Name: Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem CMAH. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę oznaczania kwasów sjalowych w wątrobie i mleku myszy z nokautem CMAH za pomocą HPLC. Technika ta pozwala analizować poziomy Neu5Ac i Neu5Gc u myszy heterozygotycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (granty o numerach 31471703, A0201300537 i 31671854 dla J.V. i L.L.) oraz Plan 100 Zagranicznych Talentów (grant numer JSB2014012 dla J.V.).

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Rolniczego w Nankinie zgodnie z Krajowymi Wytycznymi dla Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych (Ministerstwo Nauki i Technologii, PR Chin, 2006) dla zwierząt trzymanych w obiekcie SPF (ID pozwolenia: SYXK-J-2011-0037).
1. Model myszy Cmah Knock-out
<ol>
	<li>Użyj myszy C57Bl/6 typu dzikiego z Centrum Medycyny Porównawczej Uniwersytetu w Yangzhou (Chiny). 
	UWAGA: Myszy z nokautem Cmah zostały wygenerowane na podstawie informacji dostarczonych z poprzednich badań Cmah knock-out17,19 i uzyskane komercyjnie przy użyciu strategii CRISPR/Cas9<sup="xref">20 poprzez usunięcie 92 par zasad z eksonu 6 genu Cmah, który jest również usunięty w ludzkim genie CMAH19. Myszy z dodatnim F0 (2 osobniki) skrzyżowano z myszami typu dzikiego w celu uzyskania heterozygotycznych myszy F1. Po skrzyżowaniu heterozygotycznych myszy F1 (5 osobników), z powodzeniem uzyskano homozygotyczne myszy F2 z nokautem Cmah (3 osobniki).</li>
	<li>Przeprowadź genotypowanie myszy przy użyciu genomowego DNA zgodnie z metodą przedstawioną przez Zangala21 przy użyciu komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA.
	<ol>
		<li>Amplifikuj odpowiedni fragment DNA genu Cmah przy użyciu komercyjnej polimerazy DNA i pary starterów 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3' i 5'tttaaaatgtcccgggggagaagc3'. Przeprowadzić amplifikację genu przy użyciu 34 cykli PCR składających się z denaturacji w temperaturze 94 °C przez 40 s, wyżarzania w temperaturze 63 °C przez 40 s i wydłużenia w temperaturze 72 °C przez 1 minutę.</li>
		<li>Wizualizacja produktów PCR na 1% żelu agarozowym. Należy obserwować pojedynczy prążek (0,5 kb) dla osobnika typu dzikiego, podwójny prążek (0,4 i 0,5 kb) dla heterozygotycznego osobnika z nokautem i pojedynczy prążek (0,4 kb) dla homozygotycznego osobnika z nokautem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Zbierz mleko myszy przy użyciu protokołu opisanego przez Willinghama i wsp.22.</li>
	<li>Zbierz tkankę wątroby myszy za pomocą protokołu opisanego przez Gonçalvesa i wsp.23 i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Izolacja kwasów sjalowych z mleka
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml 2 M roztworu kwasu octowego, dodając 12 ml lodowatego kwasu octowego do 88 ml destylowanegoH2O.</li>
	<li>Przenieść 50 μl mleka do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 1,2 ml przygotowanego wodnego roztworu kwasu octowego.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę przez 4 godziny w temperaturze 80 °C i odwirowywać próbkę przy 14 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieś górne 1 000 μl supernatantu do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i usuń rozpuszczalnik przez odparowanie odśrodkowe w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia (w zależności od dołączonej pompy próżniowej zajmie to 4 - 20 godzin). Ponownie rozpuścić próbkę w 500 μl destylowanegoH2O.</li>
	<li>Przygotować kolumnę do wymiany mikroanionów. Ten etap w szczególności wzbogaci związki anionowe i usunie związki kationowe i obojętne z próbek mleka i wątroby, a tym samym zwiększy selektywność fluorogenicznego środka znakującego OPD do derywatyzacji kwasu sjalowego.
	<ol>
		<li>Przenieść dla każdej próbki 200 mg żywicy anionowymiennej (Dowex 1X8) do pustych probówek kolumnowych o pojemności 3 ml z dołączonym zaworem odcinającym.</li>
		<li>Dodać 2 ml wodnego roztworu kwasu octowego przygotowanego w kroku 3.1 w celu zastąpienia jonów chlorkowych w żywicy jonami octanowymi. Zamknij kurek, gdy tylko rozpuszczalnik dotrze do górnej części żywicy.</li>
		<li>Delikatnie dodaj 2 ml destylowanegoH2O, otwórz zawór odcinający i zatrzymaj przepływ, gdy tylko większość rozpuszczalnika dotrze do górnej części żywicy. Upewnij się, że żywica jest zawsze pokryta rozpuszczalnikiem.</li>
		<li>Przemyć kolumnę z żywicą jeszcze dwa razy 2 ml destylowanegoH2Ow celu usunięcia nadmiaru octanu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść otrzymane 500 μl rozpuszczalnika próbki z kroku 3.4 na kolumnę z żywicą i odrzucić przepływ. Delikatnie przemyć żywicę 2 ml destylowanegoH2O. Aniony próbki próbki z żywicy należy wypłukać za pomocą 1 ml 50 mM roztworu octanu amonu (386 mg octanu amonu rozpuszczonego w 100 ml destylowanegoH2O) do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie odśrodkowe w temperaturze pokojowej do wyschnięcia. 
	UWAGA: Suche próbki można przechowywać w temperaturze 4-6 °C przez okres do 12 miesięcy.</li>
</ol>
4. Izolacja kwasów sjalowych z tkanki wątroby
<ol>
