Name: Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj technikę przeszczepu komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE do zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura. Ta metoda chirurgiczna promuje regenerację aksonów w poprzek miejsca urazu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Wektorom Wirusowym i Rdzeniom Zwierzęcym z Miami Project to Cure Paralysis za wyprodukowanie wirusa lenti-GFP i zapewnienie opieki nad zwierzętami, odpowiednio, oraz Rdzeniom Histologii i Obrazowania za użycie kriostatu, mikroskopu konfokalnego i mikroskopu fluorescencyjnego z Stereo Investigator. Finansowanie zostało zapewnione przez NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) i NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge jest profesorem neurologii im. Christine E Lynn.

Samice dorosłych szczurów Fischer (180 - 200 g masy ciała) są trzymane zgodnie z wytycznymi NIH i USDA. Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) Uniwersytetu w Miami zatwierdził wszystkie procedury na zwierzętach.
1. Przygotowanie do przeszczepu
<ol>
	<li>Przygotowanie przewodu.
	<ol>
		<li>Przyciąć przewód do długości 5 mm za pomocą ostrza #10 pod mikroskopem preparacyjnym. 
		UWAGA: Średnica wewnętrzna przewodu wynosi od 2,4 do 2,7 mm; Średnica zewnętrzna wynosi od 2,5 do 2,8 mm.</li>
		<li>Delikatnie złóż przewód wzdłuż podłużnej strony (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Wytnij cztery małe nacięcia o długości około 0,4 mm i co najmniej 1 mm od otworów przewodu i w odległości około 1 mm od siebie za pomocą nożyczek Vannas o prostej krawędzi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).
		<ol>
			<li>Rozłóż przewód (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C) i przetnij między dwoma nacięciami po tej samej stronie, tworząc dwa okna obok siebie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Upewnij się, że okna można prawidłowo otwierać i zamykać wzdłuż nieobciętej strony.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sterylizuj przewody w 75% etanolu przez 25 minut na 10-centymetrowej szalce Petriego. Przepłukać przewody raz przez 4 minuty 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i przenieść przewody za pomocą sterylnych kleszczy na nową 10-centymetrową szalkę Petriego. Przepłucz przewody dwukrotnie 1x PBS przez 25 minut każdy.</li>
		<li>Przechowuj przewody w 1x PBS do czasu operacji. 
		UWAGA: Wiele przewodów może być sterylizowanych jednocześnie. Przechowuj przewody w oddzielnych sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, aby zachować ich sterylność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat z białka zielonej fluorescencji (GFP)-komórek Schwanna (SC)
	<ol>
		<li>Przygotuj oczyszczone kultury SC z nerwów piszczelowych dorosłych samic szczurów Fischer, jak opisano wcześniej43. Po zakończeniu tego etapu, pokryj SC na 10-centymetrowych szalkach Petriego pokrytych poli-L-lizyną (PLL) i utrzymuj w pożywce D10/3M; te SC są zdefiniowane jako przejście 0, 
		UWAGA: Pożywka D10/3M składa się z następujących składników: 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec), 20 μg/ml ekstraktu z przysadki mózgowej, 2 μM forskoliny, 2,5 nM hereguliny w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco.</li>
		<li>Uzupełniaj świeżą pożywką D10/3M (7 ml/10 cm szalka Petriego) co 3 do 4 dni.</li>
		<li>Podziel kulturę SC, gdy osiągnie 70-80% konfluencji.
		<ol>
			<li>Usuń podłoże i spłucz dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) bez wapnia i magnezu.</li>
			<li>Dodaj 5 ml 0,25% trypsyny/EDTA do każdej 10-centymetrowej szalki Petriego i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
			<li>Dodaj 5 ml pożywki D10 (10% FBS i 1% pióra/paciorkowca w DMEM) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, aby zneutralizować trypsynę.</li>
			<li>Delikatnie odpipetować roztwór trypsyny/EDTA do szalki Petriego kilka razy, aby odłączyć SC. Usunąć zawiesinę komórkową z naczynia i umieścić ją w probówce wirówkowej przygotowanej w poprzednim kroku. Opłucz naczynie 5 ml pożywki D10 i umieść ją w probówce wirówkowej, aby zmaksymalizować pobranie komórek.</li>
			<li>Odwirować komórki przy ciśnieniu 370 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce o objętości 4 ml D10/3M dla każdej podziałki na płytkę Petriego.</li>
			<li>Dozować 1 ml zawiesiny SC i 6 ml pożywki D10/3M do 10-centymetrowej szalki Petriego; każde rozdrobnienie szalki Petriego da 4 szalki Petriego. Te SC są zdefiniowane jako przejście 1.</li>
			<li>Uzupełnij świeżą pożywką D10/3M dzień po poszyciu i co 3-4 dni po poszyciu.</li>
			<li>Gdy SC osiągną zbieżność 70-80%, powtórz kroki od 1.2.3.1 do 1.2.3.6. SC znajdują się teraz w przejściu 2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transdukuj SC raz osiągając 50% konfluencji, za pomocą wektora lentiwirusowego kodującego GFP w pożywce D10/3M przez noc przy wielokrotności infekcji 30, jak opisano wcześniej 44,45.</li>
		<li>Uzupełnij świeżą pożywką D10/3M następnego dnia i co 3-4 dni po posiewaniu.</li>
		<li>Gdy GFP-SC osiągną zbieżność 70-80%, powtórz kroki od 1.2.3.1 do 1.2.3.5, ale zamiast tego ponownie zawieś GFP-SC w 6 ml pożywki D10. Dozować 15 μl zawiesiny GFP-SC do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 15 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Delikatnie przesunąć probówkę wirówkową i wlać 10 μl mieszaniny do komory szkiełka do liczenia komórek.
		<ol>
			<li>Umieść szkiełko w automatycznym liczniku komórek i określ gęstość komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 370 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić 1,5 ml pożywki zamrażającej na każde 3x106 GFP-SC. Dozować 1,5 ml zawiesiny GFP-SC do fiolki kriogenicznej i zamrażać w temperaturze -80oC przez co najmniej 24 godziny przed przejściem do ciekłego azotu w celu przechowywania><.
		UWAGA: Podłoże zamrażające: 25% FBS i 8% dimetylosulfotlenku w DMEM.</li>
		<li>Rozmrozić GFP-SC na tydzień przed zabiegiem.
		<ol>
			<li>Dodaj 10 ml pożywki D10 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
			<li>Rozmrażać fiolki z zamrożonymi GFP-SC w łaźni wodnej w temperaturze 37 oC aż do częściowego rozmrożenia.</li>
			<li>Usunąć zawiesinę GFP-SC z fiolki kriogenicznej i umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml przygotowanej w ppkt 1.2.8.1. Delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół.</li>
			<li>Odwirować komórki w temperaturze 370 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 4 ml pożywki D10/3M na każdą rozmrożoną fiolkę.</li>
			<li>Dozować 2 ml zawiesiny GFP-SC i 5 ml pożywki D10/3M na 10-centymetrową szalkę Petriego; w wyniku każdej fiolki powinny znajdować się 2 szalki Petriego. GFP-SC są zdefiniowane jako przejście 3. 
			UWAGA: Z 10-centymetrowej szalki Petriego zwykle po tygodniu powstaje około 8x106 GFP-SC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W dniu zabiegu powtórz krok 1.2.6. Użyj gęstości komórek obliczonej w kroku 1.2.10.</li>
		<li>Dozować podwielokrotności 3x106 GFP-SC do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml w oparciu o gęstość komórek obliczoną z kroku 1.2.9. Odwirować porcje GFP-SC przy 370 x g przez 5 minut w temperaturze 4 otemperaturze C i usunąć supernatant. Dodać 1 ml pożywki DMEM/F12 do każdej podwielokrotności i odwirować przy 370 x g. 
