypsyny do dysocjacji keratynocytów z arkusza naskórka</td></tr><tr><td>100 &mu; m Sitko do komórek Siatka nylonowa</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw żywotności komórek CCK-8</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>Mysz TNF (mono/mono) ELISA Set II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>Przewodowe ręczne lampy UV</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>8-watowe lampy UV</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop świetlny do hodowli komórkowych</td><td>ZEISS, Jena, Niemcy</td> Mikroskop fluorescencyjny <td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Keratynocyt (KC) jest dominującym typem komórek w naskórku, najbardziej zewnętrznej warstwie skóry. Naskórkowe KC odgrywają kluczową rolę w zapewnianiu obrony skóry, tworząc nienaruszoną barierę skórną przed zniewagami środowiskowymi, takimi jak promieniowanie UVB lub patogeny, a także inicjując reakcję zapalną na te zniewagi. Tutaj opisujemy metody izolowania KC ze skóry noworodków myszy i ze skóry ogona dorosłej myszy. Opisano również warunki hodowli przy użyciu zdefiniowanych suplementów wzrostu (dGS) w porównaniu z cheleksowaną płodową surowicą bydlęcą (cFBS). Funkcjonalnie pokazujemy, że zarówno noworodkowe, jak i dorosłe KC są wysoce wrażliwe na wysokie różnicowanie końcowe wywołane wapniem, tworzenie ścisłych połączeń i stratyfikację. Ponadto hodowane dorosłe KC są podatne na śmierć komórek wywołaną promieniowaniem UVB i mogą uwalniać duże ilości TNF po napromieniowaniu UVB. Opisane tutaj metody będą przydatne dla naukowców przy tworzeniu modeli in vitro do badania biologii naskórka u noworodków myszy i/lub myszy dorosłych.

Wysokie stężenie wapnia indukuje różnicowanie terminalne keratynocytów (KC) noworodkowych i dorosłych. Pierwotne keratynocyty naskórka mysiego wysiane i hodowane w stężeniu 0,06 mM CaCl2 rosły jako monowarstwa, a pojedyncze komórki miały kształt wieloboczny z wyraźną przestrzenią międzykomórkową, wykazując wygląd „brukowej nawierzchni” po osiągnięciu konfluencji (Rysunek 1A oraz Rysunek 2A). Zwiększeni...

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie pierwotnych keratynocytów mysich z skóry myszy noworodkowej lub dorosłej w celu badania ich różnicowania in vitro lub analizy wrodzonych odpowiedzi immunologicznych na ekspozycję na promieniowanie UVb. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii naskórka dotyczące regulacji różnicowania keratynocytów oraz sposobu, w jaki keratynocyty naskórka reagują na bodźce zewnętrzne. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość konwencjonalnej izolacji keratynocytów zarówno ze skóry myszy noworodkowej, jak i dorosłej, a także możliwość ich hodowli bez udziału surowicy.Procedurę zaprezentuje ze mną Fengwu Li, współpracownik naukowy z mojego laboratorium. W pierwszej kolejności należy usunąć kończyny noworodka myszy typu dzikiego C57 BL6 w wieku od zero do dwóch dni po urodzeniu, przecinając tuż powyżej stawów nadgarstkowych, a następnie całkowicie odciąć ogon, pozostawiając niewielki fragment. Wprowadzić ostre nożyczki przez otwór po ogonie i rozciąć skórę wzdłuż linii środkowej grzbietu ciała aż do otworu na szyi.Używając jednej pęsety, chwyć odsłonięte ciało, a drugą pęsetą chwyć skórę. Następnie del

isolation-culture-primary-mouse-keratinocytes-from-neonatal-adult

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Ten film opisuje izolację keratynocytów - najważniejszych komórek warstwy naskórka ludzkiej skóry, poprzez zastosowanie kombinacji trawienia enzymatycznego i metod mechanicznego zakłócania. Ta metoda pomaga w preferencyjnym wzroście keratynocytów w porównaniu z innymi typami komórek skóry przy użyciu selektywnej pożywki wzrostowej.

Izolacja keratynocytów ludzkiej skóry: metoda hodowli pierwotnych keratynocytów z próbek skóry

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Ludzka skóra działa jako pierwsza linia obrony przed środowiskiem zewnętrznym. Przedstawiono metodę izolacji pierwotnych keratynocytów ludzkich od skóry osoby dorosłej. Te izolowane keratynocyty są przydatne w wielu konfiguracjach eksperymentalnych i są bardzo odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.

Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę keratynocytów jamy ustnej pochodzących z podniebienia dorosłej myszy. Podano również metodę oceny z wykorzystaniem barwienia immunologicznego.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

Protokół ten określa hodowlę świeżo pozyskanych (przepustka 0) keratynocytów do wykorzystania w obrazowaniu żywych komórek.

Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Przedstawiamy tutaj protokół izolacji, oczyszczania i hodowli pierwotnych komórek marginalnych z myszy stria vascularis oraz do tworzenia in vitro modeli stresu oksydacyjnego i starzenia komórkowego w celu badania zaburzeń ściany bocznej ślimaka.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

Poznaj metodę izolacji pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych osobników oraz ich hodowlę in vitro. Technika umożliwia badanie różnicowania komórek i odpowiedzi immunologicznych na promieniowanie UVB.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów