Name: Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Poznaj półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego. Ta metoda umożliwia szybką izolację peptydów w ciągu tygodnia przy minimalnym ryzyku fałszywych pozytywów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie U.S. Army Research Laboratory (ARL) Postdoctoral Fellowship Program, zarządzanego przez Oak Ridge Associated Universities poprzez kontrakt z ARL, poprzez mianowanie Dr. Justina P. Jahnke. Pozostałe środki finansowe zostały zapewnione przez Dyrekcję ds. Czujników i Urządzeń Elektronowych w ARL. Autorzy chcieliby również podziękować Daugherty Lab na UCSB za udostępnienie biblioteki wyświetlaczy bakteryjnych i informacji dotyczących klonowania odczynnika YPet Mona, dr Bryn Adams za wsparcie w klonowaniu odczynnika YPet Mona w ARL, dr Joshua Kogot za jego początkową pracę i szkolenie w zakresie biopanowania bibliotek wyświetlaczy bakteryjnych, Alenie Calm z Edgewood Chemical and Biological Center za udostępnienie plazmidów używanych do ekspresji i oczyszczania białek abrax i rivax, Brandi Dorsey za wsparcie techniczne w izolacji peptydów wiążących PA, Qin Guo za wsparcie techniczne wstępnych eksperymentów w celu izolacji peptydów wiążących abrax oraz dr Jessicę Terrell za pomocne dyskusje na temat tego manuskryptu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Biopanowanie bibliotek ekspozycyjnych bakterii okazało się udanym podejściem do izolacji odczynników powinowactwa, a peptydy stanowią użyteczną alternatywę dla przeciwciał do rozpoznawania, gdy wymagane są określone kryteria, takie jak stabilność w ekstremalnych warunkach. Biopanoramacja tych bibliotek została usprawniona przy użyciu opisanych tutaj metod autoMCS, a dostępna na rynku platforma autoMCS rozszerza tę technologię na znacznie szersze grono odbiorców. W porównaniu z tradycyjnymi naprzemiennymi metodami sortowania MCS/FACS dla bakteryjnych bibliotek wyświetlania, metody autoMCS są tańsze, ponieważ nie wymagają inwestycji w droższy przyrząd FACS zdolny do sortowania i izolowania związanych komórek, a nie w typ cytometru przepływowego, który jest w stanie przeprowadzić tylko analizę 14. Kluczowe kroki dla udanego biopanowania przez autoMCS obejmują wybór programu separacji, sortowanie ujemne w stosunku do potencjalnych reagentów krzyżowych w celu zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich, monitorowanie wzbogacania biblioteki za pomocą FACS w celu określenia, kiedy należy przerwać biopanoramację, oraz inteligentną analizę puli kandydatów w celu uniknięcia kłopotliwych badań przesiewowych setek kandydatów.
Przykłady opisane w niniejszym dokumencie pokazują udane biopanowanie wybranej biblioteki wyświetlania bakterii dla dwóch oddzielnych celów, PA i abrax, chociaż z nieco innymi strategiami analizy ze względu na różnice w sekwencjach peptydowych dla każdej puli kandydatów po czterech rundach biopanowania. PA był prostszym przypadkiem, a analiza sekwencji wykazała wyraźne trendy w sekwencjach peptydowych, które powtarzały się co najmniej raz na 144 kolonie. Samo to wystarczyło do określenia sekwencji konsensusu dla celu PA, a te kolonie, które zawierały konsensus lub podobną sekwencję, były najlepszymi kandydatami pod względem stosunku wiązania do PA w porównaniu z wiązaniem z kontrolą ujemną streptawidyny. Jednak nie zawsze tak będzie. W przypadku celu Abrax sekwencjonowanie 100 kolonii doprowadziło do pięciu powtarzających się sekwencji, ale tendencja w tych sekwencjach była mniej wyraźna, poza tendencją do zawierania reszt aminokwasów aromatycznych i kwasu asparaginowego lub asparaginy. Przewidywany "konsensus" tylko na podstawie powtarzających się sekwencji mógł zostać wyprodukowany i przetestowany pod kątem powinowactwa do abraxu, ale ponieważ żadne sekwencje rodzicielskie nie zawierały dokładnie tej sekwencji konsensusu, wróciliśmy do listy sekwencjonowanych kolonii i zaobserwowaliśmy, że inni kandydaci, którzy mieli więcej wspólnych trendów. W rzeczywistości dwie kolonie zawierały podobną sekwencję do "konsensusu" z samych powtórzeń (FWDTWF zamiast FWAWF), które miały ten sam trend reszt tryptofanu, fenyloalaniny i kwasu asparaginowego, ale z różnymi odstępami. Jeden z tych peptydów był powtarzającą się sekwencją, drugi nie. Te dwie sekwencje, wraz z trzecią sekwencją zawierającą podobny wariant, znalazły się wśród 5 najlepszych testowanych spoiw pod względem powinowactwa do abraxu. Górny segregator ogólny, AX-A05, również wykazywał podobne trendy. Wyniki uzyskane w przypadku abrax pokazują, że w zależności od wybranego celu czasami wymagane będzie podejście, w którym analiza sekwencji przebiega kilkakrotnie naprzemiennie między analizą powinowactwa i swoistości. Wyniki dla celu abrax pokazują również poziom swoistości, który można osiągnąć w przypadku bardzo podobnego białka (rivax 1,15).
