Name: Żywienie dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj protokół żywienia dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u Drosophila melanogaster. Ta metoda umożliwia szybkie indukowanie otyłości i pomiar akumulacji tłuszczu w celu badania lipotoksyczności oraz chorób metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Eriki Taylor za zredagowanie tego rękopisu. Praca ta została sfinansowana z grantów z National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 i R01 HL054732) dla R.B., suplementu badawczego po doktoracie (R01 HL085481) i stypendium (AAUW) dla S.B.D. oraz grantów z American Heart Association dla S.B.D. i R.T.B.

1. Protokół żywienia dietą wysokotłuszczową (HFD)
<img alt="Tabela konfiguracji fermentacji z ilościami składników w gramach i mililitrach, do użytku badawczego." src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Przepis na pożywkę dla muszek. 
Tabela ta podsumowuje poszczególne składniki wykorzystane do przygotowania pokarmu kontrolnego. Po przygotowaniu 10 ml pokarmu przelewa się do probówek, chłodzi i przechowuje w temperaturze 4 °C do długoterminowego przechowywania.
<ol>
	<li>Przygotowanie HFD
	<ol>
		<li>Aby przygotować 1 kg pożywki wysokotłuszczowej, odważyć za pomocą wagi analitycznej 70 g gotowej standardowej pożywki dla muszek (patrz Tabela 1) oraz 30 g oleju kokosowego do dwóch oddzielnych pojemników.</li>
		<li>Podgrzewać każdy pojemnik oddzielnie w kuchence mikrofalowej, aż zawartość całkowicie się rozpuści. Wlać olej kokosowy do pojemnika z pożywką dla muszek. Mieszać rózgą, aż olej zostanie dobrze połączony z pożywką. 
		UWAGA: Nie powinny być widoczne grudki pożywki ani oleju. Podczas roztapiania pożywki w mikrofalówce należy przerywać proces w odstępach 1 min w celu wymieszania masy i zapobiegania wykipieniu.</li>
		<li>Ponownie zważyć pożywkę wysokotłuszczową. Jeśli całkowita waga jest mniejsza niż 1 kg (70 g pożywki + 30 g oleju kokosowego), dodać wodę (około 10 mL), aby zrekompensować odparowanie podczas podgrzewania i przywrócić wagę do 1 kg.</li>
		<li>Wlać około 10 mL dobrze wymieszanej pożywki wysokotłuszczowej do każdej fiolki (około 25% objętości fiolki). Następnie przykryć gazą, aby zapobiec kontaminacji przez muszki. Chłodzić przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść fiolki do temperatury 4 °C w celu przechowywania do 4 tygodni. 
		UWAGA: Pożywka standardowa (NF) jest stosowana jako kontrolna. Do każdej fiolki należy również wlać 10 mL (około 25% objętości fiolki) pożywki NF. W przypadku pożywki HFD 30% pożywki NF zastąpiono olejem kokosowym. W warunkach kontrolnych i eksperymentalnych muszki otrzymywały taką samą ilość NF i HFD (10 mL pożywki na fiolkę).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat procedury pomiaru triglicerydów u Drosophila; eksperyment żywieniowy; zbieranie much, mrożenie, etapy analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1karmienie dietą wysokotłuszczową (HFD) w Muszka owocówka. 
Schemat przedstawia poszczególne etapy karmienia much na pożywce kontrolnej (normalna dieta bez dodatku oleju kokosowego – NF) lub HFD (z dodatkiem oleju kokosowego). Cały proces trwa 10 dni od momentu wstępnego zebrania dorosłych much. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<ol start="2">
	<li>karmienie dietą wysokotłuszczową (HFD) D. melanogaster 
	UWAGA: Niniejszy protokół obejmuje procedury żywienia pokarmem kontrolnym oraz dietą wysokotłuszczową (HFD), które są kompatybilne z dowolną linią much. Muchy kontrolne i doświadczalne umieszcza się w fiolkach zawierających taką samą ilość pokarmu (NF lub HFD).
	<ol>
		<li>Użyj CO2 w celu znieczulenia much. 
		UWAGA: Osoby początkujące proszone są o zapoznanie się z literaturą referencyjną21 do przeglądu zasad hodowli i obchodzenia się ze zwierzętami D. melanogaster.</li>
		<li>Zebrać muchy w wieku od 0 do 5 dni z fiolek i przenieść je (poprzez odwrócenie fiolek) do nowych fiolek zawierających pożywkę NF (wcześniej ogrzaną do temperatury pokojowej). Pozostawić muchy na kolejne 5 dni w 21 °C.</li>
		<li>Po upływie 5 dni wyjmij probówki zawierające HFD i NF z 4 °C. 
		UWAGA: Ponieważ niskie temperatury mogą powodować stres u żywych much, przed użyciem należy pozostawić fiolki na 30 min w temperaturze pokojowej w celu ich ogrzania.</li>
		<li>Za pomocą chusteczek należy oczyścić ścianki fiolek i usunąć z nich nadmiar cieczy.</li>
		<li>Włóż niewielki kawałek papieru filtracyjnego, o wymiarach około 1 cm x 3 cm, do pokarmu wysokotłuszczowego, aby wchłonął nadmiar cieczy. 
		UWAGA: Ten krok jest kluczowy, aby zapobiec przywieraniu much do pożywki HFD.</li>
		<li>Następnie przenieś muchy na pożywkę wysokotłuszczową (poprzez odwrócenie fiolek). Połóż fiolki poziomo na boku (nie pionowo) w temperaturze 21-22 °C przez 5 dni. 
		UWAGA: Należy unikać wyższych temperatur, ponieważ mogą one doprowadzić do częściowego stopienia wysokotłuszczowej pożywki, co spowoduje przyklejenie się much do pokarmu i ich śmierć.</li>
		<li>Po 5 dniach przenieść (poprzez odwrócenie probówek) muchy z grup NF i HFD do nowych probówek bez pożywki, aby umożliwić opróżnienie ich przewodu pokarmowego przez 30 min. Następnie przystąpić do ważenia much. 
		UWAGA: Jednym z krytycznych etapów niniejszego protokołu żywienia dietą wysokotłuszczową (HFD) jest przygotowanie dobrze wymieszanej diety HFD, pozbawionej grudek pożywki dla muszek lub skondensowanego tłuszczu. Homogeniczne wymieszanie i schłodzenie diety HFD do 45-30 °C zaleca się, przed rozlaniem do fiolek i przechowywaniem pożywki w 4 °CWłaściwe dopasowanie wieku much kontrolnych i eksperymentalnych jest równie istotne, co kontrolowane warunki żywieniowe i środowiskowe przed podaniem diety wysokotłuszczowej (HFD). W fazie karmienia muchy kontrolne i eksperymentalne muszą otrzymywać taką samą ilość pożywki standardowej (NF) oraz HFD. Nigdy nie należy pobierać much z przepełnionych fiolek lub butelek (aby uniknąć efektów transgeneracyjnych). Podczas podawania NF i HFD do każdej fiolki należy umieścić maksymalnie 25 much, aby uniknąć restrykcji żywieniowych lub innych efektów związanych z zagęszczeniem. HFD składa się w 30% z oleju kokosowego, zatem temperatury powyżej 22 °C może doprowadzić do częściowego stopienia HFD, co spowoduje przyklejenie się much do tłustego pokarmu i ich śmierć. Przed umieszczeniem much na HFD należy oczyścić fiolki, aby usunąć wszelkie pozostałości tłuszczu, oraz włożyć papier filtracyjny w celu wchłonięcia nadmiaru płynu z pokarmu. Podczas inkubacji much na HFD fiolki układa się poziomo, aby zapewnić muchom wolną od tłuszczu poziomą powierzchnię.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ważenie much
	<ol>
		<li>Dla każdego genotypu i płci poddawanych badaniu należy użyć wagi o wysokiej czułości, aby zapisać masę wcześniej oznakowanych, pustych probówek o pojemności 1,7 ml.</li>
		<li>Stosowanie anestetyku dla much lub CO22znieczulić i zebrać pędzelkiem 36 much o tym samym genotypie, płci i statusie żywieniowym do jednej wcześniej zważonej probówki o pojemności 1,7 ml.</li>
		<li>Zważ probówkę z muchami przy użyciu tej samej wagi ultraprecyzyjnej.</li>
		<li>Oblicz średnią masę muchy według następującego wzoru: 
		<img alt="Wzór na obliczenie średniej masy muchy; równanie służące do obliczania masy muchy na podstawie pomiarów rurki." src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		UWAGA: Liczba much w tym protokole wynosi 36.</li>
		<li>Probówki o pojemności 1,7 ml zawierające muchy zamrozić błyskawicznie, zanurzając je w ciekłym azocie na 2 min. Zebrać probówki i umieścić je w pudełkach. Następnie przenieść pudełka do -80 °C (preferowana temperatura) przechowywania do czasu zastosowania w teście TAG. 
		OSTRZEŻENIE: Azot ciekły znajduje się w ekstremalnie niskiej temperaturze. Prosimy o stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza TAG
<ol>
	<li>Przygotowanie standardowych stężeń TAG
	<ol>
		<li>Przygotuj 50 ml PBT (PBS 1X, 0,05% Triton).</li>
		<li>używając probówek o pojemności 0,5 ml oraz roztworu TAG (Tabela materiałów), przygotuj 100 µL próbek pustych (tylko PBT) oraz 100 µL sześciu standardowych stężeń TAG (2 µg/µL; 1 µg/µL; 0.5 µg/µL; 0.25 µg/µL; 0.125 µg/µL; 0.0625 µg/µL) z PBT.</li>
		<li>Umieść probówki w lodzie i przystąp do rozcierania much.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieranie much
	<ol>
		<li>Wyjmij zamrożone muchy z -80 °C (krok 1.3). Przenieś probówki z muchami na lód.</li>
		<li>W pierwszej kolejności należy umieścić metalowe kulki do mielenia o średnicy 2 mm w dozowniku do płytek 96-dołkowych, a następnie za pomocą małego pędzla usunąć nadmiar kulek.</li>
		<li>Umieść 96-dołkową płytkę do rozcierania odwróconą do góry dnem na dozowniku kulek, a następnie obróć ją, aby przenieść metalowe kulki bezpośrednio do płytki. W każdym dołku powinna znaleźć się jedna kulka.</li>
		<li>Przy użyciu pipety wielokanałowej dodać 600 µL PBT do każdego dołka płytki do rozcierania z 96 dołkami.</li>
		<li>Za pomocą pęsety przenieś po 3 muchy do każdej studzienki. Wskaż genotyp, płeć i rodzaj pożywki much w każdym rzędzie/studzience 96-dołkowej płytki do rozcierania.</li>
		<li>Mocno dociśnij zakrętki do 96-dołkowej płytki do rozcierania. Na górze można nakleić taśmę, aby zapobiec wyciekom.</li>
		<li>Prawidłowo umieść płytki do rozcierania z 96 dołkami w maszynie do rozcierania. Ustaw maszynę na najwyższą prędkość i naciśnij przycisk „run”, aby rozcierać muchy przez 3 min.</li>
		<li>Po 3 min przerwać rozcieranie i przystąpić do wirowania płyty: wirować przez 15 min przy 4 0 x g, 4 °CPo wirowaniu należy ostrożnie operować płytką do rozcierania, aby uniknąć zmieszania supernatantu z osadem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie próbek i oznaczenie zawartości TAG
	<ol>
		<li>Pobierz nową płytkę do spektrofotometru z 96 dołkami. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 200 µL odczynnika TAG do każdego rzędu płytki.</li>
		<li>Załaduj 20 µL PBT do pierwszej studni w pierwszym rzędzie w celu przygotowania próby ślepej. Wymieszać, pipetując ciecz w górę i w dół. Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Załaduj 20 µL każdego rozcieńczenia standardu (z kroku 2.1.2) do pozostałych dołków w pierwszym rzędzie i wymieszać poprzez kilkukrotne pipetowanie. Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Przenieś za pomocą pipety wielokanałowej 20 µL nadpłyn z każdego rzędu płyty do rozcierania do odpowiadającego mu rzędu w płytce 96-dołkowej do spektrofotometru. Pipetować w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Unikać tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Następnie na górną część płytki 96-dołkowej nałóż folię przepuszczalną dla gazów.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 min. 
		UWAGA: Jeśli w dołkach znajdują się pęcherzyki powietrza, należy wirować płytkę przez 2 min przy 2 00 x g, aby je usunąć. Obecność pęcherzyków powietrza będzie zakłócać odczyt absorbancji.</li>
		<li>Zmierz absorbancję każdego dołka na płytce przy 50 nm, używając odpowiedniego czytnika mikroplatek. Następnie wykreśl krzywą standardową i wyznacz stężenie [µg/µL] nieznanych próbek.</li>
		<li>Aby wyznaczyć zawartość TAG w przeliczeniu na średnią masę muchy, należy zastosować następujący wzór: 
		<img alt="Wzór na zawartość trójglicerydów, równanie stężenia TAG w schemacie badań biologicznych." src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
		UWAGA: W niniejszym protokole rozdrobniono 3 muchy w 600 µL PBT; w konsekwencji średnia objętość na jedną muchę wynosi 200 µL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda Bradforda i normalizacja zawartości TAG do zawartości białka
	<ol>
		<li>Przygotuj siedem 100 µL roztworów standardowych albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (75 µg/mL; 100 µg/mL; 150 µg/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1,000 µg/mL) z PBT.</li>
		<li>Należy wziąć nową płytkę 96-dołkową i napełnić ją 200 µL odczynnika Bradforda 1X do każdego rzędu płytki.</li>
		<li>W pierwszej studzince pierwszego rzędu dodać 10 µL PBT w celu przygotowania próby ślepej. Wymieszać, pipetując ciecz w górę i w dół. Unikać tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Dodaj 10 µL każdą z rozcieńczeń standardu do pozostałych dołków pierwszego rzędu i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Przenieś za pomocą pipety wielokanałowej 10 µL nadpłyn z much z każdego rzędu płytki do rozcierania do odpowiadającego rzędu w płytce 96-dołkowej. Mieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Przykryj płytkę 96-dołkową folią przepuszczalną dla gazów.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 min. Jeśli w dołkach znajdują się pęcherzyki powietrza, wirować płytkę przez 2 min przy 2 0 x g, aby je usunąć. 
		UWAGA: Obecność pęcherzyków powietrza będzie zakłócać odczyt absorbancji.</li>
		<li>Użyj spektrofotometru do pomiaru absorbancji próby ślepej, standardów oraz nieznanych próbek przy 595 nm. Na podstawie krzywej wzorcowej wyznacz stężenia [µg/µL] próbek w każdym rzędzie.</li>
		<li>Znormalizuj zawartość TAG względem poziomu białka, stosując następujący wzór: 
		<img alt="Równanie dla zawartości TAG w stosunku do białka, stosunek [TAG]/[Białko], formuła w analizie biochemicznej." src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li>
<li>Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm">https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm</a> (2015).</li>
<li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+development+in+Drosophila+and+its+relationship+to+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates.</a> Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+melanogaster+to+map+human+cancer+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways.</a> Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).</li>
<li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).</li>
<li>Levine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+sequences+homologous+to+a+protein+coding+region+conserved+between+homeotic+genes+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila.</a> Cell. 38, 667-673 (1984).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li>
<li>Noyes, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expression+of+the+Drosophila+adipokinetic+hormone+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene.</a> Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).</li>
<li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+flies+and+men%3A+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biol. 11, 38(2013).</li>
<li>Rulifson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1120 (2002).</li>
<li>Birse, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat-diet-induced+obesity+and+heart+dysfunction+are+regulated+by+the+TOR+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila.</a> Cell Metab. 12, 533-544 (2010).</li>
<li>Musselman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-sugar+diet+produces+obesity+and+insulin+resistance+in+wild-type+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Models+Mech%22%5BJournal%5D)">A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila.</a> Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).</li>
<li>Diop, S. B., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+Insights+into+Diabetic+Cardiomyopathy+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila.</a> Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).</li>
<li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Obesity-Linked+Gene+Nudt3+Drosophila+Homolog+Aps+Is+Associated+With+Insulin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling.</a> Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).</li>
<li>Morris, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).</li>
<li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li>
<li>Erkkila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%3A+an+epidemiological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach.</a> Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).</li>
<li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+feeding+results+in+gender+specific+steatohepatitis+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation.</a> World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).</li>
<li>Wang, C. Y., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Mathews, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+Dimorphism+of+Body+Size+Is+Controlled+by+Dosage+of+the+X-Chromosomal+Gene+Myc+and+by+the+Sex-Determining+Gene+tra+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila.</a> Genetics. 205, 1215-1228 (2017).</li>
<li>Golay, A., Bobbioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dietary+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">The role of dietary fat in obesity.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).</li>
<li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1%2FSpargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Rep. 10, 1-13 (2015).</li>
<li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).</li>
<li>Palanker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+HNF4+regulates+lipid+mobilization+and+beta-oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation.</a> Cell Metab. 9, 228-239 (2009).</li>
<li>Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+high-fat+diet+in+stress+response+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of high-fat diet in stress response of Drosophila.</a> PLoS One. 7, 42587(2012).</li>
<li>Kitahara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+class+III+obesity+%28BMI+of+40-59+kg%2Fm2%29+and+mortality%3A+a+pooled+analysis+of+20+prospective+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies.</a> PLoS Med. 11, 1001673(2014).</li>
<li>Reis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).</li>
<li>Turne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercritical+fluid+extraction+and+chromatography+for+fat-soluble+vitamin+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis.</a> J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).</li>
<li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Indukcja otyłości u myszy może trwaćmiesiące 19,20. U muszek ten protokół żywienia HFD pozwala na indukcję nadmiernej akumulacji tłuszczu w ciągu kilku dni lub krócej, powodując wzrost akumulacji tłuszczu dopiero po 18 godzinach (patrz ryc. 2). Żywienie HFD opisanym protokołem zwiększa zawartość glukozy 12 i zmniejsza ekspresję lipazy Bmm i PGC-124. Jest to przeciwieństwo postu...

Żyjemy w czasach, w których otyłość i związane z nią obciążenia ekonomiczne są problemem ogólnoświatowym1. Dwóch na trzech Amerykanów ma nadwagę lub otyłość z powiązanymi patologiami serca, główną przyczyną zgonów w dorosłej populacji2. Potrzebne są nowe, skuteczne metody, aby odpowiednio zbadać składniki genetyczne i molekularne zaangażowane w regulację zespołu metabolicznego przy użyciu organizmów modelowych. Z tego powodu wybraliśmy model muszki owocowej Drosophila, ponieważ dzieli on najbardziej podstawowe procesy biologiczne ze ssakami, w tym myszami i ludźmi3,4,5,6. Genom Drosophila jest wysoce konserwatywny podczas ewolucji, ale ogólnie znacznie mniejszy, z mniejszą duplikacją genów i złożonością metaboliczną, co czyni go idealnym do zrozumienia podstawowych mechanizmów związanych z wieloma chorobami ludzkimi4,7,8. Również charakterystyczne procesy zachodzące w tkance tłuszczowej, jelitach i trzustce są reprezentowane przez muchę i pośredniczą w funkcjach regulacyjnych w metabolizmie glukozy i lipidów, na przykład podobne do ludzkich9,10,11. Co więcej, podstawowe szlaki molekularne zaangażowane w kontrolę otyłości, insulinooporności i cukrzycy u ludzi są funkcjonalnie zachowane u Drosophila melanogaster12,13,14,15,16. Podobnie jak organizmy wyższe, Drosophila ma bijące serce, które powstaje podczas rozwoju w wyniku procesów podobnych do tych u ssaków heart3,17. W związku z tym opracowanie niezawodnego protokołu żywienia HFD i wysokoprzepustowego testu TAG, dostosowanego do skutecznych celów przesiewowych z wykorzystaniem zestawu narzędzi genetycznych Drosophila, stanowią ważny środek do badania i zrozumienia podstawowych podstaw genetycznych leżących u podstaw złożonych chorób metabolicznych.
Karma HFD sama w sobie jest przygotowana ze standardowego laboratoryjnego pokarmu dla much, uzupełnionego olejem kokosowym, który składa się głównie z nasyconych kwasów tłuszczowych, o których wiadomo, że są związane z zespołem metabolicznym18. Podczas gdy wywoływanie otyłości u modeli ssaków, takich jak gryzonie, może trwać miesiące19,20, nasz zoptymalizowany protokół żywienia HFD u Drosophila skutecznie i powtarzalnie zwiększa zawartość tłuszczu w organizmie w ciągu kilku dni12,14. Protokół ten, w połączeniu z wysokoprzepustowym testem TAG, umożliwia skuteczne masowe badania przesiewowe pod kątem wpływu czynników genetycznych, wpływów środowiskowych i kandydatów na leki w celu odkrycia nowych modulatorów metabolizmu tłuszczów. W związku z tym protokoły te są prawdopodobnie istotne dla zrozumienia i/lub zwalczania otyłości i patologii związanych z otyłością u ludzi.
Protokół żywieniowy jest wszechstronny i może być stosowany do badania metabolicznych i funkcjonalnych efektów pojedynczych nasyconych lub nienasyconych kwasów tłuszczowych. Zastosowanie tego wysokoprzepustowego testu TAG nie ogranicza się do D. melanogaster, ale może być dostosowane do różnych małych organizmów modelowych z naskórkiem lub twardymi matrycami zewnątrzkomórkowymi (np. inne gatunki Drosophila, C. elegans i inne pojawiające się modelowe organizmy bezkręgowców) do pomiaru zawartości tłuszczu w różnych warunkach środowiskowych, genetycznych lub fizjologicznych, na dowolnym etapie rozwoju, dorosłość lub faza choroby metabolicznej. Test TAG opiera się na pomiarze kolorymetrycznym szeregu reakcji enzymatycznych, które rozkładają TAG na wolne kwasy tłuszczowe, glicerol, 3-fosforan glicerolu i wreszcieH2O2, który reaguje z 4-aminoantypiryną (4-AAP) i 3,5-dichloro-2-hydroksybenzenosulfonianem (3,5 DHBS) w celu wytworzenia produktu o czerwonym zabarwieniu, który jest mierzony za pomocą 96-dołkowego spektrofotometru.

<table><tbody><tr><td>Talboys Dozownik kulek / kulek</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys Homogenizator o wysokiej przepustowości</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>Kule mielące, stal nierdzewna&nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 kulek</td></tr><tr><td>Masterblock 96 Well deep Microplate</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>case 80 plates</td></tr><tr><td>Greiner&nbsp; 96-dołkowa mikropłytka flat bottom</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 płytek</td></tr><tr><td>Greiner CapMat do uszczelniania płytek wielodołkowych</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 płytek uszczelniających Zbiorniki</td></tr><tr><td>odczynników& nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>Multipipeta 1-10 ul</td></tr><tr><td>Pipeta wielofunkcyjna Thermo Scientific 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>Multipipeta 30-300ul</td></tr><tr><td>Pipeta Thermo Scientific 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>Multipipeta 10-100ul</td></tr><tr><td>Multichannel końcówki</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>do pipet 10 μl</td></tr><tr><td>Końcówki wielokanałowe</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>do pipet 200 μl</td></tr><tr><td>Końcówki wielokanałowe</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>do pipet 100 μl</td></tr><tr><td>Kleszcze&nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>Super cienkie kleszcze</td></tr><tr><td>Waga analityczna Mettler Toledo Excellence XS Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer Eksperci naukowi</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td><td>Eksperci naukowi Cole-Parmer</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa wirówka do mikropłytek</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Czytnik</td><td>Urządzenia molekularne</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Inkubator</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do trójglicerydów nieskończoności</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec trójglicerydów</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Szybki start Test białka Bradford</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x odczynnik barwnikowy</td></tr><tr><td>Olej kokosowy</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 0z słoik</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Folia przepuszczająca gaz</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 sztuk</td></tr><tr><td>filtr Papier</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>Opakowanie 100</td></tr><tr><td>fiolek</td> <td>DrosophilaGenesee Scientific</td><td>Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Szybki start Albumina surowicy bydlęcej Standard</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap Anesthetic</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-warstwowy, 4,4 x 8,4</td></tr></tbody></table>"

Żywienie dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u drosophila melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Choroby serca są główną przyczyną śmierci ludzi na całym świecie. Liczne badania wykazały silne powiązania między otyłością a nieprawidłowym funkcjonowaniem serca u ludzi, ale potrzeba więcej narzędzi i wysiłków badawczych, aby lepiej wyjaśnić związane z tym mechanizmy. Przez ponad sto lat genetycznie wysoce podatny model Drosophila odgrywał zasadniczą rolę w odkrywaniu kluczowych genów i szlaków molekularnych, które okazały się wysoce konserwatywne u różnych gatunków. Wiele procesów biologicznych i mechanizmów chorobowych jest funkcjonalnie zachowanych u muchy, takich jak rozwój (np. plan ciała, serce), rak i choroby neurodegeneracyjne. Ostatnio badania nad otyłością i wtórnymi patologiami, takimi jak choroby serca w organizmach modelowych, odegrały bardzo ważną rolę w identyfikacji kluczowych regulatorów zaangażowanych w zespół metaboliczny u ludzi.
Tutaj proponujemy wykorzystanie tego modelowego organizmu jako skutecznego narzędzia do wywoływania otyłości, tj. nadmiernego gromadzenia tłuszczu, oraz opracowanie skutecznego protokołu monitorowania zawartości tłuszczu w formie akumulacji TAGs. Oprócz wysoce konserwatywnego, ale mniej złożonego genomu, mucha ma również krótką żywotność, co pozwala na szybkie eksperymenty, w połączeniu z opłacalnością. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół żywienia dietą wysokotłuszczową (HFD) u Drosophila w celu wywołania otyłości oraz wysokoprzepustowy test triacyloglicerydu (TAG) do pomiaru związanego z tym wzrostu zawartości tłuszczu, w celu zapewnienia wysokiej powtarzalności i skuteczności w badaniach genetycznych lub chemicznych na dużą skalę. Protokoły te oferują nowe możliwości skutecznego badania mechanizmów regulacyjnych związanych z otyłością, a także zapewniają ustandaryzowaną platformę do badań nad odkrywaniem leków do szybkiego testowania wpływu kandydatów na leki na rozwój lub zapobieganie otyłości, cukrzycy i powiązanym chorobom metabolicznym.

