Name: Pozioma elektroforeza żelowa w celu lepszego wykrywania kompleksów białko-RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj metodę poziomej elektroforezy żelowej do analizy interakcji białko-RNA w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia jednoczesne badanie 48 próbek i precyzyjne monitorowanie tworzenia się kompleksów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Laurze Vanderploeg za przygotowanie figur. Praca w laboratorium Arkuszy jest wspierana przez 1050395 grantowe NSF i grant NIH (R21HD076828). Prace w laboratorium Ryder są wspierane przez granty NIH R01GM117237 i R01GM117008. Megan Dowdle jest wspierana przez stypendium SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship za pośrednictwem University of Wisconsin-Madison Graduate School oraz Biotechnology Training Program za pośrednictwem National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (T32GM008349).

1. Przygotowanie poziomego natywnego żelu poliakrylamidowego4.
<ol>
	<li>Przygotowanie potrzebnych materiałów.
	<ol>
		<li>Do poziomego aparatu żelowego użyj pudełka żelowego (37 cm x 24 cm) z tacą o wymiarach 27 cm x 21 cm i pojemnością na dwa 24-dołkowe grzebienie. Ta konfiguracja zapewnia łącznie 48 próbek, które mogą być analizowane jednocześnie.</li>
		<li>Przygotuj następujące odczynniki: 40% Acrylamide-Bis 19:1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED i 10% APS (nadsiarczan amonu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie 10% natywnego żelu akrylowego.
	<ol>
		<li>W kolbie o pojemności 500 ml dodaj 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% akrylamidu i wodę do końcowej objętości 400 ml.</li>
		<li>Dodać 4 ml 10% APS i 400 μl TEMED. Dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Wlej mieszaninę do poziomej tacki odlewniczej i pozwól żelowi polimeryzować przez 30 minut. Żel będzie miał grubość około 2 cm. 
		UWAGA: Żele można odlewać w dygestorium, aby przyspieszyć polimeryzację. Po polimeryzacji na wierzchu żelu pozostanie cienka warstwa płynu.</li>
		<li>Wylej płyn i spłucz działającym buforem. Ostrożnie wyjmij grzebień (grzebienie) i przepłucz studzienki bieżącym buforem za pomocą strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bufora uruchomieniowego.
	<ol>
		<li>Przygotuj 2 l bufora do biegania 1x TBE do pudełka na żel. Rozcieńczyć 400 ml 5XTBE w 1600 ml i wymieszać. Umieść 1x bufor TBE w chłodni do ostygnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępne uruchamianie żelu
	<ol>
		<li>Dodaj 2 l zimnego buforu do pudełka z żelem i włóż żel.</li>
		<li>Żel należy wstępnie uruchomić pod napięciem 120 V przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w chłodni. W tym czasie należy przygotować reakcję wiązania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Reakcja wiązania8
<ol>
	<li>2.1.Przygotować następujące składniki reakcji. 
	20 mM naziemna telewizja cyfrowa 
	10 mM BSA 
	10 mM drożdżowych tRNA 
	5X bufor wiążący (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20) 
	100 nM znakowane fluoresceiną RNA zakupione komercyjnie 
	Skoncentrowane białko Bicaudal-C 
	50% glicerol w H2O z powłoką DEPC
	H2O z powłoką DEPC</li>
	<li>Zmontować składniki reakcji wiązania w probówce mikrowirówki wolnej od RNazy.
	<ol>
		<li>Do probówki dodać 5 μl 10 mM BSA, 5 μL 20 mM DTT, 5 μL 10 mM tRNA drożdży, 10 μL 5x buforu wiążącego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać białko do końcowego stężenia 250 nM w 50 μl. Dodać wodę do końcowej objętości 45 μl.</li>
	<li>Dodać 5 μl znakowanego fluorescencyjnie substratu RNA. Użyj zakupionego komercyjnie 3-' substratu 32-nukleotydowego znakowanego fluoresceiną.</li>
	<li>Mieszać i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Analiza próbek na natywnym poziomym żelu poliakrylamidowym
<ol>
	<li>Do każdej reakcji dodaj 15 μl 50% glicerolu i delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj 30 μl każdej reakcji do żelu. Ilość próbki, którą można załadować do pojedynczego dołka, różni się w zależności od grubości żelu i wielkości studzienek. Do pojedynczej studzienki żeli utworzonych za pomocą 24-dołkowego grzebienia i rozlanych do grubości 24 cm załadowaliśmy objętości od 15 μl do 45 μl.</li>
	<li>Po podłączeniu zasilacza do aparatu żelowego należy włączyć zasilanie i wyregulować napięcie. Uruchomić żel w temperaturze 4 °C przy napięciu 120 V. 
	UWAGA: W przypadku poziomego aparatu żelowego wynosi to około 5 V/cm. W przypadku pionowego aparatu żelowego jest to 16 V/cm.
	<ol>
		<li>Aby zapobiec uszkodzeniu lub wybieleniu znakowanego fluorescencyjnie RNA, należy przeprowadzić elektroforezę w ciemności.</li>
		<li>Różnicować czasy elektroforezy w zależności od specyfiki analizowanego kompleksu RNA-białko. 
		UWAGA: Główną zaletą poziomej analizy EMSA jest to, że elektroforezę można zatrzymać, zobrazować żel, a następnie żel można umieścić z powrotem w aparacie, a elektroforezę można kontynuować przez dłuższy czas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie żelu
<ol>
	<li>Wykonuj analizy za pomocą dowolnego urządzenia przeznaczonego do wykrywania i obrazowania podłoży fluorescencyjnych.</li>
	<li>Umieść żel na imagerze.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia imagera. W przypadku ligandów RNA znakowanych fluoresceiną należy użyć następujących ustawień: FAM (długość fali 473 nm), napięcie fotopowielacza 750 (PMT), rozmiar piksela 100 μm.</li>
	<li>Zeskanuj żel, aby uchwycić obraz.</li>
</ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li>
<li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386(2012).</li>
<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Natywne żele poliakrylamidowe są nieocenionym narzędziem do badania interakcji białko-RNA i tradycyjnie żele te są elektroforezowane w pionie 2,3. Zastosowaliśmy modyfikację protokołu, która zastępuje natywne żele poliakryloamidowe stworzone i elektroforezowane poziomo 1,4,6,7,15. Zmiany te stosowane w...

Testy przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) okazały się nieocenionym narzędziem biochemicznym do analizy specyficznych interakcji białko-kwas nukleinowy1,2,3. Testy te mogą dostarczyć ważnych informacji na temat powinowactwa białek do RNA lub DNA3, stechiometrii składowej kompleksów kwas-białko nukleinowy1 i dostarczyć ważnych nowych informacji na temat specyficzności wiązania białek wiążących RNA poprzez eksperymenty z konkurencją substratów1.
Tradycyjna konfiguracja eksperymentalna dla tych testów polega na mieszaniu oczyszczonego białka z radioznakowanym substratem RNA. Powstałe kompleksy są następnie analizowane za pomocą niedenaturujących (natywnych) żeli poliakrylamidowych wlewanych między dwie szklane płytki, a następnie elektroforeza próbki w aparacie pionowym3. Chociaż podejście to zostało wykorzystane w sposób wyczerpujący w celu uzyskania ważnych informacji na temat mechanizmów biochemicznych, które leżą u podstaw wiązania białek z kwasami nukleinowymi, ma ono również kilka ograniczeń. Na przykład ta podstawowa strategia ma stosunkowo niską przepustowość i nie można jej łatwo dostosować do aplikacji, które wymagają równoległego analizowania wielu reakcji wiązania. Ponadto, w przypadku tradycyjnej aparatury pionowej, trudno jest potencjalnie monitorować kompleksy w wielu momentach podczas elektroforezy3,4.
Tutaj prezentujemy adaptację testu EMSA, która wykorzystuje natywne żele poliakrylamidowe odlane w aparacie płaskim, poziomą elektroforezę i fluorescencyjnie znakowane substraty RNA4,5,6,7. Włączenie tych stosunkowo prostych modyfikacji do podstawowej strategii zapewnia kilka potężnych korzyści. W szczególności poziomy format płaski z łatwością nadaje się do jednoczesnej analizy dziesiątek próbek4. Ponadto, w przypadku niektórych kompleksów RNA-białko, takich jak te utworzone między białkiem Bicaudal-C a jego substratem RNA, elektroforeza w poziomym żelu zapewnia zwiększoną zdolność do rozpoznawania odrębnych kompleksów RNA-białko i odróżniania ich od niezwiązanego substratu RNA.

<table><tbody><tr><td>Poziome pudełko żelowe</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Produkt nie jest już produkowany. Podobne pudełka żelowe można znaleźć w Thermo Scientific, pudełka żelowe z serii A. Numer katalogowy: A2-BP</td></tr><tr><td>24-dołkowe duże poziome grzebienie do elektroforezy żelowej</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Produkt już nie produkowany. Podobne pudełka żelowe można znaleźć w Thermo Scientific, grzebienie do pudełek żelowych z serii A. Numer katalogowy: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean II Komórka do elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40% 19:1 Akrylamid/Bis</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowe tRNA</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina oznaczona RNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Zamówienie może być dostosowane do długości i pożądanej sekwencji</td></tr><tr><td>Hydrat soli tetrasodowej EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>US Biological</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

pozioma elektroforeza żelowa w celu lepszego wykrywania kompleksów białko-rna

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest podstawowym narzędziem biologii molekularnej, które jest szeroko stosowane do analizy biochemicznej oddziaływań RNA-białko. Oddziaływania te były tradycyjnie analizowane za pomocą żeli poliakrylamidowych generowanych między dwiema szklanymi płytkami i próbkami elektroforezowanymi pionowo. Jednak żele poliakrylamidowe zalewane w tackach i elektroforezowane poziomo mają kilka zalet. Na przykład poziome żele używane do analizy kompleksów między fluorescencyjnymi substratami RNA a określonymi białkami mogą być wielokrotnie obrazowane w miarę postępu elektroforezy. Daje to unikalną możliwość monitorowania kompleksów RNA-białko w kilku momentach eksperymentu. Ponadto pozioma elektroforeza żelowa umożliwia równoległą analizę wielu próbek. Może to znacznie ułatwić eksperymenty w czasie, a także analizę wielu reakcji jednocześnie w celu porównania różnych składników i warunków. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania i wykorzystywania poziomej natywnej elektroforezy żelowej do analizy interakcji RNA-białko.

Aby zademonstrować skuteczność i wszechstronność poziomej natywnej elektroforezy w żelu, przeanalizowano wiązanie białka Bicaudal-C (Bicc1) z Xenopus z fluorescencyjnie znakowanym RNA zawierającym miejsce wiązania Bicc1. Białka Bicc1 pełnią funkcję specyficznych dla mRNA represorów translacji, kontrolując decyzje dotyczące losu komórek podczas maciernych etapów rozwoju zwierząt9,10,11<su...

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest podstawowym narzędziem do analizy interakcji RNA-białko. Tradycyjnie w większości eksperymentów używano żeli pionowych. Jednak żele poziome mają kilka zalet, takich jak możliwość monitorowania kompleksów podczas elektroforezy. Udostępniamy szczegółowy protokół generowania i stosowania poziomej natywnej elektroforezy żelowej.

Pozioma elektroforeza żelowa w celu lepszego wykrywania kompleksów białko-RNA

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Celem niniejszego protokołu jest analiza oddziaływań białko-RNA z wykorzystaniem poziomej natywnej elektroforezy w żelu. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biochemii RNA, takie jak określenie charakterystyki specyficznych oddziaływań białko-RNA. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wielokrotnego monitorowania procesu tworzenia się kompleksów podczas elektroforezy.W przypadku poziomego układu do elektroforezy żelowej należy użyć komory z formą do odlewania żelu o wymiarach 27 centymetrów na 21 centymetrów oraz możliwości zastosowania dwóch grzebieni 24-dołkowych. Taka konfiguracja pozwala na jednoczesną analizę łącznie 48 próbek. Przygotuj dwa litry buforu do elektroforezy 1x TBE, rozcieńczając 400 mililitrów buforu 5x TBE w 1 600 mililitrach wody i mieszając.Umieść bufor TBE w pomieszczeniu chłodniczym w celu schłodzenia. Przygotuj następujące odczynniki zgodnie ze standardowymi procedurami: 40% akrylamid (najlepiej 19:1), 5x TBE, TEMED oraz 10% siarczan amonu. Aby przygotować 10% natywny żel akrylamidowy, dodaj do kolby o pojemności 500 ml następujące składniki: 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% akrylamidu oraz wodę do uzyskania objętości końcowej 400 ml.Dodaj cztery mililitry 10%siarczanu amonu oraz 400 mikrolitrów TEMED i dokładnie wymieszaj. Wlej mieszaninę do poziomej kasety do odlewania i pozostaw żel do polimeryzacji w dygestorium na 30 minut. Spolimeryzowany żel będzie miał około dwóch centymetrów grubości, a na jego powierzchni pozostanie cienka warstwa cieczy.Umieść żel w kasecie do elektroforezy i przenieś go do pomieszczenia chłodniczego. Następnie odlej ciecz i wypłucz żel buforem do elektroforezy. Ostrożnie wyjmij grzebienie, wlej do kasety dwa litry zimnego buforu do elektroforezy, a następnie za pomocą strzykawki wypłucz oczka buforem do elektroforezy.Przeprowadź wstępną elektroforezę żelu przy napięciu 120 V przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C w pomieszczeniu chłodniczym. Podczas wstępnego przebiegu żelu przygotuj reakcje wiązania. Do każdej wolnej od RNA probówki do mikrocentryfugi dodaj w następującej kolejności następujące składniki reakcji wiązania: 5 µL 10 mM BSA, 5 µL 20 mM DTT, 5 µL 10 mM tRNA drożdży, 10 µL 5x buforu wiążącego, białko bicaudal-c do stężenia końcowego 250 nM w 50 µL, wodę traktowaną DEPC do objętości końcowej 45 µL oraz 5 µL znakowanego fluorescencyjnie substratu RNA.Zamknąć probówki i delikatnie potrząsnąć w celu wymieszania, krótko odwirkować probówki i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji wiązania do każdej reakcji dodać 15 µL 50% glicerolu i delikatnie wymieszać. Ostrożnie nanieść 30 µL każdej reakcji do dołków żelu; ilość próbki, którą można nanieść do jednego dołka, różni się w zależności od grubości żelu i wielkości dołków.Podłącz zasilacz do aparatury do elektroforezy, włącz urządzenie, ustaw napięcie na 120 V i prowadź elektroforezę żelu w temperaturze 4 °C. Aby zapobiec uszkodzeniu lub blaknięciu fluorescencyjnie znakowanego RNA, przeprowadź elektroforezę w ciemności. Czas trwania elektroforezy będzie się różnić w zależności od specyfiki analizowanego kompleksu białkowo-RNA.Główną zaletą analizy poziomego testu przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) jest możliwość zatrzymania elektroforezy na obrazie żelu przed zakończeniem przebiegu. Analizę należy przeprowadzić przy użyciu dowolnego urządzenia przeznaczonego do detekcji obrazowej substratów fluorescencyjnych. W przypadku ligandów znakowanych fluorescencyjnie należy dostosować ustawienia obrazownika zgodnie z poniższymi parametrami.Długość fali dla fluoresceiny 473 nanometrów, napięcie fotopowielacza 750 woltów oraz rozmiar piksela 100 mikrometrów. Zeskanuj żel, aby zarejestrować obraz. Po obrazowaniu żel można umieścić z powrotem w aparaturze i kontynuować elektroforezę przez dłuższy czas.Wiązanie białka Bicc1 (bicaudal-C) z organizmu xenopus z fluorescencyjnie znakczonym mRNA Cripto1 zawierającym miejsce wiązania Bicc1 przeanalizowano za pomocą natywnej elektroforezy w żelu w układzie pionowym i poziomym; jako kontrolę negatywną Bicc1 zmieszano z fluorescencyjnie znakczonym RNA pochodzącym z mRNA CyclinB1. Obu metodami wyraźnie stwierdzono, że Bicc1 wiąże się z RNA Cripto1 i tworzy specyficzny kompleks. Jednak kompleksy Bicc1-Cripto1 były znacznie wyraźniejsze w analizie z użyciem żelu poziomego, co ułatwiło ich detekcję oraz pozwoliło na odróżnienie kompleksów białkowo-RNA od niezwiązanego RNA.Po obrazowaniu żel zwrócono do aparatury do elektroforezy, prowadzono elektroforezę przez kolejne trzy i pół godziny, a następnie ponownie wykonano obrazowanie. Jak pokazano tutaj, kompleksy przemieściły się dalej i nadal były łatwo wykrywalne, co wskazuje na ich stabilność. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym przeprowadzeniu, można ją wykonać w ciągu czterech do pięciu godzin.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak analizować oddziaływania RNA-białko za pomocą poziomej natywnej elektroforezy w żelu.

horizontal-gel-electrophoresis-for-enhanced-detection-protein-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Źródło: Stenum, T. S. i in. Ilościowa ilościowa i ładująca poziomy transferowych RNA w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie elektroforezy żelowej i północnego blottingu do wykrywania i porównywania poziomów ładunku RNA transferowych w E. coli poprzez rozdzielenie form aminoacylowanych i deacylatowanych.

Elektroforeza żelowa i północne blotezowanie w celu wykrywania poziomów ładowania tRNA w E. coli

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

W tym filmie demonstrujemy test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania interakcji białko-DNA za pomocą sond DNA znakowanych fluorescencyjnie w podczerwieni. Kiedy białko wiąże się z sondą DNA, tworzy duży kompleks, który migruje powoli i pojawia się jako przesunięta prążek na żelu.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania kompleksów czynnik transkrypcyjny-DNA

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Poznaj metodę poziomej elektroforezy żelowej do analizy interakcji białko-RNA w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia jednoczesne badanie 48 próbek i precyzyjne monitorowanie tworzenia się kompleksów.

Pozioma elektroforeza żelowa w celu lepszego wykrywania kompleksów białko-RNA

Przeglądaj więcej filmów