	<li>Delikatnie rozmrozić 20 - 50 mg wątroby myszy i przenieść ją do młynka do tkanek Dounce (1 ml lub 2 ml objętości). Dodać 1,2 ml wodnego roztworu kwasu octowego przygotowanego w kroku 3.1 i homogenizować tkankę przez delikatne ścinanie przez 10 s. Otrzymaną zawiesinę przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wykonaj kroki od 3.3 do 3.6. 
	UWAGA: Suche próbki można przechowywać w temperaturze 4-6 °C przez okres do 12 miesięcy.</li>
</ol>
5. Przygotowanie mieszanego wzorca kwasu sjalowego
<ol>
	<li>Odważyć od 5 do 8 mg kwasu N-acetyloneuraminowego na wadze analitycznej do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zanotować dokładną masę i dodać 164 μl destylowanegoH2Ona każdy mg (tj. jeśli masa Neu5Ac wynosi 7,2 mg, dodać 7,2 x 164 = 1,181 μL destylowanegoH2O). W ten sposób uzyskuje się roztwór podstawowy Neu5Ac o masie 20 mM, który można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 12 miesięcy.</li>
	<li>Otrzymać kwas N-glikolyloneuraminowy w mniejszych ilościach po umiarkowanej cenie, na przykład w podwielokrotnościach 1 mg. Dodać 154 μL destylowanegoH2Obezpośrednio do związku w celu uzyskania ~20 mM roztworu podstawowego Neu5Gc. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 12 miesięcy.</li>
	<li>Połączyć 5 μl z każdego roztworu podstawowego z kroków 5.1 i 5.2 do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie odśrodkowe w temperaturze pokojowej do sucha. 
	UWAGA: Mieszany wzorzec kwasu sjalowego można przechowywać w temperaturze 4 - 6 °C przez okres do 12 miesięcy.</li>
</ol>
6. Derywatyzacja fluorescencyjna kwasów sjalowych
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml roztworu OPD, składającego się ze 100 mg o-fenylenodiaminy i 208 mg wodorosiarczynu sodu w 10 ml destylowanegoH2O.</li>
	<li>Dodać 20 μl roztworu OPD do próbek kwasu sjalowego pochodzących z mleka myszy (krok 3), wątroby myszy (etap 4) lub wzorca mieszanego kwasu sjalowego (etap 5). Wirować energicznie przez 30 s i inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 80 °C w ciemności (tj. owinąć mikroprobówki folią aluminiową).</li>
	<li>Pozostawić próbki do ostygnięcia przez 5 minut, dodać 80 μl destylowanegoH2Oi odwirować probówki o stężeniu 14 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieść 80 μl z supernatantu do 300 μl fiolki HPLC o wysokim stopniu odzysku. Derywatyzowane próbki kwasu sjalowego można przechowywać w temperaturze 4 - 6 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
</ol>
7. Analiza HPLC pochodnych kwasu sjalowego
<ol>
	<li>Analizuj próbki za pomocą standardowego systemu HPLC podłączonego do detektora fluorescencyjnego online.</li>
	<li>Do analizy należy użyć kolumny C18 z odwróconą fazą o standardowych wymiarach 250 mm długości i 4,6 mm średnicy.</li>
	<li>Przygotować rozpuszczalnik A, rozcieńczając 200 ml roztworu podstawowego 800 ml wody klasy LCMS (LCMS - chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas). Sam roztwór podstawowy można przygotować w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Dodać 46 g kwasu mrówkowego do 800 mlH2Oklasy LCMS.</li>
		<li>Doprowadzić pH do 4,5, dodając kroplami roztwór wodorotlenku amonu (puriss. p.a.).</li>
		<li>Przenieść rozpuszczalnik do cylindra miarowego i napełnić do 1 000 ml pojemnikiem H2Oklasy LCMS. Ten roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze 4 - 6 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku rozpuszczalnika B należy użyć acetonitrylu klasy LCMS.</li>
	<li>Rozdzielić pochodne kwasów sjalowych przy natężeniu przepływu 1 ml/min z następującą elucją:
	<ol>
		<li>Zacznij od dodania 10% rozpuszczalnika B zmieszanego z rozpuszczalnikiem A.</li>
		<li>Od 0 min do 15 min stopniowo zwiększaj udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym do 60%.</li>
		<li>Od 15 min do 16 min szybko zwiększ udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym od 60% do 90%. To inicjuje mycie kolumny HPLC.</li>
		<li>W celu dalszego przepłukania kolumny HPLC należy utrzymać poziom rozpuszczalnika B na poziomie 90% w okresie od 16 min do 18 min, a następnie stopniowo ponownie zmniejszać poziom rozpuszczalnika B do 10% między 18 min a 19 min.</li>
		<li>Ponownie wyrównać kolumnę HPLC do warunków początkowych 10% B między 19 a 24 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 μl próbki do systemu HPLC.</li>
	<li>Monitorować eluenty za pomocą detektora fluorescencji o długości fali wzbudzenia/emisji 373/448 nm, a derywatyzowanych kwasów sjalowych można oczekiwać w przybliżonych czasach retencji 9 min (dla Neu5Gc-OPD) i 10 min (dla Neu5Ac-OPD).</li>
	<li>Obliczyć względną ilość Neu5Gc (FNeu5Gc) z obszarów pików fluorescencji Neu5Ac (ANeu5Ac) i Neu5Gc (ANeu5Gc) w następujący sposób: FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). W przypadku próbek mleka i wątroby od homozygotycznej myszy z nokautem Cmah FNeu5Gc powinien wynosić 0%, podczas gdy wartości dla FNeu5Gc myszy heterozygotycznych i dzikich mogą się znacznie różnić w zależności od wieku myszy i rodzaju tkanki (od 2% do >90%), przy oczekiwanym marginesie błędu ±12%.</li>
</ol>

<ol><li>Lamari, F. N., Karamanos, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+methods+for+sialic+acids+and+critical+evaluation+of+their+biologic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).</li>
<li>Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+the+absence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans.</a> J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).</li>
<li>Chou, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+human+CMP-sialic+acid+hydroxylase+occurred+after+the+Homo-Pan+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).</li>
<li>Rehan, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Glycomics+of+Livestock%3A+Discovery+of+Highly+Sensitive+Serum+Biomarkers+Indicating+an+Environmental+Stress+Affecting+Immune+Responses+and+Productivity+of+Holstein+Dairy+Cows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows.</a> J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).</li>
<li>Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ganglioside+and+glycoprotein+sialic+acid+in+breastfed+compared+with+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants.</a> Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).</li>
<li>Yao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sialic+acids+in+red+meat+by+UPLC-FLD+using+indoxylsialosides+as+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards.</a> Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+natural+human+antibodies+against+a+nonhuman+sialic+acid+that+metabolically+incorporates+into+activated+and+malignant+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells.</a> J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).</li>
<li>Byres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+non-human+glycan+mediates+human+susceptibility+to+a+bacterial+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin.</a> Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).</li>
<li>Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+human-specific+mechanism+for+diet+and+antibody-mediated+inflammation+in+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Svennerholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+sialic+acids.+II.+A+colorimetric+resorcinol-hydrochloric+acid+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method.</a> Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiobarbituric+acid+assay+of+sialic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The thiobarbituric acid assay of sialic acids.</a> J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).</li>
<li>Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+sialic+acids+by+gas+chromatography+of+the+mannosamine+derivatives+released+by+the+action+of+N-acetylneuraminate+lyase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase.</a> J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).</li>
<li>Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+sialic+acids+for+stabilization+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+and+concomitant+differentiation+of+alpha%282+--%3E+3%29-+and+alpha%282+--%3E+6%29-isomers%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).</li>
<li>Hurum, D. C., Rohrer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+sialic+acids+in+infant+formula+by+chromatographic+methods%3A+a+comparison+of+high-performance+anion-exchange+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection+and+ultra-high-performance+liquid+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods.</a> J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography+method+for+sialic+acid+determination%3A+an+internal+standard+method+and+its+application+to+sialic+acid+analysis+of+human+apolipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22E.+Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein.</a> E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+Center+Marker+GL7+Probes+Activation-Dependent+Repression+of+N-Glycolylneuraminic+Acid%2C+a+Sialic+Acid+Species+Involved+in+the+Negative+Modulation+of+B-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).</li>
<li>Manzi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+liquid+chromatography+of+sialic+acids+on+a+pellicular+resin+anion-exchange+column+with+pulsed+amperometric+detection%3A+a+comparison+with+six+other+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems.</a> Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).</li>
<li>Hedlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-glycolylneuraminic+acid+deficiency+in+mice%3A+implications+for+human+biology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution.</a> Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Zangala, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genomic+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of genomic DNA from mouse tails.</a> J Vis Exp. (6), e246(2007).</li>
<li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves%27+muntjac+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar J. 6, 169(2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół pozwala na fenotypową ocenę homozygotycznych myszy z nokautem Cmah poprzez analizę i ilościowe określenie względnych ilości Neu5Gc w próbkach mleka i wątroby. Analizę przeprowadzono przy użyciu standardowego zestawu HPLC z detekcją fluorescencyjną. Najbardziej krytycznym etapem tej procedury jest przygotowanie kolumn wymiany anionowej i wykonanie chromatografii anionowymiennej; Prawidłowe osadzenie żywicy i zebranie odpowiednich frakcji płuczących i elucyjnych wymag...