U D. melanogaster, podobnie jak u innych gatunków, występuje dymorfizm płciowy między samcami a samicami2. Dobrze wiadomo, że samice są większe i posiadają więcej tłuszczu w odwłokach niż samce22. Aby przetestować skuteczność naszego protokołu, przeprowadziliśmy analizy TAG w celu określenia różnic w zawartości TAG między samcami a samicami standardowych laboratoryjnych much dzikich (w118). Dane wykazują, że sami...

To jest protokół żywieniowy diety wysokotłuszczowej do wywoływania otyłości u Drosophila, model do zrozumienia podstawowych mechanizmów molekularnych związanych z lipotoksycznością. Zapewnia również wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy do pomiaru akumulacji tłuszczu u Drosophila i potencjalnie innych modeli (owadów) w różnych warunkach dietetycznych, środowiskowych, genetycznych lub fizjologicznych.

Żywienie dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u Drosophila melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu żywienia dietą wysokotłuszczową oraz wysokoprzepustowego testu na triacyloglicerole jest wywołanie otyłości u organizmu modelowego, takiego jak drosophila melanogaster, oraz monitorowanie związanych z tym zmian w zawartości tłuszczu w różnych warunkach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny metabolizmu, w tym dotyczące otyłości organizmu oraz specyficznej dla organów lipotoksyczności istotnej w przypadku cukrzycy, zespołu metabolicznego, stłuszczenia wątroby i serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że nadmierna akumulacja tłuszczu u drosophila może zostać wywołana w ciągu kilku dni, a zawartość tłuszczu może zostać określona jednocześnie w ciągu około godziny.Zastosowania tej techniki rozciągają się na diagnostykę chorób metabolicznych oraz ich terapię, ponieważ protokół wysokoprzepustowy umożliwia przyspieszenie badań nad odkrywaniem leków z wykorzystaniem tego modelu systemowego. Aby rozpocząć eksperyment, należy przygotować jeden kilogram pożywki wysokotłuszczowej: odważając za pomocą wagi analitycznej 700 g gotowej pożywki dla much oraz 300 g oleju kokosowego do dwóch osobnych pojemników. Podgrzewaj każdy pojemnik oddzielnie w mikrofalówce, aż zawartość całkowicie się roztopi.Wlej roztopiony olej kokosowy do pojemnika z pożywką dla muszek i mieszaj zawartość rózgą kuchenną, aż olej połączy się z pożywką. Ponownie zważ pożywkę wysokotłuszczową. Jeśli całkowita masa jest mniejsza niż 1 kg, dodaj około 10 ml wody, aby przywrócić masę do 1 kg.Następnie wlej 10 ml dobrze wymieszanej wysokotłuszczowej karmy do każdej probówki. Przykryj karmę gazą, aby zapobiec zanieczyszczeniu, i pozostaw do ostygnięcia na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po ochłodzeniu przenieś probówki do temperatury 4 °C w celu przechowywania do czterech tygodni.Użyj CO2 do znieczulenia much. Zbierz muchy w wieku od zero do pięciu dni z fiolek i przenieś je do nowych fiolek zawierających wcześniej ogrzane zwykłe pożywienie (NF). Pozostaw muchy do dalszego starzenia przez kolejne pięć dni w temperaturze 21 stopni Celsjusza. Po upływie tych pięciu dni wyjmij z temperatury czterech stopni Celsjusza fiolki zawierające dietę wysokotłuszczową (HFD) oraz NF.Oczyścić i usunąć nadmiar płynu z boków fiolek za pomocą chusteczek, aby zapobiec przyklejaniu się much do pożywki HFD. Włożyć mały kawałek papieru filtracyjnego o wymiarach około jednego centymetra na trzy centymetry do pożywki wysokotłuszczowej w celu wchłonięcia nadmiaru cieczy. Następnie przenieść muchy na pożywkę wysokotłuszczową.Ułożyć fiolki poziomo, w temperaturze od 21 do 22 °C, na pięć dni. Po pięciu dniach przenieść muchy z grup NF i HFD do nowych fiolek bez pożywki, aby umożliwić opróżnienie jelit przez 30 minut. Następnie przystąpić do ważenia much.Dla każdego badanego genotypu i płci należy użyć wagi ultrasensytywnej, aby zapisać masę wcześniej oznakowanych, pustych probówek o pojemności 1,7 mililitra. Znieczulić i zebrać pędzlem 36 much tego samego genotypu, płci i stanu odżywienia do jednej z wcześniej zważonych probówek 1,7 mililitra. Następnie zważyć probówkę z muchami za pomocą tej samej wagi ultrasensytywnej.Muchy znajdujące się w probówkach o pojemności 1,7 mililitra zamrozić błyskawicznie, zanurzając je w ciekłym azocie na dwie minuty. Zebrać probówki i umieścić je w pudełkach. Następnie przenieść pudełka do zamrażarki w temperaturze -80 °C do przechowywania aż do momentu użycia w teście TAG.Najpierw wyjmij zamrożone muchy z zamrażarki ustawionej na -80 °C i umieść probówki w lodzie. Do dozownika kulek do 96 dołków wsyp metalowe kulki mielące o średnicy 2 mm, a następnie za pomocą małego pędzla usuń nadmiar kulek. Następnie połóż płytkę do mielenia z 96 dołkami odwróconą do góry dnem na dozowniku kulek i obróć całość, aby przenieść metalowe kulki bezpośrednio do płytki do mielenia.Należy upewnić się, że w każdej studzience znajduje się jedna kuleczka. Następnie, używając pipety wielokanałowej, należy dodać 600 µl PBT do każdego rzędu 96-dołkowej płytki do rozcierania. Za pomocą pincety należy przenieść po trzy muchy do każdej studzienki.Zaznacz genotyp, płeć oraz warunki żywieniowe much w każdym rzędzie lub dołku 96-dołkowej płytki do rozcierania. Szczelnie zamknij płytkę 96-dołkową do rozcierania za pomocą zakrętek. Naklej na górze taśmę, aby zapobiec wyciekom.Prawidłowo umieść płytki do rozcierania z 96 dołkami w maszynie do rozcierania. Ustaw maszynę na najwyższą prędkość i naciśnij przycisk start, aby rozcierać muchy przez trzy minuty. Po trzech minutach zatrzymaj proces rozcierania i przystąp do wirowania.Po wirowaniu należy ostrożnie obchodzić się z płytką do rozcierania, aby uniknąć zmieszania supernatantu z osadem. Za pomocą pipety wielokanałowej należy nanieść 200 µL odczynnika TAG do każdego rzędu nowej płytki spektrofotometrycznej z 96 dołkami. Do pierwszego dołka pierwszego rzędu należy nanieść 20 µL PBT w celu przygotowania próby ślepej.Wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Do pozostałych studzienek pierwszego rzędu nanieść po 20 µL każdego rozcieńczenia standardu i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 20 µL supernatantu z każdego rzędu płytki do homogenizacji do odpowiadającego mu rzędu w 96-dołkowej płytce do spektrofotometru.Pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Następnie przykryj płytkę 96-dołkową folią przepuszczalną dla gazów. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez dziesięć minut.Odczytaj absorbancję każdego dołka płytki przy 550 nanometrach, korzystając z kompatybilnego czytnika mikropłytek. Analizy tagów u standardowych laboratoryjnych much typu dzikiego wykazują, że samice posiadają więcej tłuszczu w całym organizmie niż samce. Dane wykazały również, że analiza jest stabilna, bez różnic w ilościowym oznaczaniu tagów w czasie oraz bez różnic zależnych od wielkości próbki biologicznej.Analizy poziomu triglicerydów (TAG) u samic much karmionych dietą wysokotłuszczową (HFD) oraz grupą kontrolną wykazały, że spożycie HFD u drosophila powoduje zwiększenie zawartości tłuszczu, który kumuluje się stopniowo w czasie. Już po 18 godzinach karmienia dietą HFD u much wywołano istotny wzrost zawartości tłuszczu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu dokładnie wyczyszczonych fiolek do karmienia dietą wysokotłuszczową.Muchy należy przechowywać w temperaturze 22°C lub niższej; ponadto, podczas pipetowania w trakcie testu znakowania nie należy mieszać supernatantu z osadem. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się metabolizmem i chorobami z nim związanymi do zgłębiania wpływu nadmiaru składników odżywczych oraz genetycznych podstaw gromadzenia tłuszczu i związanych z tym dysfunkcji narządów, takich jak lipotoksyczna kardiomiopatia u drosophila.

