Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem CMAH.

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest wykrycie kwasu N-acetylneuraminowego i kwasu N-glikolylneuraminowego w wątrobie i mleku myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu CMAH przy użyciu analizy HPLC. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania z zakresu glikonauki, a konkretnie w kwestii wpływu genotypów modeli mysich CMAH na rzeczywistą zawartość kwasów sjalowych u tych zwierząt. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z badaniami genetycznymi jest możliwość określenia względnych poziomów kwasów sjalowych również u myszy heterozygotycznych.

Metodę tę będą oceniać Cui Cao i Wang Wenjiao, dwaj doktoranci z naszego laboratorium. Procedurę należy rozpocząć od pobrania mleka i tkanki wątroby myszy z linii CMAH knock-out, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wyizolować kwasy sialowe z mleka, należy przenieść 50 µL mleka do probówki wirówki o pojemności 1,5 ml i dodać 1,2 ml przygotowanego wodnego roztworu kwasu octowego.

Aby wyizolować kwasy sjalowe z tkanki wątroby, należy powoli rozmrozić od 20 do 50 mg wątroby mysiej i przenieść ją do homogenizatora Dounce. Należy dodać 1,2 ml wodnego roztworu kwasu octowego i homogenizować tkankę poprzez delikatne ścinanie przez 10 sekund. Powstałą zawiesinę należy przenieść do probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml.

Następnie inkubuj zakwaszone mleko lub zawiesinę tkankową przez cztery godziny w temperaturze 80 °C. Potem odwiruj próbkę z prędkością 14 000 ×g przez 10 minut. Przenieś górne 1000 µL supernatantu do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.

Usuń rozpuszczalnik poprzez odparowanie wirowaniem w temperaturze pokojowej do całkowitego wysuszenia. Ponownie rozpuść próbkę w 500 µL wody destylowanej. Następnie przygotuj mikrokolumnę do wymiany anionowej, przenosząc 200 mg żywicy wymiany anionowej na każdą próbkę do pustych probówek o pojemności 3 ml wyposażonych w kranik.

Dodaj 2 mililitrów wodnego roztworu kwasu octowego, aby zastąpić jony chlorkowe w żywicy jonami octanowymi. Zamknij kurek natychmiast po tym, jak rozpuszczalnik dotrze do górnej krawędzi żywicy. Ostrożnie dodaj 2 mililitrów wody destylowanej i otwórz kurek.

Zatrzymaj przepływ, gdy tylko większość rozpuszczalnika dotrze do górnej krawędzi żywicy. Upewnij się, że żywica jest przez cały czas przykryta rozpuszczalnikiem. Następnie przemyj kolumnę z żywicą jeszcze dwukrotnie, używając po dwa mililitry wody destylowanej, aby usunąć nadmiar octanu.

Przenieś otrzymane 500 µL rozpuszczalnika z próbką na kolumnę z żywicą i odrzuć frakcję przepływową. Delikatnie przemyj żywicę 2 mL wody destylowanej. Eluuj aniony z próbki z żywicy, używając 1 mL 50 mM roztworu octanu amonu, do probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL.

Usuń rozpuszczalnik poprzez odparowanie w wirowce w temperaturze pokojowej do suchości. Odważ od 5 do 8 miligramów kwasu N-acetyloneuraminowego na wadze analitycznej do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Zanotuj dokładną wagę i dodaj 164 mikrolitrów wody destylowanej na każdy miligram.

Nabyć kwas N-glikolilo-neuraminowy w mniejszych ilościach i w umiarkowanej cenie, na przykład w aliquotach 1 milligram. Dodać 154 microliters wody destylowanej bezpośrednio do związku, aby otrzymać roztwór zapasowy Neu5Gc o stężeniu około 20 millimolar. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 milliliter.

Ten roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 12 miesięcy. Połączyć 5 µL każdego roztworu zapasowego w nowej probówce wirówki o pojemności 1,5 ml. Następnie odparować rozpuszczalnik do suchości za pomocą ewaporatora wirówkowego w temperaturze pokojowej.

Dodaj 20 µL roztworu OPD do próbek kwasu sialowego pochodzących z mleka mysiego, wątroby mysiej lub zmieszanego standardu kwasu sialowego. Intensywnie wymieszaj próbki w wstrząsarze wierzchłowym przez 30 s. Następnie inkubuj próbki przez cztery godziny w temperaturze 80 °C w ciemności.

Po odstawieniu próbek do ochłodzenia przez pięć minut, należy dodać 80 µL wody destylowanej. Następnie probówki należy odwirować przy 14 000 ×g przez jedną minutę. Potem należy przenieść 80 µL nadkładu do fiolki HPLC o wysokiej wydowiskowaniu o pojemności 300 µL.

Próbki zderywatyzowanego kwasu sialowego można przechowywać w temperaturze od czterech do sześciu stopni Celsjusza przez maksymalnie jeden tydzień. Próbki należy analizować przy użyciu standardowego systemu HPLC połączonego z detektorem fluorescencyjnym online. Do analizy należy zastosować kolumnę C18 w fazie odwróconej o długości 250 mm i średnicy 4,6 mm.

Po przygotowaniu rozpuszczalnika A i rozpuszczalnika B oraz skonfigurowaniu przebiegu HPLC zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole, wstrzyknij 50 µL próbki do systemu HPLC. Monitoruj eluent, używając detektora fluorescencji z długością fali wzbudzenia 373 nm i długością fali emisji 448 nm. Na koniec oblicz względną zawartość Neu5Gc zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne chromatogramy HPLC dla kwasów sjalowych znakowanych fluorescencyjnie z próbek mleka, pochodzących od myszy z homozygotycznym knock-outem CMAH oraz myszy z heterozygotycznym knock-outem CMAH. Przedstawiono również myszy typu dzikiego. Analogicznie, pokazano tutaj chromatogramy kwasów sjalowych znakowanych fluorescencyjnie, pochodzących z wątroby myszy.

Porównanie względnych ilości Neu5Gc wykazuje, że myszy z homozygotycznym knock-outem CMAH nie zawierają Neu5Gc, podczas gdy myszy z heterozygotycznym knock-outem CMAH oraz myszy typu dzikiego zawierają od 10 do 75% Neu5Gc. Po opanowaniu metody przygotowanie próbek zajmuje do ośmiu godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Próbki mogą być następnie analizowane przez noc metodą automatycznego próbkowania HPLC.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby izolację kwasu sialowego i procedurę derywatyzacji przeprowadzić tego samego dnia. Po zakończeniu procedury można zastosować inne metody, takie jak analiza spektrometrią mas, w celu potwierdzenia charakteru uzyskanych sygnałów fluorescencyjnych. Opracowanie tej techniki pozwala badaczom na analizę rozkładu kwasu sialowego w próbkach biologicznych.

Należy pamiętać, że praca z zagęszczonym kwasem octowym i kwasem mrówkowym może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odzieży ochronnej.