		UWAGA: Każde zwierzę otrzymuje 3x106 GFP-SCs. Pożywka z surowicą jest używana z GFP-SC do tego etapu.</li>
		<li>Przechowywać GFP-SC na lodzie do czasu przeszczepienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ukończ przecięcie na poziomie klatki piersiowej 8 (T8)
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierząt do operacji
	<ol>
		<li>Znieczulić samicę szczura Fischera (180-200 g) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy (60 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (5 mg/kg masy ciała). Monitoruj głębokość znieczulenia przed przejściem do następnego kroku, sprawdzając reakcje szczypania palców u nóg i mrugania oczami.</li>
		<li>Ogol grzbiet szczura elektryczną maszynką do strzyżenia i przetrzyj skórę 70% etanolem. Nałóż lubrykant okulistyczny na oba oczy. Przenieś zwierzę na stół operacyjny na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie około 37 oC. Umieść zwierzę na rolce, aby kręgi były łatwo dostępne. 
		UWAGA: Rolka może być wykonana z ręcznika papierowego lub gazy 2 cale x2, którą można sterylizować. Większe rolki są zalecane, gdy T7-T9 musi być ułożony płasko na wierzchu rolki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laminektomia od T7 do T9
	<ol>
		<li>Zlokalizuj punkt orientacyjny dla wyrostków kolczystych T9-T11. 
		UWAGA: Luki między T9, T10 i T11 są niewielkie w porównaniu z innymi segmentami w regionie. Po umieszczeniu szczura na rolce, wyrostki kolczyste T9-T11 będą odczuwane jako mały trójkątny guzek przez skórę.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie skóry o długości od 4 do 5 cm w linii środkowej za pomocą ostrza #10 od T4 do T11. Wykonaj małe nacięcie w powierzchownej warstwie tłuszczu zakrzywionymi nożyczkami z końcami, aby wyciąć tłuszcz. 
		UWAGA: Do oddzielania tłuszczu można używać innych rodzajów narzędzi, ale zakrzywione nożyczki z końcami umożliwiają najskuteczniejszą i najmniej inwazyjną metodę separacji tłuszczu.</li>
		<li>Zlokalizuj wyrostki kolczyste od T7 do T9 za pomocą tylnej części ostrza #10. Przytrzymaj mięsień na poziomie około T4 za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie w mięśniu wzdłuż każdej strony kręgów od T6-T10. Wykonaj cięcie jak najbliżej kręgów, aby zrobić czysty otwór i spowodować minimalne obrażenia zwierzęcia.</li>
		<li>Odizoluj każdy pojedynczy wyrostek kolczysty od T7 do T9, przecinając mięśnie i więzadła między T6 i T7, T7 i T8, T8 i T9 oraz T9 i T10 za pomocą ostrza #10.</li>
		<li>Użyj rongeur, aby usunąć wszelkie mięśnie i więzadła na blaszkach od T7 do T9. Usuń mięśnie i więzadła tak bocznie, jak to możliwe, aż będą widoczne przerwy między wyrostkami poprzecznymi od T7 do T9.</li>
		<li>Usuń wyrostek kolczysty T9 za pomocą rongeur. Przytrzymaj wyrostek kolczysty T8 kleszczami i delikatnie podnieś, aby podnieść blaszkę T9 w małym otworze między wyrostkami T9 i T10.</li>
		<li>Usuń blaszkę, zaczynając od otworu i poruszając się rostralnie za pomocą rongeur w T9. Usuń blaszkę z boku tak bardzo, jak to możliwe; Korzenie grzbietowe powinny być widoczne po laminektomii.</li>
		<li>Po usunięciu blaszki powtórz proces dla T8 i T7. 
		UWAGA: Podczas laminektomii użyj włóczni absorpcyjnych, aby usunąć krew, kontynuując laminektomię. Jeśli wystąpi nadmierne krwawienie, umieść ściśniętą gąbkę w miejscu krwawienia i dodaj sól fizjologiczną, aby pomóc w krzepnięciu krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przecięcie w T8
	<ol>
		<li>Umieść zwijacz wokół T7 do T9. Po usunięciu wszystkich blaszek upewnij się, że przerwy między wyrostkami poprzecznymi są widoczne, szczególnie w T8. Sprawdź również kości wzdłuż długości po obu stronach między T7 a T9, aby upewnić się, że nie ma żadnych fragmentów kości wystających na zewnątrz. 