Kwas N-acetyloneuraminowy (Neu5Ac) i kwas N-glikolylneuraminowy (Neu5Gc) są najczęściej występującymi kwasami sjalowymi u większości ssaków1. Chociaż ludzie są zdolni do endogennej syntezy Neu5Ac, nie są zdolni do wytwarzania Neu5Gc z powodu pierwotnej delecji eksonu w genie CMAH kodującym hydroksylazę CMP-Neu5Ac2,3. Jednak produkty spożywcze pochodzenia zwierzęcego mogą być dietetycznymi źródłami Neu5Gc4,5,6, co prowadzi do produkcji przeciwciał anty-Neu5Gc, a tym samym wywołuje odpowiedź immunologiczną w kierunku Neu5Gc7. Podejrzewa się, że ten dietetyczny wpływ Neu5Gc przyczynia się do przewlekłych stanów zapalnych i różnych innych chorób8,9,10. Aby kompleksowo zrozumieć wpływ Neu5Gc na ludzi, wysoce pożądany jest model zwierzęcy do systematycznego badania wpływu kwasów sjalowych przenoszonych przez żywność. Chociaż protokoły oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do analizy myszy z nokautem są dobrze ugruntowane i stanowią wygodny sposób oceny genotypu, funkcjonalna analiza fenotypu na poziomie metabolicznym wymaga bardziej szczegółowych metod analizy. Fenotyp mysiego modelu z nokautem Cmah można ocenić, izolując i analizując skład kwasów sjalowych w próbkach wątroby lub mleka. Kilka metod wykrywania kwasów sjalowych w tkankach zwierzęcych zostało wcześniej opisanych: reakcja kwasów sjalowych z rezorcynolem11 lub kwasem tiobarbiturowym12 powoduje powstanie produktu chromoforowego i może być łatwo analizowana za pomocą zestawu opartego na czytniku płytek, ale można określić tylko całkowitą zawartość kwasu sjalowego. Alternatywnie, analizę kwasów sjalowych opisano również za pomocą chromatografii gazowej13, spektrometrii mas MALDI-ToF14 lub metod amperometrycznych15. Jednak najczęściej stosowane metody analizy kwasu sjalowego opierają się na uwalnianiu hydrolitycznym, a następnie derywatyzacji fluorescencyjnej, a następnie wysokosprawnej chromatografii cieczowej16,17,18.

<table><tbody><tr><td>< silny> Chemikalia: < / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kwas N-acetyloneuraminowy</td><td>Sigma</td><td>A0812</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-glikolylneuraminowy</td><td>Sigma</td><td>50644</td><td>1 mg podwielokrotność powinna być wystarczająca</td></tr><tr><td>o-fenylenodiamina</td><td>Sigma</td><td>694975</td><td></td></tr><tr><td>Wodorosiarczyn sodu</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>75234</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia/Materiały:</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL probówki SPE</td><td>Supelco</td><td>Sigma 57024</td><td>puste kolumny ekstrakcyjne do fazy stałej</td></tr><tr><td>Króciec Luer</td><td>Sigma</td><td>S7396</td><td>do zatrzymywania przepływu rurki SPE</td></tr><tr><td>Dowex 1X8</td><td>Dow Chemicals</td><td>Sigma 44340</td><td>200 - 400 mesh</td></tr><tr><td>Młynek do tkanek Dounce</td><td>Sigma</td><td>D8938</td><td>ciasne dopasowanie</td></tr><tr><td><mocne>Analiza HPLC: < / mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fiolka HPLC o wysokim odzysku</td><td>Agilent Technologies</td><td>#5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>System HPLC</td> Detektor fluorescencji <td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>do HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs HPLC Kolumna</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Phenomenex</td><td>Hyperclone ODS</td><td>250 x 4,6 mm</td></tr><tr><td>LCMS klasy H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS Acetonitryl</td><td>Merck Millipore</td><td>#100029</td><td>Hipergrade</td></tr> roztwór <tr><td>wodorotlenku amonu</td><td>Fluka</td><td>#44273</td><td>puriss. P.a.</td></tr></tbody></table>

oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem cmah.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (hydroksylaza kwasu monofosforanu cytydyny-N-acetyloneuraminy) jest odpowiedzialna za utlenianie kwasów cytydynomonofosforanu N-acetyloneuraminy u ssaków. Jednak ludzie nie mogą utleniać kwasu N-acetyleneuraminowego monofosforanu cytydyny do kwasu N-glikolyloneuraminowego monofosforanu cytydyny z powodu pierwotnej delecji eksonu genu CMAH. Aby bardziej szczegółowo zrozumieć skutki i implikacje braku aktywności CMAH, model nokautu Cmah u myszy jest przedmiotem dużego zainteresowania w badaniach podstawowych i stosowanych. Metoda analizy mająca na celu określenie fenotypu tego modelu myszy jest szczegółowo opisana w niniejszym dokumencie i opiera się na wykrywaniu zarówno kwasu N-acetyloneuraminowego, jak i kwasu N-glikolilenuraminowego w wątrobie i mleku myszy typu dzikiego i myszy z nokautem Camah. Endogenne kwasy sjalowe są uwalniane i derywatyzowane za pomocą o-fenylenodiaminy w celu wytworzenia pochodnych fluorogennych, które można następnie analizować za pomocą HPLC. Przedstawiony protokół może być również stosowany do analizy próbek mleka i tkanek różnego innego pochodzenia, a także może być przydatny do badania skutków odżywczych i zdrowotnych kwasu N-glikolyloneuraminowego.

Schematyczny przegląd opisanego procesu analizy przedstawiono na Rysunku 1; obejmuje on izolację kwasów sialowych z próbek mleka i wątroby myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu Cmah, a także fluoryzacyjną derywatyzację i analizę HPLC tych składników. Rysunek 2 i Rysunek 3 przedstawiają reprezentatywne chromatogramy HPLC derywatyzowanych kwasów sialowych z próbek mleka i wątroby mysz...

Opisujemy opartą na HPLC metodę oznaczania kwasu N-acetyloneuraminowego i kwasu N-glikolilenuraminowego w wątrobie i mleku myszy.

Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem CMAH.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest wykrycie kwasu N-acetylneuraminowego i kwasu N-glikolylneuraminowego w wątrobie i mleku myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu CMAH przy użyciu analizy HPLC. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania z zakresu glikonauki, a konkretnie w kwestii wpływu genotypów modeli mysich CMAH na rzeczywistą zawartość kwasów sjalowych u tych zwierząt. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z badaniami genetycznymi jest możliwość określenia względnych poziomów kwasów sjalowych również u myszy heterozygotycznych.Metodę tę będą oceniać Cui Cao i Wang Wenjiao, dwaj doktoranci z naszego laboratorium. Procedurę należy rozpocząć od pobrania mleka i tkanki wątroby myszy z linii CMAH knock-out, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wyizolować kwasy sialowe z mleka, należy przenieść 50 µL mleka do probówki wirówki o pojemności 1,5 ml i dodać 1,2 ml przygotowanego wodnego roztworu kwasu octowego.Aby wyizolować kwasy sjalowe z tkanki wątroby, należy powoli rozmrozić od 20 do 50 mg wątroby mysiej i przenieść ją do homogenizatora Dounce. Należy dodać 1,2 ml wodnego roztworu kwasu octowego i homogenizować tkankę poprzez delikatne ścinanie przez 10 sek

determination-sialic-acids-liver-milk-samples-wild-type-cmah-knock

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niefiksowane mrożone próbki tkanek zatopione w medium OCT (Optimal Cutting Temperature) mogą być wykorzystane do badania naturalnego rozkładu i glikozylacji wydzielonego śluzu. W tym podejściu przetwarzanie tkanek jest minimalne, co pozwala na zachowanie naturalnej postaci glikolipidów, mucyn i epitopów glikanowych. Przekroje tkankowe można analizować za pomocą immunohistochemii z wykorzystaniem detekcji fluorescencyjnej lub chromogennej.

Wykorzystanie niefiksowanych, zamrożonych tkanek do badania naturalnego rozkładu mucyn

W tym filmie demonstrujemy wykrywanie kwasów sjalowych, kwasu N-acetyloneuraminowego i kwasu N-glikolylneuraminowego, za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, HPLC, po derywatyzacji odpowiednim odczynnikiem do znakowania fluorescencyjnego, aby pomóc w wykrywaniu fluorescencji.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami: solidna metoda oznaczania ilościowego znakowanych fluorescencyjnie i derywatyzowanych kwasów sjalowych wyizolowanych z wątroby myszy

Pobieranie mleka z modeli zwierzęcych ułatwia różne ścieżki badań: zrozumienie odporności biernej, identyfikację patogenów odpowiedzialnych za transgeniczne przenoszenie i, dzięki wykorzystaniu transgenicznych myszy, nawet komercyjną produkcję białek znajdujących się w ludzkim mleku matki. Tutaj ilustrujemy prostą metodę zbierania mleka u myszy i jeleni muntjac Reevesa.

Metody zbierania mleka dla myszy i jelenia Muntjac Reevesa

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Kwas sjalowy to typowa jednostka monosacharydowa występująca w glikokoniugatach. Bierze udział w wielu interakcjach molekularnych i komórkowych. W artykule przedstawiono metodę modyfikacji ekspresji kwasu sjalowego na powierzchni komórki za pomocą glikoinżynierii metabolicznej z pochodnymi N-acetylmannosaminy.

Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

Niedoczynność gruczołów ślinowych jest częstą konsekwencją chorób autoimmunologicznych i radioterapii. Powtarzalna ocena funkcji gruczołów ślinowych w mysich modelach tych chorób jest wyzwaniem technicznym. W tym miejscu opisano prostą metodę dokładnego i powtarzalnego pomiaru produkcji śliny u myszy.

Metoda pomiaru funkcji gruczołów ślinowych u myszy

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania wpływu unieważnienia genów związanych z degustacją na odpowiedzi immunologiczne w mysim modelu IBD wywołanym siarczanem dekstranu sodu (DSS).

Wpływ zniesienia białka sygnalizującego smak na stan zapalny jelit w mysim modelu nieswoistego zapalenia jelit

Opisujemy model immunizacji in vivo, translacyjnego zapalenia wątroby u myszy BALB/c, który może być wykorzystany do badania patogenezy indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby, w tym różnic płci obserwowanych w tej chorobie. Opiszemy, w jaki sposób model ten demonstruje powtarzalne analizy przy użyciu technik eksperymentalnych in vivo i in vitro.

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Ten artykuł opisuje, jak złożyć urządzenie, które może być używane do zbierania mleka od myszy laboratoryjnych. To urządzenie jest niedrogie, przenośne i umożliwia pobranie 0,1–0,5 ml mleka przez jedną przeszkoloną osobę. Dołączony jest również szczegółowy protokół doju.

Skuteczna jednoosobowa technika pobierania próbek mleka od myszy laboratoryjnych

Poznaj metodę oznaczania kwasów sjalowych w wątrobie i mleku myszy z nokautem CMAH za pomocą HPLC. Technika ta pozwala analizować poziomy Neu5Ac i Neu5Gc u myszy heterozygotycznych.

Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem CMAH.

Przeglądaj więcej filmów