Name: Kawitacja azotu i wirowanie różnicowe pozwalają na monitorowanie dystrybucji białek błony obwodowej w hodowanych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę kawitacji azotu do homogenizacji komórek HGK293 bez detergentów. Technika ta umożliwia dokładną analizę partycjonowania białek błonowych i cytosolowych w biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez GM055279, CA116034 i CA163489.

1. Przygotowanie bufora i sprzętu
<ol>
	<li>Schłodź 45 ml bomby rozbijające komórki, probówki 15 ml i probówki ultrawirówki w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować i schłodzić 25 ml buforu homogenizacyjnego na 2 x 107 komórek w temperaturze 4 °C. Dodać jedną tabletkę inhibitora proteazy bezpośrednio przed użyciem. 
	UWAGA: Buzy homogenizacyjne zazwyczaj zawierają KCl, a nie NaCl, aby lepiej odzwierciedlić wewnątrzkomórkowy skład soli. Bufor homogenizacyjny stosowany w tym protokole składa się z 10 mM HEPES o pH 7,4, 10 mM KCl i 1,5 mM MgCl2 (zwanych dalej hipotonicznym buforem homogenizacyjnym). Większość można przystosować do kawitacji azotu (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Przygotować i schłodzić 6 ml 1x buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na próbkę w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać świeże tabletki inhibitora proteazy. 
	UWAGA: Bufor PBS używany w tym protokole składa się z 10 mM Na2HPO4 o pH 7,4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl.</li>
	<li>Przygotować i schłodzić 4 ml buforu do rozpuszczania na próbkę w temperaturze 4 °C. Dodać jedną tabletkę inhibitora proteazy bezpośrednio przed użyciem. 
	UWAGA: Bufor solubilizacyjny stosowany w tym protokole to 1x bufor do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA), który składa się z 25 mM Tris o pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% deoksycholanu sodu i 1% NP-40. Patrz 4.6 UWAGA.</li>
</ol>
2. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Wyhoduj 2 x 107-10 x109 komórek kultury tkankowej z pożywką hodowlaną zalecaną dla danego typu komórki. Zazwyczaj jedna 15-centymetrowa szalka daje 2 x 107 komórek HEK-293 hodowanych w DMEM przy 90% konfluencji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Usuń pożywkę wzrostową za pomocą próżni.</li>
	<li>W przypadku przylegających komórek umieścić szalki hodowlane na lodzie, delikatnie umyć komórki bezpośrednio na szalkach hodowlanych schłodzonym buforem homogenizacyjnym (10 ml buforu na 15 cm na jedno przemycie) i zebrać komórki za pomocą dużego skrobaka do komórek w odpowiedniej objętości buforu homogenizacyjnego; W przypadku komórek zawiesinowych, zebrać i przemyć osad komórkowy w schłodzonym buforze homogenizacyjnym dwukrotnie (10 ml buforu na 50 ml kultury na przemycie) z 500 x g wirowania w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić przemyte komórki w odpowiedniej objętości buforu homogenizacyjnego na lodzie. 
	UWAGA: Objętość powinna być oparta na wymaganiach dotyczących stężenia białka w zamierzonych eksperymentach, jak również na minimalnej/maksymalnej objętości dozwolonej w bombie rozbijającej komórki. Ogólna wytyczna to 2-10 x 107 komórek/ml, czyli około 10 objętości osadu komórkowego. Protokół ten jest zoptymalizowany dla trzech 15-centymetrowych szalek komórek HEK-293 w 2 ml buforu homogenizacyjnego.</li>
</ol>
3. Kawitacja azotu
<ol>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do czystej i schłodzonej bomby w łaźni lodowej na płytce mieszającej. 
	UWAGA: Bomba ma wysokie ciśnienie, niską temperaturę, gazowy azot – należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Umieść mikro magnetyczny pręt mieszający wewnątrz bomby i włącz płytkę mieszającą, aby utrzymać jednorodność zawiesiny.</li>
	<li>Dodaj jedną tabletkę inhibitora proteazy do zawiesiny i zamknij bombę zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj ciśnienie w bombie za pomocą zbiornika azotu zgodnie z instrukcją producenta, aż manometr bomby wskaże od 300 do 600 psi. Zamknij wszystkie zawory i odłącz zbiornik azotu. 
	UWAGA: Wymagane ciśnienie może się różnić w zależności od typu ogniwa. Tutaj przeprowadziliśmy kawitację przy ciśnieniu od 350 do 400 psi dla komórek HEK-293, NIH-3T3 i Jurkat.</li>
	<li>Odczekaj 20 minut, aby azot rozpuścił się i osiągnął równowagę w komórkach.</li>
	<li>Usuń nadmiar wody wokół zaworu spustowego za pomocą ręcznika z tkaniny. Delikatnie otwórz zawór spustowy, aby uzyskać krople homogenatu i zbierz go w wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Pod koniec zbierania nastąpi wytrysk homogenatu i pojawi się gaz z syczącym dźwiękiem. Upewnij się, że gaz nie powoduje wystrzeliwania wcześniej pobranego kawitatu z probówki (stąd użycie probówek 15 ml zamiast probówek 1,5 ml). Gdy zacznie się zryw, zamknij zawór wylotowy i gwałtownie otwórz zawór wlotowy azotu, aby rozhermetyzować bombę i osiągnąć kawitację pozostałych ogniw w bombie. Otwórz bombę, aby odzyskać kawitację i dokładnie wyczyścić. 
	UWAGA: Końcowa kawitacja powinna mieć mleczny wygląd z pianą na wierzchu. Delikatnie wymieszać końcówką pipety, aby piana opadła przed odwirowaniem. 
	UWAGA: Zbadaj kawitat za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby określić wydajność homogenizacji. Dodać 15 μl kropli kawitatu na powierzchnię szkiełka mikroskopowego i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Powtórz krok 3.4-3.6 tylko wtedy, gdy za pomocą obiektywu 20X zostanie wykrytych zbyt wiele nieuszkodzonych komórek. 
	UWAGA: Jeśli bufor homogenizacyjny nie zawiera EDTA lub EGTA, należy dodać go do zebranego kawitatu w końcowym stężeniu 1 mM w ciągu 5 minut po rozładowaniu.</li>
</ol>
4. Oddzielenie frakcji cytozolowej od błonowej
<ol>
	<li>Odwirować kawitat przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nieuszkodzonych komórek i jąder. 
	UWAGA: Powtarzaj etap wirowania, aż nie powstanie żadna widoczna osadka i zbierz postjądrowy supernatant (PNS), unikając unoszącej się na wierzchu piany. Ponownie odwiruj piankę, aby dalej zbierać i łączyć PNS, jeśli to konieczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Przetwarzaj PNS zgodnie z potrzebami, aby uzyskać interesujące Cię ułamki. W celu oddzielenia frakcji cytozolowej i błonowej należy przenieść PNS do probówki ultrawirówki i przeprowadzić ultrawirowanie zgodnie z życzeniem. Protokół ten jest zoptymalizowany dla próbki o objętości <3,5 ml w probówce ultrawirówkowej z poliwęglanu oraz dla ultrawirowania przy 350 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant (frakcję S) za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Ostrożnie spłucz granulat 3 ml zimnego PBS, nie naruszając go. Usuń PBS za pomocą próżni. 
	UWAGA: Jeśli zanieczyszczenie frakcji błonowej białkami cytozolowymi stanowi większy problem niż utrata próbki, należy ponownie zawiesić osad w 3 ml zimnego PBS i ponownie odwirować, jak w kroku 4.2. Usuń PBS za pomocą próżni.</li>
	<li>Zawiesić osad w całości w odpowiedniej objętości wybranego buforu solubilizacyjnego zawierającego detergent. Aby osiągnąć równoważność komórki, należy użyć tej samej objętości buforu solubilizacyjnego, co frakcji cytozolowej. 
	UWAGA: Sugerujemy użycie 1x buforu RIPA jako bufora solubilizacyjnego w celu wydajnej ekstrakcji białek błonowych. Jeśli nie jest wymagany dalszy test dla frakcji błonowej, należy użyć 1x bufor próbki laemmli do maksymalnej ekstrakcji białka błonowego. 
	UWAGA: Sugerujemy usunięcie i przeniesienie osadu w buforze do rozpuszczania do czystej probówki na rotatorze probówki w temperaturze 4 °C w celu maksymalnej ekstrakcji białka błonowego. 
	UWAGA: Jeśli osad jest zbyt lepki (zbyt dużo lipidów), aby można go było skutecznie usunąć z probówki ultrawirówki w buforze do solubilizacji, sugerujemy szybkie zamrożenie osadu w ciekłym azocie i szybkie usunięcie osadu z probówki ultrawirówki za pomocą mini metalowej szpatułki, zanim granulka się rozmrozi. 
	UWAGA: Alternatywnie, granulki membranowe mogą być po prostu ponownie zawieszone i nie rozpuszczone w buforze niezawierającym detergentów w celu wytworzenia frakcji P zawiesiny pęcherzyków membranowych, w którym to przypadku etap wirowania w ppkt 4.6 nie jest wymagany. Takie frakcje P są przydatne podczas badania funkcji, takich jak aktywność enzymów, które są zależne od asocjacji błonowej.</li>
	<li>Całkowicie rozpuszczoną zawiesinę osadów z kroku 4.5 przy 20 000 x g odwirować w wirówce stołowej przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml (frakcja P) i wyrzucić osad (nierozpuszczalne lipidy).</li>
	<li>Wykonaj pożądane testy, takie jak western blot z frakcjami cytozolowymi i/lub błonowymi, lub zachowaj je w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>

<ol><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+on+the+move%3A+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li>
<li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).</li>
<li>Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+plasma+membranes.+I.+High-yield+purification+of+human+neutrophil+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation+and+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation.</a> J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).</li>
<li>Philips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+molecular+weight+GTP-binding+proteins+in+human+neutrophil+granule+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).</li>
<li>Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospholipides+of+Ehrlich+ascites+carcinoma+cells%3A+composition+and+intracellular+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution.</a> Cancer Res. 20, 397-402 (1960).</li>
<li>Hunter, M. J., Commerford, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+homogenization+of+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Pressure homogenization of mammalian tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).</li>
<li>Wallach, D. F., Kamat, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+Cytoplasmic+Membrane+Fragments+from+Ehrlich+Ascites+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).</li>
<li>Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).</li>
<li>Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+5-lipoxygenase+to+the+nucleus+of+unstimulated+rat+basophilic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells.</a> J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).</li>
<li>Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li>
<li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1-interacting+adapter+molecule+%28RIAM%29+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li>
<li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li>
<li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li>
<li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li>
<li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature%2C+tubulin+concentration%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zalety kawitacji azotowej w porównaniu z innymi metodami mechanicznego rozrywania są wielorakie. Być może najważniejszą zaletą jest jego zdolność do delikatnej, ale skutecznej homogenizacji próbek. Fizyczne zasady dekompresji chłodzią próbki zamiast generować miejscowe uszkodzenia cieplne, jak w przypadku technik ultradźwiękowych i opartych na tarciu/ścinaniu. Kawitacja jest również niezwykle skuteczna w przerywaniu błony plazmatycznej. Ponieważ podczas dekompresji w każdej pojedynczej komórce powstają pęcherzyki azotu, ...

Białka komórkowe można podzielić na dwie klasy: te, które są związane z błonami i te, które nie są. Białka niezwiązane z błoną znajdują się w cytozolu, nukleoplazmie i luminie organelli, takich jak retikulum endoplazmatyczne (ER). Istnieją dwie klasy białek związanych z błoną, integralne i obwodowe. Integralne białka błonowe są również znane jako białka transbłonowe, ponieważ jeden lub więcej segmentów łańcucha polipeptydowego obejmuje błonę, zwykle jako α-helisa złożona z aminokwasów hydrofobowych. Białka transbłonowe są kotranslacyjnie wprowadzane do błon w trakcie ich biosyntezy i pozostają tak skonfigurowane, dopóki nie zostaną katabolizowane. Białka błon obwodowych są wtórnie kierowane do błon, zwykle w wyniku modyfikacji potranslacyjnej cząsteczkami hydrofobowymi, takimi jak lipidy. W przeciwieństwie do integralnych białek błonowych, asocjacja białek błony obwodowej z błonami komórkowymi jest odwracalna i może być regulowana. Wiele białek błon obwodowych funkcjonuje w szlakach sygnałowych, a regulowane asocjacja z błonami jest jednym z mechanizmów aktywacji lub hamowania szlaku. Jednym z przykładów cząsteczki sygnałowej, która jest białkiem błony obwodowej, jest mała GTPaza, RAS. Po serii modyfikacji potranslacyjnych, które obejmują modyfikację lipidem farnezylu, zmodyfikowany C-koniec dojrzałego białka RAS wstawia się do cytoplazmatycznego płatka błony komórkowej. W szczególności błona plazmatyczna jest miejscem, w którym RAS angażuje swój dalszy efektor RAF1. Aby zapobiec konstytutywnej aktywacji szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), istnieje wiele poziomów kontroli RAS. Oprócz unieszkodliwiania RAS poprzez hydrolizę GTP do GDP, aktywny RAS może być również uwalniany z błony plazmatycznej poprzez modyfikacje lub interakcje z czynnikami rozpuszczającymi w celu zahamowania sygnalizacji. Chociaż obrazowanie fluorescencyjne na żywo daje biologom komórkowym możliwość obserwowania subkomórkowej lokalizacji białek obwodowych znakowanych białkami fluorescencyjnymi1, nadal istnieje krytyczna potrzeba oceny asocjacji błonowej białek endogennych półilościowo za pomocą prostych podejść biochemicznych.
Właściwa biochemiczna ocena podziału białek między frakcjami błonowymi i rozpuszczalnymi zależy krytycznie od dwóch czynników: homogenizacji komórkowej i efektywnego oddzielania frakcji błonowych i rozpuszczalnych. Chociaż niektóre protokoły, w tym najczęściej stosowane komercjalizowane zestawy, opierają się na homogenizacji komórek na bazie detergentów, metody te mogą zaciemniać analizę poprzez ekstrakcję białek błonowych do fazy rozpuszczalnej2. W związku z tym, mechaniczne metody rozbijania komórek nieoparte na detergentach zapewniają czystsze rezultaty. Istnieje kilka metod mechanicznego rozbijania komórek wyhodowanych w kulturze lub pobranych z krwi lub narządów. Należą do nich homogenizacja Dounce, rozbijanie cienkiej igły, homogenizacja łożysk kulkowych, sonikacja i kawitacja azotem. Tutaj oceniamy kawitację azotu i porównujemy ją z innymi metodami. Kawitacja azotu opiera się na azocie, który rozpuszcza się w cytoplazmie komórek pod wysokim ciśnieniem. Po zrównoważeniu zawiesina komórkowa jest nagle wystawiana na działanie ciśnienia atmosferycznego, tak że w cytoplazmie tworzą się pęcherzyki azotu, które rozrywają komórkę w wyniku ich musowania. Jeśli ciśnienie jest wystarczająco wysokie, musowanie azotem może zakłócić jądro3 i organelle związane z błoną, takie jak lizosomy4. Jeśli jednak ciśnienie jest utrzymywane na wystarczająco niskim poziomie, dekompresja zakłóci błonę plazmatyczną i ER, ale nie inne organelle, rozlewając w ten sposób zarówno cytozol, jak i nienaruszone organelle cytoplazmatyczne do homogenatu, który jest oznaczony jako kawitat5. Z tego powodu kawitacja azotowa jest metodą z wyboru do izolowania organelli, takich jak lizosomy i mitochondria.
Jest to jednak również doskonały sposób na przygotowanie homogenatu, który można łatwo podzielić na frakcje membranowe i rozpuszczalne. Zbiornik ciśnieniowy (zwany dalej "bombą") używany podczas kawitacji składa się z grubej obudowy ze stali nierdzewnej, która wytrzymuje wysokie ciśnienie, z wlotem do dostarczania azotu ze zbiornika i króćcem wylotowym z regulowanym zaworem spustowym.
Kawitacja azotowa jest stosowana do homogenizacji komórek od lat 60-tych6. W 1961 roku Hunter i Commerfold7 ustalili, że kawitacja azotowa jest realną opcją niszczenia tkanek ssaków. Od tego czasu naukowcy z powodzeniem dostosowali tę technikę do różnych komórek i tkanek, a kawitacja azotowa stała się podstawą wielu zastosowań, w tym w przygotowaniu błony8,9, preparacja jąder i organelli10,11i labilna ekstrakcja biochemiczna. Obecnie biolodzy komórkowi coraz częściej stosują inne metody homogenizacji komórek, ponieważ korzyści płynące z homogenizacji azotu nie są szeroko reklamowane, bomby azotowe są drogie i istnieje błędne przekonanie, że wymagana jest stosunkowo duża liczba komórek. Protokoły kawitacji azotu w celu uzyskania bezkomórkowych homogenatów z nienaruszonymi jądrami nie zostały opublikowane, a w większości opublikowanych ocen wykorzystano objętości 20 ml zawiesiny komórkowej. Aby dostosować tę klasyczną technikę do aktualnych wymagań pracy z próbkami na małą skalę, przedstawiamy zmodyfikowany protokół kawitacji azotowej zaprojektowany specjalnie dla hodowanych komórek. Po kawitacji azotu homogenat rozdziela się na frakcje rozpuszczalne (S) i błonowe (P) przez wirowanie różnicowe, najpierw z wolnym wirowaniem w celu usunięcia jąder i nieuszkodzonych komórek, a następnie z szybkim wirowaniem (>100 000 x g) w celu oddzielenia błon od frakcji rozpuszczalnej. Analizujemy skuteczność separacji za pomocą immunoblotów i porównujemy kawitację azotu z innymi technikami rozrywania mechanicznego. Badamy również efekt osmotyczny buforu homogenizacyjnego podczas kawitacji azotu.

<table><tbody><tr><td>Naczynie do rozbijania komórek (45 ml)</td><td>Instrument Parr</td><td>4639</td><td>Homogenizator kawitacyjny z kawitacją azotu</td></tr><tr><td>Dounce (2 ml)</td><td>Kontes</td><td>885300-0002</td><td>Tłuczek i rurka do dounce</td></tr><tr><td>U-100 Strzykawka insulinowa 28G&frac12;</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Needle Atg12</td><td>Santa Cruz</td><td>271688</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr> <tr><td>& przeciwciało beta-aktyny</td> Santa <td>Cruz</td><td>47778</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr> <tr><td>&beta;-tubulina</td><td>przeciwciało DSHB</td><td>E7-s</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:5000</td></tr><tr><td>Przeciwciało Calnexin</td><td>Santa Cruz</td><td>23954</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało kalregulinowe</td><td>Santa Cruz</td><td>373863</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało katalazy</td><td>Santa Cruz</td><td>271803</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało CIMPR</td><td>Abcam</td><td>124767</td><td>Przeciwciało królika, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało EEA1</td><td>Santa Cruz</td><td>137130</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało EGFR</td><td>Santa Cruz</td><td>373746</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało F0-ATPaza</td><td>Santa Cruz</td><td>514419</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało F1-ATPaza</td><td>Santa Cruz</td><td>55597</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td> <td>fibrylarynySanta Cruz</td><td>374022</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało Golgin 97</td><td>Santa Cruz</td><td>59820</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało HDAC1</td><td>Santa Cruz</td><td>81598</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko heksokinazie 1</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2024S</td><td>Przeciwciało królika, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td> <td>A/C LaminySanta Cruz</td><td>376248</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało LAMP1</td><td>DSHB</td><td>H4A3-c</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Na+/K+ Przeciwciało ATPazy</td><td>Santa Cruz</td><td>48345</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało Rab7</td><td>Abcam</td><td>137029</td><td>Przeciwciało królika, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Rab9 przeciwciało</td><td>Thermo</td><td>MA3-067</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało RCAS1</td><td>Przeciwciało Santa Cruz</td><td>398052</td><td>Mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało RhoGDI</td><td>Przeciwciało Santa Cruz</td><td>360</td><td>Rabbit, stosować w rozcieńczeniu 1:3000</td></tr><tr><td>Białko rybosomalne Przeciwciało S6</td><td>Santa Cruz</td><td>74459</td><td>Przeciwciało mysie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało Sec61a</td><td>Santa Cruz</td><td>12322</td><td>Przeciwciało kozie, stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Grubościenna ultrawirówka z poliwęglanu</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Probówka na próbkę do ultrawirowania</td></tr><tr><td>Rotor TLK-100.3 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td>do ultrawirowania</td></tr><tr><td>Optima MAX Osobista ultrawirówka o dużej pojemności</td><td>Ultrawirówka</td> <td>Beckman Coulter</td><td>364300</td></tr><tr><td>Kompletne tabletki koktajlowe z inhibitorami proteazy</td><td>Inhibitory proteazy</td><td>Roche</td><td>11697498001</td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek z uchwytem 25 cm i ostrzem 3,0 cm</td><td>Skrobak do dużych komórek</td><td>Corning</td><td>353089</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57SIX</td><td>mikro mieszadło</td></tr><tr><td>Ceramiczne mieszadło magnetyczne</td><td>Mieszadło magnetyczne Fisher Scientific</td><td>S504501AS</td><td></td></tr></tbody></table>

kawitacja azotu i wirowanie różnicowe pozwalają na monitorowanie dystrybucji białek błony obwodowej w hodowanych komórkach

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Hodowane komórki są przydatne do badania subkomórkowego rozkładu białek, w tym białek błon obwodowych. Genetycznie kodowane, znakowane fluorescencyjnie białka zrewolucjonizowały badania nad dystrybucją białek subkomórkowych. Jednak trudno jest określić ilościowo rozkład za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zwłaszcza gdy białka są częściowo cytozolowe. Co więcej, często ważne jest badanie białek endogennych. Testy biochemiczne, takie jak immunobloty, pozostają złotym standardem w ilościowym określaniu dystrybucji białek po frakcjonowaniu subkomórkowym. Chociaż istnieją komercyjne zestawy, które mają na celu wyizolowanie cytozolowych lub niektórych frakcji błonowych, większość z tych zestawów opiera się na ekstrakcji detergentami, które mogą być nieodpowiednie do badania białek błon obwodowych, które można łatwo wyekstrahować z błon. Tutaj przedstawiamy bezdetergentowy protokół homogenizacji komórkowej przez kawitację azotu, a następnie oddzielenie białek cytozolowych i związanych z błoną przez ultrawirowanie. Potwierdzamy rozdzielenie organelli subkomórkowych we frakcjach rozpuszczalnych i granulek w różnych typach komórek i porównujemy ekstrakcję białek między kilkoma popularnymi metodami homogenizacji mechanicznej nieopartymi na detergentach. Wśród kilku zalet kawitacji azotowej jest doskonała skuteczność rozbijania komórek przy minimalnym fizycznym i chemicznym uszkodzeniu delikatnych organelli. W połączeniu z ultrawirowaniem, kawitacja azotu jest doskonałą metodą badania przesunięcia białek błony obwodowej między frakcjami cytozolowymi i błonowymi.

Rysunek 2 przedstawia rozdział białek komórkowych z PNS na rozpuszczalną frakcję cytozolową (S) lub frakcję osadu błonowego (P). zbadaliśmy trzy reprezentatywne linie komórkowe różnych typów: HEK-293 (nabłonkowe), NIH-3T3 (fibroblasty) oraz Jurkat (limfocyty). Jako kontrole pozytywne dla frakcji cytozolowej i błonowej odpowiednio wykorzystano inhibitor dysocjacji guaniny Rho (RhoGDI) oraz niezależny od kationów receptor mannozo-6-fosforanu (CIMPR). Potwierdzi...

Tutaj prezentujemy protokoły bezdetergentowej homogenizacji hodowanych komórek ssaków oparte na kawitacji azotu i późniejszym oddzieleniu białek cytozolowych i błonowych przez ultrawirowanie. Metoda ta jest idealna do monitorowania podziału białek błony obwodowej między frakcjami rozpuszczalnymi i błonowymi.

Kawitacja azotu i wirowanie różnicowe pozwalają na monitorowanie dystrybucji białek błony obwodowej w hodowanych komórkach

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest optymalna homogenizacja hodowlanych komórek oraz analiza rozdziału białek komórkowych pomiędzy frakcje błonowe a rozpuszczalne. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu jednego z kluczowych problemów biologii komórki, jakim jest subkompartymentacja białek peryferyjnych błon. Główną zaletą tej techniki jest możliwość powtarzalnego wykrywania rozdziału endogennych białek pomiędzy frakcje stałe i błonowe z dużą dokładnością i bez użycia detergentów.Na początek należy hodować komórki HGK293 do osiągnięcia 90% konfluencji, tak aby wydajność z jednej płytki o średnicy 15 cm wynosiła około 2 x 10⁷ komórek przy hodowli w DMEM w temperaturze 37 °C i 5% CO₂. Następnie odessać podciśnieniowo medium wzrostowe. Kolejnym krokiem jest umieszczenie płytek hodowlanych na lodzie i delikatne dwukrotne przemycie komórek w płytkach za pomocą 10 ml schłodzonego buforu do homogenizacji na każdą płytkę.Po przemyciu należy użyć dużego skrobaka do komórek w celu zebrania komórek, stosując odpowiednią objętość buforu homogenizacyjnego. Następnie zawiesinę komórkową należy przenieść do czystego, uprzednio schłodzonego homogenizatora mechanicznego (tzw. bomby)

nitrogen-cavitation-differential-centrifugation-allows-for-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego - techniki systematycznego, wysokoprzepustowego badania przesiewowego białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydów wewnątrzkomórkowych. Technika ta pozwala na bezpośrednie wiązanie przekaźników z nadekspresyjnym białkiem docelowym w lizacie komórkowym - z pominięciem konieczności oczyszczania białka.

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego: wysokoprzepustowa technika identyfikacji wewnątrzkomórkowych białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydu bakteryjnego

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

Ten artykuł przedstawia metody generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans.

Oczyszczanie i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.

Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

Ten protokół opisuje konfigurację bioreaktora NMR w celu utrzymania żywotności zamkniętych komórek ludzkich przez okres do 72 godzin, po czym następuje czasowo-rozdzielcza akwizycja i analiza danych NMR w komórce. Metodologia ta jest stosowana do monitorowania wewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-ligand w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Poznaj metodę kawitacji azotu do homogenizacji komórek HGK293 bez detergentów. Technika ta umożliwia dokładną analizę partycjonowania białek błonowych i cytosolowych w biologii komórki.

Kawitacja azotu i wirowanie różnicowe pozwalają na monitorowanie dystrybucji białek błony obwodowej w hodowanych komórkach

Przeglądaj więcej filmów