Programy autoMCS wybrane do naszych badań to Posselds i Posseld, które służą do pozytywnej selekcji znakowanych komórek docelowych z niską częstotliwością, mniej niż 5% początkowej populacji. W obu przypadkach komórki przechodzą przez dwie kolumny magnetyczne. Jednak w przypadku programu Posseldsa komórki przechodzą wolniej przez pierwszą kolumnę, aby wydłużyć czas ekspozycji 41. Oprócz opisów programów podanych przez producenta komercyjnego urządzenia autoMCS (patrz tabela materiałów) 41, programy te zostały wybrane po wstępnym porównaniu kilku potencjalnych programów. Porównano zdolność każdego programu do unikania wyciągania wyników fałszywie dodatnich z jednorodnej hodowli ujemnych komórek kontrolnych oraz do skutecznego izolowania znanego spoiwa do celu zainteresowania z mieszanej kultury zawierającej ujemne komórki kontrolne wzbogacone o malejący procent znanego składnika wiążącego. W przypadku znacznego odchylenia od opisywanych tutaj aplikacji, podobne porównanie może być pomocne w doborze programu dla nowej aplikacji. Jednak wcześniej opublikowane wyniki porównujące te dwa programy (Posseld i Posselds) do izolacji odczynników powinowactwa peptydów do PA wykazały, że użycie któregokolwiek z tych programów dla wszystkich czterech rund biopanowania doprowadziło do izolacji peptydów o podobnym powinowactwie i swoistości do PA oraz określenia konsensusu WXCFTC. Główne różnice polegały na tym, że Posseld, ze swoim szybszym przepływem, sortował szybciej, a powinowactwo wiązania do celu było zatem wyższe po zaledwie dwóch rundach biopanowania, podczas gdy użycie Posselda prowadziło do bardziej unikalnych sekwencji po czterech rundach biopanowania 14. Wyciągając z tego wnioski, strategia została nieznacznie zmieniona podczas biopanowania peptydów wiążących abrax, aby uwzględnić obie korzyści: Posselds został użyty w rundzie 1, aby zapewnić więcej czasu ekspozycji podczas tego krytycznego etapu, w którym różnorodność jest najwyższa, ale następnie program został przełączony na Posseld w celu szybszej izolacji spoiw o najwyższym powinowactwie podczas rund 2-4 1, Rozdział 15. Wydawało się to być idealne dla abrax, zwłaszcza, że nMFI i procentowe wiązanie były wyższe dla 4. rundy sortowania abrax w porównaniu z 4. rundy sortowania PA z dowolnym programem (Rysunek 2 i Rysunek 3 oraz Sarkes i in. 2015 14), ale bezpośrednie porównanie przy użyciu jednej strategii z drugą z tym samym celem byłoby wymagane dla bardziej rozstrzygającego porównania. To, który program jest najlepszy dla danej aplikacji, może zależeć od indywidualnego celu, używanej biblioteki sortowania i poziomu ekspresji peptydów, który jest osiągany przy dowolnej zmianie warunków opisanych tutaj.
Nie omówiono tutaj potencjalnych wyników biopanowania z materiałami abiotycznymi, ale użyliśmy również tej samej biblioteki wyświetlania bakterii do biopanoramowania w stosunku do aluminium 2 luzem. Badanie to nie zostało przeprowadzone przy użyciu autoMCS, ale podobne badania można przeprowadzić przy użyciu autoMCS, jeśli materiał jest dostępny na kulce magnetycznej, może być pokryty lub sprzężony z nim. W badaniu aluminium analiza poszczególnych aminokwasów i modelowanie struktury drugorzędowej były pomocne w zrozumieniu, co napędzało powinowactwo wiązania izolowanych peptydów, ponieważ nie określono sekwencji konsensusu 2. Nawet w przypadku celów biologicznych może to być wymagane do zrozumienia, co napędza powinowactwo wiązania dla niektórych celów, dlatego arkusz kalkulacyjny wygenerowany z makra "eCPX_Sequencing" zawiera zakładkę z indywidualną analizą częstości pozostałości. Jeżeli jednak oprócz braku konsensusu nie zaobserwuje się żadnych powtarzających się sekwencji, a częstość występowania pozostałości nie wykazuje żadnego wzorca, mogą być wymagane inne rodzaje analiz. Ponadto konieczne mogą być dalsze rundy sortowania, aby uniknąć przesiewania znacznie większej liczby kandydatów w celu selekcji w dół tych, którzy mają wystarczające powinowactwo do pożądanego celu.
Wraz z rosnącą dostępnością sekwencjonowania nowej generacji, można przeprowadzić bardziej szczegółowe badania w celu określenia najbardziej obiecujących kandydatów przed przetestowaniem powinowactwa i określenia stopnia wzbogacenia po każdej rundzie biopanowania. Jednak sekwencje przechodzące do etapu analizy wiązania mogą wymagać ponownego utworzenia przez klonowanie, jeśli nie są wystarczająco częste, aby można je było łatwo wyizolować za pomocą rutynowego sekwencjonowania dziesiątek lub setek kolonii. Wraz z postępem tej technologii, która staje się coraz tańsza i bardziej rutynowa, a zwłaszcza dzięki opcji izolacji kolonii, będzie to prawdopodobnie najlepszy sposób analizy danych z biopanoramacji. Może to prowadzić do wyjaśnienia, w jaki sposób ewoluują poszczególne sekwencje i cała biblioteka. Ponadto bakterie w bibliotece sortowania mogą z czasem mutować, co może skłaniać sortowanie w kierunku komórek o szybszym tempie wzrostu lub bakterii z nadekspresją białek genomowych zdolnych do wiązania materiału nawet bez rusztowania wyświetlacza i ekspresji peptydów. Z tego powodu, gdy pojawią się obiecujący kandydaci, warto wyizolować plazmidowe DNA, ponownie przekształcić świeże E. coli i potwierdzić wiązanie peptydu przez FACS. Jeśli planuje się stosowanie peptydu w formacie bezkomórkowym, należy również ocenić powinowactwo do wolnego peptydu. Na przykład odczynniki powinowactwa peptydowego odkryte przez wyświetlacz bakteryjny dla docelowego SEB zostały syntetycznie wyprodukowane poza komórką i przeanalizowane bardziej tradycyjnymi metodami, takimi jak test immunoenzymatyczny (ELISA), a powinowactwo na komórce (za pośrednictwem FACS) i poza komórką (za pośrednictwem ELISA) porównano przy użyciu Kds określonego obiema metodami 7.
Chociaż siła interakcji biotyna-streptawidyna sprawia, że jest to idealna strategia wychwytywania docelowych i związanych peptydów białkowych, procedura ta może być modyfikowana dla innych strategii wychwytywania. Bezpośrednie sprzężenie białka z kulkami magnetycznymi, takimi jak kulki epoksydowe i kwasów karboksylowych, zakończyło się sukcesem i eliminuje etap wiązania. Jednak bezpośrednie przywiązanie może utrudniać potencjalne miejsca wiązania w określony lub niespecyficzny sposób, w zależności od strategii przywiązania. Dodatkową zaletą stosowania kulek streptawidyny jest to, że mniej stabilne cele białkowe mogą być świeżo biotynylowane w ciągu 30 minut lub przechowywane w stanie zamrożonym, jeśli zajdzie taka potrzeba, podczas gdy same kulki zwykle wymagają dłuższej inkubacji z białkiem w celu sieciowania i są zwykle przechowywane w temperaturze 2 - 8°C. Sugerowane stężenie wyjściowe biotynylowanego białka docelowego, 600 nM, sprawdziło się dla wielu celów, ale może być możliwe wyizolowanie odczynników wychwytujących peptydy o zwiększonym powinowactwie, jeśli stężenie to zostanie zmniejszone. Ponadto metoda ta może być rozszerzona i zmodyfikowana dla innych bibliotek wyświetlania bakterii i innych organizmów. Na przykład kroki te można wykonać przy braku tlenu do stosowania z beztlenowcami lub w innych środowiskach do stosowania z ekstremofilami w celu wyizolowania peptydów o unikalnych właściwościach. Peptydy i/lub konsensus określony dla określonego celu zainteresowania mogą być potencjalnie wykorzystane na komórce jako żywy materiał lub wyprodukowane syntetycznie poza komórką. Syntetycznie wytwarzane peptydy mogą być dalej dojrzewane w celu opracowania jeszcze większego powinowactwa i bardziej wytrzymałych środków wychwytywania katalizowanego białkami (PCC) do stosowania w czujnikach lub do innych zastosowań, w których przeciwciała byłyby zwykle używane do wiązania lub rozpoznawania 38,55. Modelowanie molekularne może być również wykorzystane do określenia miejsca wiązania peptydu z jego celem, jak to zostało ostatnio przeprowadzone dla peptydów wiążących abrax i konsensusu wymienionego na rysunku 5C 1. Ogólnie rzecz biorąc, biopanoramiczne biblioteki ekspozycyjne bakterii dla odczynników powinowactwa peptydów są szybką, prostą i wydajną alternatywą dla produkcji przeciwciał do rozpoznawania i wykrywania celów białkowych, a to półautomatyczne podejście do biopanoramacji przyniosło wiarygodne wyniki o daleko idących zastosowaniach.

Biopanning to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa, z bibliotekami wyświetlania bakterii wygodnym źródłem odczynników powinowactwa peptydów 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24. Podobnie jak w przypadku wyświetlania fagów 25,26 i drożdży 27,28, peptydy są eksponowane na powierzchni komórki i są dostępne do wiązania się zarówno z celami biotycznymi, jak i abiotycznymi, przy czym te interakcje są napędzane zarówno przez szkielet peptydu, jak i unikalne właściwości łańcuchów bocznych aminokwasów 29. W przeciwieństwie do wyświetlania fagów, same bakterie są samoreplikujące się i zawierają cały materiał genetyczny wymagany do ekspozycji bez elucji związanego faga i ponownej infekcji komórek. W przeciwieństwie do drożdży, ekspozycja bakteryjna jest szybsza ze względu na szybki (około 20 minut 30) czas podwojenia Escherichia coli. Powstałe w ten sposób odczynniki powinowactwa peptydów mogą być wytwarzane poza komórką do użytku na różnych platformach detekcyjnych 16,17,26 i mają potencjał do wykorzystania jako żywe materiały, gdy są wyświetlane na komórce 2,31,32. W porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi do rozpoznawania określonych celów, peptydy są znacznie mniejsze i bardziej elastyczne, a bibliotekami wyświetlania peptydów można łatwo manipulować na poziomie DNA, aby uniknąć określonych aminokwasów, takich jak cysteina 33. Peptydy są coraz częściej wykorzystywane w terapiach 34,35,36 i innych zastosowaniach, w których zwykle wykorzystuje się przeciwciała ze względu na ich łatwość wykrywania, powtarzalną produkcję syntetyczną (poza komórkami) i doskonałe utrzymanie wydajności w ekstremalnych warunkach, zapewniając funkcjonalny odczynnik nawet po wystawieniu na działanie wysokiej temperatury lub długotrwałym przechowywaniu bez chłodzenia 37,38. Zdolność do pokonania łańcucha chłodniczego w zakresie przechowywania odczynników jest szczególnie interesująca dla na przykład Departamentu Obrony, który musi działać w ekstremalnych warunkach. Stabilność termiczna była zatem pożądaną cechą odczynników o powinowactwie, rozpoznających wybrane cele podane jako przykłady w tym manuskrypcie.
Ostatnio, biblioteki wyświetlania bakterii do biopanoramowania stały się jeszcze prostsze i bardziej niezawodne dzięki zastosowaniu półautomatycznych, aktywowanych magnetycznie metod sortowania komórek (MACS lub MCS) 9,14,39. Metody te zostały zademonstrowane dla celów biologicznych przy użyciu kilku podobnych platform sortowania o różnych zaletach, w tym dostępnego na rynku automatycznego urządzenia do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (autoMACS lub autoMCS) (patrz tabela materiałów) 1,14,15 i bardziej specjalistycznych urządzeń, które zamykają próbkę w jednorazowym kartridżu 7,9 lub chip 39, cenna specyfikacja do stosowania z organizmami lub toksynami, które mają poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub wyższy7. Te półautomatyczne metody mogą zostać rozszerzone o sortowanie peptydów zdolnych do wiązania się z materiałami abiotycznymi, jeśli materiały są magnetyczne lub mają zdolność powlekania kulką magnetyczną, oraz do stosowania z różnymi organizmami (takimi jak bakterie beztlenowe), jeśli warunki sortowania i wzrostu zostaną zmienione. Oprócz sortowania bibliotek wyświetlaczy bakteryjnych, komercyjny instrument autoMCS został również częściowo wykorzystany do początkowych etapów odkrywania fragmentów ludzkich przeciwciał jednołańcuchowych wyświetlanych na powierzchni drożdży, a następnie dalszej izolacji za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) 40. Głównymi zaletami półautomatyzacji są skrócenie czasu i wysiłku związanego z sortowaniem oraz bardziej niezawodne i powtarzalne eliminowanie niezwiązanych komórek z kulek magnetycznych podczas etapów mycia, co prowadzi do zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich, mniejszej liczby wymaganych rund sortowania i mniej skomplikowanej analizy końcowej 9,14. W przypadku komercyjnego urządzenia autoMCS istnieje wiele wstępnie załadowanych programów, które mogą być optymalne dla różnych zastosowań, takich jak sortowanie wstępne ujemne (zubożenie), priorytetyzacja czystości, minimalizacja końcowej objętości próbki oraz zwiększanie lub zmniejszanie czułości izolacji rzadkich komórek 41.
Głównym celem tej pracy jest zademonstrowanie metodologii biopanowania biblioteki wyświetlaczy bakteryjnych za pomocą komercyjnie dostępnego instrumentu autoMCS, oraz wyjaśnienie procesu myślowego zastosowanego w analizie i minimalizacji wynikowej puli kandydatów w celu ułatwienia rozszerzenia na inne zastosowania. Używana tutaj biblioteka wyświetlania (patrz tabela materiałów) 12,13 zawiera około 109-10 11 unikalnych 15-merowych peptydów wyświetlanych za pomocą zmodyfikowanej wersji bakteryjnego białka błony zewnętrznej OmpX w nieograniczonym charakterze na powierzchni komórki, które oczekuje się, że będzie reprezentatywne dla wolnego peptydu w roztworze, jeśli zostanie wytworzone syntetycznie. To rusztowanie białkowe zawiera dodatkowo peptyd P2X kontroli pozytywnej na C-końcu do monitorowania ekspresji poprzez wiązanie z YPet Mona. Jednak zakupiona lub nowatorska biblioteka o odpowiedniej różnorodności i innych cechach niezbędnych dla konkretnego pożądanego zastosowania powinna działać podobnie z tą procedurą biopanoramowania, chociaż mogą być wymagane pewne drobne zmiany. Schemat tego protokołu biopanoramowania jest zilustrowany na Rysunek 1. Ponadto protokół można dostosować do innych zautomatyzowanych platform sortowania magnetycznego i innych strategii sortowania. Ręczne sortowanie magnetyczne za pomocą magnesu stołowego zostało pomyślnie zademonstrowane, aczkolwiek z bardziej skomplikowaną i czasochłonną analizą wymaganą ze względu na zwiększoną liczbę wyników fałszywie dodatnich 14, niemniej jednak stanowi alternatywną opcję dla kroków autoMCS, jeśli nie jest dostępne żadne automatyczne urządzenie do sortowania komórek magnetycznych.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>Automatyczny separator komórek do użytku z kulkami magnetycznymi</td></tr><tr><td>Bulion Luria, Miller (LB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-500</td><td>Środek</td></tr> <tr><td>zagęszczający/żelującyeCPX 3.0 Biblioteka peptydów do wyświetlania bakterii</td><td>Cytomx Therapeutics</td><td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td> <td>Biblioteka wyświetlania peptydów na komórkach. Dostarczone przez współpracowników z USCB.</td></tr><tr><td>L-arabinoza</td><td>Sigma</td><td>A3256-500G</td><td>Cukier, do indukcji ekspresji białka</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 (PBS)</td><td>Amresco</td><td>0780-10L</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna, No-Weigh</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21327</td><td>Dodaje cząsteczkę biotyny do amin pierwszorzędowych</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania biotyny Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI28005</td><td>Zapewnia, że cząsteczka biotyny jest kowalencyjnie związana z białkiem</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td>Kulki magnetyczne do wychwytywania białek zawierających biotynę</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Białko</td> <td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td>, stosowane jako środek blokujący niespecyficzne wiązanie</td></tr><tr><td>D-glukozy</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td>Cukier, do wzrostu i hamowania indukowalnej ekspresji białek</td></tr><tr><td>Ypet Mona,</td><td>UCSB i ARL</td><td>N/A</td><td>Kontrola pozytywna do monitorowania ekspresji eCPX 3.0. Wyprodukowane przez autorów i współpracowników; Patrz odnośniki 12 i 13.</td></tr><tr><td>Dylight 488 NHS Ester</td><td>Thermo Scientific</td><td>46403</td><td>Do koniugacji docelowego białka z fluoroforem</td></tr><tr><td>Streptawidyny, koniugatem R-fikoerytryny (SAPE)</td><td>Thermo Scientific</td><td>S866</td><td>Kontrola ujemna do monitorowania niespecyficznego wiązania ze streptawidyną</td></tr><tr><td>BD FACSFlow</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>342003 Bufor do uruchamiania kolumn</td></tr><tr><td>autoMACS instrumentu FACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-021-101</td><td>Do separacji MACS</td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer &ndash; Bufor separacyjny MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td>Do konserwacji urządzeń autoMACS. Zagrożenie: zawiera 0,09% azydku.</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Roztwór myjący</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-987</td><td>Do konserwacji urządzeń autoMACS</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>VWR</td><td>E505-4L</td><td>Dekontaminacja autoMACS</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279-1L</td><td>Do bakteryjnych zamrażarek</td></tr><tr><td>Chill 15 rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-952</td><td>Do separacji MACS</td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>Becton, Dickinson i Spółka</td><td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td><td>Do oceny wiązania peptydu z docelowym</td></tr><tr><td>oprogramowaniem BD FACSDiva</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>659523</td><td>Do oceny wiązania peptydu z docelowym</td></tr><tr><td>koncentratorem cząstek magnetycznych Dynabeads MPC-S</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13346</td><td>Laboratoryjny separator komórek do użytku z kulkami magnetycznymi</td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie kolonii</td><td>Genewiz</td><td>N/A; https://www.genewiz.com/</td> <td>Usługi sekwencjonowania DNA i kolonii</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td><td>Do użytku z makro analizy sekwencji</td></tr><tr><td>Antygen ochronny wąglika (PA)</td><td>Lista Biological Laboratories, Inc.</td><td>171</td><td>Białko docelowe użyte jako przykład w celu uzyskania reprezentatywnych wyników.</td></tr><tr><td>Abrax</td><td>ECBC i ARL</td><td>N/A</td><td>Białko docelowe użyte jako przykład w celu uzyskania reprezentatywnych wyników. Wyprodukowane przez autorów i współpracowników; Patrz odnośniki 1 i 15.</td></tr><tr><td>Rivax</td><td>ECBC i ARL</td><td>N/A</td><td>Białko docelowe użyte jako przykład w celu uzyskania reprezentatywnych wyników. Wyprodukowane przez autorów i współpracowników; Patrz odnośniki 1 i 15.</td></tr></tbody></table>

półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników o powinowactwie peptydów do rozpoznawania celów zarówno biotycznych, jak i abiotycznych. Odczynniki powinowactwa peptydowego mogą być używane do podobnych zastosowań do przeciwciał, w tym do wykrywania i terapii, ale są bardziej wytrzymałe i zdolne do działania w bardziej ekstremalnych warunkach. Specyficzne wzbogacanie środków wychwytujących peptydy do białka będącego przedmiotem zainteresowania jest wzmocnione za pomocą półautomatycznych metod sortowania, które usprawniają etapy wiązania i mycia, a tym samym zmniejszają występowanie fałszywie dodatnich substancji wiążących. W niniejszym dokumencie opisano półautomatyczną metodę sortowania do użytku z komercyjnym zautomatyzowanym urządzeniem do sortowania komórek aktywowanym magnetycznie z nieograniczoną biblioteką sortowania wyświetlaczy bakteryjnych wyrażającą losowe peptydy 15-merowe. Z niewielkimi modyfikacjami metody te można rozszerzyć na inne zautomatyzowane urządzenia, inne biblioteki sortujące i inne organizmy. Podstawowym celem tej pracy jest dostarczenie kompleksowej metodologii i wyjaśnienie procesu myślowego stosowanego w analizie i minimalizacji wynikowej puli kandydatów. Techniki te obejmują analizę wiązania na komórkach za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), w celu oceny powinowactwa i swoistości podczas sortowania i porównywania poszczególnych kandydatów, a także analizę sekwencji peptydowych w celu identyfikacji trendów i sekwencji konsensusu w celu zrozumienia i potencjalnej poprawy powinowactwa i swoistości dla celu będącego przedmiotem zainteresowania.

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury bio-panningu jest szybka izolacja peptydowych czynników wychwytujących specyficznych dla wybranego białka docelowego oraz sprawne wyeliminowanie niespecyficznych kandydatów z dalszych analiz. Metoda ta może być wykorzystywana do odkrywania stabilnych peptydowych odczynników powinowactwa w szerokim zakresie zastosowań, od wykrywania zagrożeń biologicznych po diagnostykę chorób. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiej izolacji peptydowych odczynników powinowactwa w czasie około jednego tygodnia, bez konieczności przeprowadzania zaawansowanego szkolenia.Chociaż metodę tę można wykorzystać do poszukiwania odczynników peptydowych o określonym powinowactwie do zastosowań pozakomórkowych, peptydy te mogą służyć również jako materiały żywe. Zazwyczaj najtrudniejszym aspektem dla osób rozpoczynających pracę z tą metodą będzie późniejsza analiza sekwencji kandydatów, która jest ściśle powiązana z przedstawionymi tutaj protokołami eksperymentalnymi. Biopanning bibliotek bakterii display jest procesem cyklicznym, który rozpoczyna się od sortowania negatywnego przeciwko samym kuleczkom magnetycznym, aby usunąć wszelkie nieswoiste wiązania z materiału kuleczek lub dołączonych do nich białek wychwytujących.Należy zachować frakcję negatywną, która nie wiąże się z kulkami magnetycznymi. Dodatkową selekcję negatywną można przeprowadzić przeciwko wszelkim potencjalnym białkowym celom o reaktywności krzyżowej, ponownie zachowując frakcję negatywną, która nie wiąże się z kulkami magnetycznymi. Kolejne etapy selekcji pozytywnej są bardzo podobne do selekcji negatywnej przeciwko białkowemu celowi, jednak tym razem zachowuje się frakcję pozytywną związaną z kulkami magnetycznymi.W celu przeprowadzenia sortowania pozytywnego biblioteki bakteryjnej, w pierwszej kolejności należy zaszczepić 500 ml pożywki Luria Broth Miller z dodatkiem chloramfenikolu (LBCM-25) około 1×10¹¹ komórek zróżnicowanej biblioteki bakteryjnej, która została wcześniej oczyszczona z niepożądanych peptydów poprzez sortowanie negatywne. Bibliotekę inkubuje się w temperaturze 37 °C przy 225 RPM, aż do osiągnięcia gęstości optycznej OD 600 na poziomie 0,5–0,55. Następnie indukuje się ekspresję peptydów za pomocą 0,04% L-arabinozy przez 45 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.Po zakończeniu okresu indukcji umieść hodowlę na lodzie. Następnie odwirowuj i zbierz 2 × 10¹¹ komórek bakteryjnych. Osad resuspenderuj w 1,5 ml PBS, delikatnie go mieszając.Następnie, jeśli jest to konieczne, podzielić bakterie do kilku probówek do mikrocentryfugi przed drugim wirowaniem. Osad zawiesić ponownie w 1 mL PBS z dodatkiem odpowiedniego celu biotinylacji i inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze. W tym czasie 100 µL kulek z kodem streptawidyny przemyć w 1 mL PBS z dodatkiem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) poprzez wirowanie.Umieść wypłukane kulki w laboratoryjnym separatorze magnetycznym i ostrożnie usuń nadsącz, uważając, aby nie poruszyć osadu. Po zakończeniu inkubacji rotacyjnej odwiruj komórki, aby zebrać z nadsączu wszelki niezwiązany cel, a następnie zawieś osad komórek bakteryjnych związanych z białkiem docelowym w 1 mL PBS z dodatkiem BSA. Wykorzystaj całą objętość komórek bakteryjnych do zawieszenia osadu kulek.Inkubować w temperaturze 4°C na platformie rotacyjnej przez 30 minut. Następnie umieścić roztwór kulek i bakterii na lodzie. Włączyć instrument AutoMax w celu zainicjowania systemu, a następnie w menu separacji wybrać opcje „wash now” (myj teraz), „rinse” (płukanie) oraz „run” (uruchom), aby przepłukać linie odpowiednio buforami do mycia i buforami do prowadzenia procesu producenta.Po zakończeniu płukania ponownie odpowietrz linie, używając buforu PBS z BSA. Gdy instrument będzie gotowy, przenieś mieszaninę bakterii i kulek do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml i przepłucz probówkę dodatkowymi 500 µl świeżego PBS z BSA. Pobierz przemywkę zawierającą mieszaninę bakterii i kulek, a następnie umieść probówkę w slocie na próbki w statywie do probówek stożkowych w temperaturze 4 °C.Umieść puste probówki do zbierania o pojemności 15 ml w gniazdach selekcji pozytywnej i negatywnej statywu, a następnie przenieś statyw na platformę urządzenia. Przypisz program separacji dla każdej próbki na statywie, dodając etap płukania pomiędzy każdą próbką oraz po ostatniej próbce. Wybierz opcję uruchomienia, aby rozpocząć separację komórek, a następnie zatwierdź przyciskiem OK lub Kontynuuj, aby potwierdzić dostępność odpowiedniej ilości buforu.Po zakończeniu programu wyjmij statyw i umieść frakcję dodatnią zawierającą zarówno bakterie, jak i kuleczki w lodzie. Po przygotowaniu linii w sposób przedstawiony powyżej, przy użyciu buforów do pracy i płukania producenta, wybierz opcję zasilania (power) oraz „tak” (yes), aby wyłączyć urządzenie, i upewnij się, że w butelce z roztworem do przechowywania znajduje się 70% ethanol do dekontaminacji. Po całkowitym wyłączeniu systemu butelki przyjmą kolor fioletowy.Urządzenie można wyłączyć. Następnie całą frakcję sortowania pozytywnego należy wykorzystać do inokulacji jednego litra pożywki LBCM25 uzupełnionej o D-glukozę w celu hodowli nocnej w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Aby przeanalizować sukces izolacji reagentu powinowactwa po każdej rundzie sortowania, na koniec indukcji peptydów po sortowaniu, należy dodać 5 µL indukowanych komórek do 25 µL roztworów zgodnie z tabelą.Po 45-minutowej inkubacji na lodzie, zbierz bakterie z każdego roztworu poprzez wirowanie i odessań nadosad z każdej próbki. Trzymając probówki z próbkami na lodzie, wybierz administratora w oprogramowaniu instrumentu FAX i otwórz odpowiedni folder analizy. Kliknij nowy eksperyment.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmienić nazwę eksperymentu, i kliknij global worksheets. Kliknij ikonę wykresu punktowego w arkuszu global worksheet, aby utworzyć nowy wykres rozrzutu. Następnie zaznacz sam wykres punktowy i wybierz ikonę inspektora.Kliknij pola obok osi X i Y w otwartym oknie, aby ustawić osie na wyświetlanie bieksponecyjnie, a następnie zamknij okno inspektora. Kliknij eksperyment i utwórz nowy preparat, klikając prawym przyciskiem myszy, aby zmienić nazwę preparatu zgodnie z wymogami eksperymentu. Następnie kliknij znak plus, aby rozwinąć preparat i zmienić nazwę próbki.Aby przeprowadzić analizę próbki kontrolnej ujemnej, ponownie zawiesić pellet zawierający tylko PBS w 500 µL lodowatego buforu do elektroforezy FAX, mieszając dokładnie za pomocą pipety. Przenieść próbkę do probówki FAX, potrząsając nią, aby utrzymać komórki w roztworze, a następnie wprowadzić próbkę do rurki wtryskowej (SIT) urządzenia. Kliknąć dwukrotnie aktualną probówkę z próbką i wybrać opcję pozyskiwania danych (acquired data).Następnie wyświetl zdarzenia na wcześniej przygotowanym wykresie kropkowym area side scatter względem area forward scatter, dostosowując w razie potrzeby próg napięcia fotopowielacza w zakładce threshold, tak aby komórki kontroli negatywnej znajdowały się w pobliżu centrum. Gdy próbka jest odczytywana prawidłowo, dostosuj szybkość przepływu tak, aby wyświetlać od 200 do 2 000 zdarzeń na sekundę, i kliknij record data, aby zarejestrować minimum 10 000 zdarzeń. Po nabyciu wszystkich zdarzeń wyjmij probówkę z próbką z SIT.Wybierz ikonę bramkowania wielokątnego i obrysuj bramkę wokół większości populacji komórek na wykresie rozrzutu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wykresie kropkowym, aby wybrać opcję wyświetlania hierarchii populacji, a następnie kliknij P1 w hierarchii populacji i utwórz nowy wykres kropkowy, aby wyświetlić populację P1. Kliknij prawym przyciskiem myszy na każdej z osi, aby zmienić oś Y na FITC area, a oś X na forward scatter area, a następnie ustaw osie na skalę bi-wykładniczą.Użyj bramki wielokąta (polygon gate), aby obrysować komórki kontroli negatywnej tak ściśle, jak to możliwe, wzdłuż górnej i lewej strony populacji, a następnie wybierz P2 w hierarchii populacji i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję odwróć bramkę (invert gate). Mniej niż 1% populacji powinno znajdować się poza bramką. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wykres kropkowy z bramką P2, aby wybrać opcję pokaż populacje (show populations), a następnie zaznacz do wyświetlenia populacje P2 oraz not P2.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy z bramką P2, aby wybrać opcję utworzenia widoku statystyk (create statistics view), a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy okno widoku statystyk, aby wybrać edycję widoku statystyk (edit statistics view). W karcie populacji (populations) dodaj lub usuń populacje w zależności od potrzeb, w tym nadrzędną populację P1. Populacje P2 oraz not P2 powinny być już widoczne.Następnie w zakładce statystyk (statistics) dodaj parametr FITC area medium oraz wszelkie inne interesujące statystyki i kliknij OK, aby zamknąć okno. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wykres rozrzutu P2 i wybierz opcję „duplicate” (duplikuj), aby utworzyć podobny wykres kropkowy dla PE area w stosunku do FSC area. Dostosuj oś Y i wykorzystaj próbkę zawierającą sam PBS do wyznaczenia bramki dla populacji P3.Następnie odwróć bramkę i wyświetl odpowiednie populacje. Po ustawieniu wszystkich właściwych bramek wykorzystaj arkusz kalkulacyjny do analizy wszystkich próbek, rejestrując około 10 000 zdarzeń na probówkę.Jak pokazano w tym reprezentatywnym eksperymencie, wiązanie Ypet Mona do unieruchomionego peptydowego kontrolnego dodatniego może pomóc w monitorowaniu poziomu ekspresji indukowanej biblioteki peptydów w obrębie populacji. Komórki pozbawione peptydów eksponowanych na powierzchni są zazwyczaj eliminowane podczas procesu sortowania, co zaobserwowano w rundach trzeciej i czwartej. Wzbogacenie biblioteki o peptydy wiążące się ze specyficznym celem jest zazwyczaj osiągane w ciągu trzech rund sortowania dodatniego.Kontynuacja sortowania w czwartej rundzie może być korzystna, ponieważ sekwencje peptydowe o najwyższym powinowactwie, obecne już w trzeciej rundzie, prawdopodobnie ulegną dalszemu wzbogaceniu w rundzie czwartej, co wspomaga proces selekcji potencjalnych kandydatów. Specyficzność ocenia się poprzez porównanie wiązania z zamierzonym celem z wiązaniem z potencjalnymi celami reaktywnymi krzyżowo, takimi jak te użyte do sortowania negatywnego. Analiza sekwencji z czwartej rundy sortowania zazwyczaj ujawnia powtarzające się sekwencje, które stanowią doskonałe punkty wyjścia do analiz powinowactwa i specyficzności.Analiza dopasowania sekwencji powtarzających się może zostać wykorzystana do ujawnienia obecności sekwencji konsensusowej, która może pomóc w zawężeniu wyboru kandydatów. Reprezentatywna kolonia z każdej sekwencji powtarzającej się może następnie zostać poddana dalszej analizie pod kątem powinowactwa on-cell oraz specyficzności, aby ocenić wiązanie peptydów z białkiem docelowym i białkami reaktywnymi krzyżowo. Po opanowaniu metody, pełny eksperyment biologiczny obejmujący wstępną analizę powinowactwa i specyficzności można przeprowadzić w czasie krótszym niż dwa tygodnie, pod warunkiem prawidłowej realizacji.Podczas przeprowadzania pełnej procedury należy pamiętać, że w celu pełnego zrozumienia przejść związanych z powinowactwem wiązania może być konieczne kilkukrotne przeplatanie oceny wiązania z analizami sekwencji. Dołączyliśmy pomocniczy plik makr, który opracowaliśmy w celu zautomatyzowania znacznej części analizy peptydów i dalszego usprawnienia wyboru kandydatów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko izolować agenty wychwytujące peptydy z biblioteki display bakteryjnej oraz jak eliminować niespecyficzne kandydaty z dalszych analiz downstream.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak ALIZA, aby potwierdzić powinowactwo i swoistość wiązania pozakomórkowego.

semi-automated-biopanning-bacterial-display-libraries-for-peptide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje metodę badania interakcji białko-lek za pomocą biopanowania biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi T7 za pomocą biosensora QCM. Biopanowanie fagów wyświetlających określony peptyd na biosensorze QCM pozwala na specyficzną izolację peptydów o wysokim powinowactwie, a następnie sekwencjonowanie aminokwasów, co pomaga zidentyfikować określone miejsca interakcji na białku docelowym.

Biopanowanie oparte na biosensorach mikrowagi kwarcowej do badania interakcji białko-lek

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.

Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Poznaj półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego. Ta metoda umożliwia szybką izolację peptydów w ciągu tygodnia przy minimalnym ryzyku fałszywych pozytywów.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów (Wideo) | JoVE Journal

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Przeglądaj więcej filmów