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje test o wysokiej przepustowości do testowania preferencji składania jaj przez Drosophila melanogaster w rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia.  Ten test zapewnia prostą, wydajną i skalowalną platformę do identyfikacji genów i składników obwodów, które kontrolują prosty proces podejmowania decyzji.

Wysokoprzepustowy test do badania preferencji składania jaj u poszczególnych Drosophila melanogaster

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Tutaj prezentujemy metodę pomiaru poziomu tłuszczu w organizmie w trzecim stadium larwalnym (L3) Drosophila melanogaster. Metoda ta wykorzystuje stosunkowo niską gęstość tkanki tłuszczowej do różnicowania larw ze zmienionymi zapasami tłuszczu. Analiza oparta na pływalności jest cennym narzędziem do szybkich, powtarzalnych i ekonomicznych badań przesiewowych.

Oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u Drosophila

Opisujemy protokół wywoływania nagradzających i nienagradzających doświadczeń u muszek owocowych (Drosophila melanogaster) przy użyciu dobrowolnego spożycia etanolu jako miary zmian w stanach nagrody.

Prosty sposób na zmierzenie zmian w zachowaniu związanym z poszukiwaniem nagrody za pomocą Drosophila melanogaster

Test CApillary FEeder (CAFE) jest prostą, niedrogą i wysoce niezawodną metodą badania mechanizmów leżących u podstaw przyjmowania pokarmu. Stosowany w połączeniu z wysoce wszechstronnym modelem genetycznym Drosophila melanogaster, stanowi potężny środek do uzyskania nowego wglądu w mechanizmy regulacyjne przyjmowania pokarmu.

Test CApillary FEeder mierzy spożycie pokarmu u Drosophila melanogaster

Ilościowe testy spożycia żywności z farbowaną żywnością dostarczają solidnych i wydajnych środków do oceny motywacji do karmienia. Połączenie testu spożycia żywności z termogenetycznymi i optogenetycznymi badaniami przesiewowymi jest skutecznym podejściem do badania obwodów neuronalnych leżących u podstaw apetytu u dorosłych Drosophila melanogaster.

Połączenie ilościowych testów spożycia pokarmu i wymuszonej aktywacji neuronów w celu zbadania apetytu u Drosophila

TreadWheel wykorzystuje ruch obrotowy, aby delikatnie wywołać ćwiczenia u dorosłych Drosophila melanogaster, wykorzystując wrodzoną, negatywną geotaksję much. Pozwala na analizę interakcji między ćwiczeniami a czynnikami, takimi jak genotyp, płeć i dieta, oraz ich wpływu na testy fizjologiczne i molekularne w celu oceny zdrowia metabolicznego.

TreadWheel: Protokół treningu interwałowego dla delikatnie indukowanych ćwiczeń u Drosophila melanogaster

Opisany tutaj jest protokół, który umożliwia kolorymetryczną kwantyfikację ilości jedzenia spożywanego w określonym przedziale czasu przez larwy Drosophila melanogaster wystawione na działanie diety o różnej jakości makroskładników. Testy te są przeprowadzane w kontekście neuronalnego badania termogenetycznego.

Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila

Przedstawiamy protokół dla testu żywieniowego dla much z dwoma opcjami. Ten test żywieniowy jest szybki i łatwy do przeprowadzenia i nadaje się nie tylko do badań laboratoryjnych na małą skalę, ale także do wysokowydajnych badań behawioralnych u much.

Szybki test preferencji żywieniowych u Drosophila

Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.

Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila

Poznaj protokół żywienia dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u Drosophila melanogaster. Ta metoda umożliwia szybkie indukowanie otyłości i pomiar akumulacji tłuszczu w celu badania lipotoksyczności oraz chorób metabolicznych.

Żywienie dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów