Badania przesiewowe bioaktywnych nanocząstek w fagocytarnych komórkach odpornościowych pod kątem inhibitorów sygnalizacji receptora toll-podobnego

Ogólnym celem tej procedury przesiewowej jest zidentyfikowanie nowych bioaktywnych nanocząstek, które mogą hamować sygnalizację receptorów toll-podobnych. Ta metoda może pomóc w fizycznej identyfikacji nowych nanoinhibitorów ukierunkowanych na sygnalizację receptora toll-podobnego we wrodzonych komórkach odpornościowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i wytrzymała oraz łatwa do wykonania przy użyciu systemów ogniw reporterowych.

Zastosowania tej techniki rozciągają się w kierunku terapii wielu chorób zapalnych, ponieważ stwierdzono, że sygnalizacja receptora toll-podobnego jest zaangażowana w patogenezę tych chorób. Chociaż metoda ta może zapewnić wysokie badania przesiewowe i nanocząstki złota, może być również stosowana do innych systemów nanocząstek, a także terapeutycznych małych cząsteczek i biologii. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować pożywki hodowlane zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie dodaj 100 mililitrów ultra czystej wody wolnej od endotoksyn do czystej szklanej kolby o pojemności 125 mililitrów. Dodać jedną saszetkę wydzielanego embrionalnego substratu fosfatazy alkalicznej w proszku i delikatnie mieszać roztwór, aż do całkowitego rozpuszczenia. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie substratów.

Za pomocą membrany o średnicy 0,2 mikrometra przefiltruj roztwór. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Następnie dodaj jedną saszetkę substratu lucyferazy w proszku do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 25 mililitrów ultra czystej wody wolnej od endotoksyn.

Po całkowitym rozpuszczeniu proszku przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do tygodnia, aż będzie gotowy do użycia. Następnie przygotuj roztwory podstawowe wszystkich pozostałych odczynników zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po wyhodowaniu i przygotowaniu komórek przenieść je z kolby hodowlanej do probówki wirówkowej.

Wiruj komórki z prędkością 300 razy G przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś je w pożywce R-10 w stężeniu 1 X 10 do 6 komórek na mililitr. Dodać podwielokrotności roztworu PMA do zawiesiny komórek tak, aby końcowe stężenie wynosiło 50 nanogramów na mililitr.

Wlej zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika na odczynnik. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki hodowlanej z płaskim dnem. Inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie użyj aspiratora próżniowego, aby ostrożnie usunąć pożywkę hodowlaną. Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź komórki, aby upewnić się, że uzyskane makrofagi przylegają do dna studzienki. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie, używając 100 mikrolitrów PBS na studzienkę do każdego przemycia.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki R-10 do każdej studzienki. Pozwól komórkom odpoczywać przez dwa dni w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed przeprowadzeniem testu reporterowego. Najpierw należy określić optymalną dawkę LPS zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie dodaj 180 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu Quanti-Blue do każdego dołka nowej 96-dołkowej płaskiej płytki dennej. Następnie przenieś 20 mikrolitrów supernatantu z każdej próbki na płytkę. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin, aby kolor zmienił się z różowego na ciemnoniebieski.

Gdy gęstość optyczna przekroczy jeden, użyj czytnika płytek, aby określić absorpcję przy 655 nanometrach. Aby rozpocząć analizę aktywacji IRF, należy przenieść 10 mikrolitrów świeżego supernatantu z każdej próbki do świeżej 96-dołkowej, przezroczystej, białej płytki z płaskim dnem. Korzystając z automatycznego wstrzykiwania, dodaj 50 mikrolitrów roztworu lucyferazy do każdej studzienki.

Następnie natychmiast dobrze zbierz luminescencję, aby uzyskać krzywą odpowiedzi na dawkę w celu określenia optymalnego stężenia LPS do badań przesiewowych nanocząstek. Następnie odwirować 20 objętości roztworu hybrydowego peptydu-GMP w 1,5-mililitrowych probówkach Eppendorfa w temperaturze 18 000 razy G przez 30 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatanty.

Przenieś hybrydy do jednej świeżej probówki i umyj je dwukrotnie jednym mililitrem PBS. Następnie ponownie zamieszaj umyte hybrydy w jednej objętości pożywki R-10. Wymieszać równe objętości skoncentrowanych hybryd i pożywki LPS zawierającej R-10 tak, aby końcowe stężenie hybryd i LPS wynosiło odpowiednio 100 nanomolowych i 10 nanogramów na mililitr.

Następnie usuń pożywkę hodowlaną z płytki do hodowli makrofagów. Dodać 100 mikrolitrów hybrydowej mieszaniny LPS do każdego dołka, z trzema powtórzeniami dla każdego warunku. Obejmują kontrolę ujemną i kontrolę LPS.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie przenieś pożywkę z każdej studzienki do oddzielnej probówki wirówkowej. Odwirować probówki w temperaturze 18 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut.

Przenieść supernatanty do świeżej 96-dołkowej okrągłej płytki dennej. Aby rozpocząć test reporterowy na tych próbkach, dodaj 180 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu Quanti-Blue do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Następnie przenieś 20 mikrolitrów supernatantów z każdej próbki na tę płytkę.

Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin, aż ciemnoniebieski kolor rozwinie się do gęstości optycznej powyżej jednego. Następnie użyj czytnika płytek, aby zarejestrować absorpcję przy 655 nanometrach. Następnie przenieś 10 mikrolitrów świeżego supernatantu z każdej próbki do 96-dołkowej przezroczystej białej płytki z płaskim dnem.

Za pomocą automatycznego wstrzykiwacza dodaj 50 mikrolitrów roztworu lucyferazy do każdej studzienki i natychmiast zapisz luminescencję dobrze po dołku. Następnie zweryfikuj efekt hamujący potencjalnych kandydatów i oceń swoistość TLR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu aktywacja NF-Kappa B AP1 jest wykrywana za pomocą testu kolorymetrycznego SEAP, w którym aktywacja TLR-4 przez LPS powoduje aktywację NF-Kappa B AP1 i produkcję SEAP.

Uwolniony SEAP przekształca substrat, prowadząc do zmiany koloru, która jest proporcjonalna do ilości SEAP uwalnianego po stymulacji. Określa się to ilościowo, mierząc absorbancję przy 655 nanometrach. Następnie, aktywacja IRF za pośrednictwem LPS doprowadziła do ekspresji lucyferazy, katalizując substrat w celu wytworzenia luminescencji.

Optymalne stężenie LPS wynoszące 10 nanogramów na mililitr jest określane na podstawie tych reakcji na dawkę w celu przesiewu wcześniej ustalonej biblioteki hybryd peptyd-GMP. Na tej podstawie zidentyfikowano grupę hybryd ze względu na ich silną zdolność do hamowania aktywacji wyzwalanej przez LPS zarówno dla NF-Kappa B AP1, jak i IRF. Walidacja tej aktywności hamującej pokazuje, że wraz ze wzrostem stężenia LPS hamujące działanie hybrydy zmniejsza się, zgodnie z oczekiwaniami.

Następnie przeprowadza się immunoblotting w celu potwierdzenia aktywności hamującej. Obserwuje się, że wiodąca hybryda zmniejsza fosforylację p65, hamuje degradację I-Kappa B alfa i opóźnia fosforylację IRF3, potwierdzając, że wiodąca hybryda, P12, jest w stanie hamować sygnalizację TLR-4 pośredniczącą w LPS. Dodatkowe badania ujawniają, że P12 zmniejsza również sygnalizację AP1 NF-Kappa B za pośrednictwem TLR-2 i TLR-5, a także aktywację IRF za pośrednictwem TLR-3, co sugeruje, że P12 ma silną aktywność hamującą na wielu szlakach TLR.

Po tej procedurze należy przeprowadzić inne pomiary, takie jak immunoblotting i test cytotoksyczności, w celu walidacji wyników badań przesiewowych i uniknięcia fałszywie dodatnich wyników. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę innym badaczom w dziedzinie nanomedycyny do zbadania nanoinhibitorów w sygnalizacji receptorów toll-podobnych jako terapii nowej generacji i terapeutycznych.