		UWAGA: Ta przerwa w T8 jest ważna dla wykonania pełnego przecięcia. Kręgi na całej długości powinny zostać usunięte w celu łatwiejszego wprowadzenia przewodu.</li>
		<li>Przetnij korzenie grzbietowe i brzuszne powyżej i poniżej T8 za pomocą kątowych nożyczek sprężynowych. Dodaj sól fizjologiczną do rdzenia kręgowego i poczekaj, aż krew zacznie krzepnąć. 
		UWAGA: Ten krok jest ważny dla prawidłowego wstawienia przewodu.</li>
		<li>Umieść kątowe nożyczki sprężynowe nad rdzeniem kręgowym w szczelinach między wyrostkami poprzecznymi w T8 i wykonaj jedno cięcie, aby całkowicie przeciąć rdzeń kręgowy. Umieść mały kawałek sprasowanej pianki w powstałej szczelinie 2-2,5 mm i natychmiast dodaj sól fizjologiczną do tego obszaru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wstawianie kanału
<ol>
	<li>Czekając, aż odcięte kikuty pępowinowe osiągną hemostazę, wyjmij przewód z 1x PBS. Pokrój trójkąty absorpcyjne na cienkie, długie kawałki i umieść je w przewodzie, aby usunąć nadmiar PBS. Sprawdź, czy wstępnie wycięte okna są otwarte.</li>
	<li>Usuń sól fizjologiczną i krew za pomocą cienkich, długich kawałków trójkątów absorpcyjnych. Podnieś dwa kikuty rdzenia kręgowego za pomocą mikroszpatułki, aby zapewnić dobrą separację. Delikatnie podnieś kikut rostralny za pomocą mikroszpatułki i nasuń przewód na pień tak, aby okna były skierowane do siebie. Upewnij się, że cały kikut jest włożony i nie ma nadmiernego krwawienia do przewodu.</li>
	<li>Delikatnie podnieś kikut ogonowy i wsuń drugi koniec przewodu na kikut. Upewnij się, że cały kikut jest włożony, a okna znajdują się na powierzchni grzbietowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
</ol>
4. Komórka Schwanna/ Matryca iniekcyjna (patrz Tabela Materiałów) Przygotowanie i wstrzyknięcie
<ol>
	<li>Czekając, aż odcięta pępowina osiągnie hemostazę, usuń pożywkę znajdującą się powyżej osadu GFP-SC (przygotowanego w kroku 1.2). Zawiesić GFP-SC w 10 μl zimnego DMEM/F12. Dodać 10 μl zimnego żelu do wstrzykiwań do zawiesiny komórek i dobrze wymieszać, wielokrotnie pipetując. Mieszaninę GFP-SC/DMEM/F12/matrycy do wstrzykiwań należy przechowywać na lodzie do momentu zakończenia wprowadzania przewodu.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że okienka na powierzchni grzbietowej są otwarte (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), wstrzyknij 20 μl mieszaniny GFP-SC/DMEM/F12/matrycy do wstrzykiwań do przewodu przez jedno z wstępnie wyciętych okien46 za pomocą końcówki ładującej western blot i mikropipety. Jeśli mieszanina SC/DMEM/F12/matrycy do wstrzykiwań przepełni przewód, usuń nadmiar za pomocą trójkątów absorpcyjnych. Zamknąć okna po wstrzyknięciu; szycie nie jest potrzebne (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
</ol>
5. Zamykanie ran i opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Zszyj warstwy mięśniowe i powierzchowne warstwy tłuszczu. Oczyść skórę 70% etanolem, a następnie zszyj (np. za pomocą klipsów do ran) zamknij skórę. Trzymaj zwierzęta w inkubatorze regulowanym termicznie do czasu odzyskania przytomności. Przenieś zwierzęta z powrotem do klatek. Zapewnij wodę długą rurką do karmienia i umieść granulki jedzenia na ściółce, aby mieć do niej łatwy dostęp.</li>
	<li>Buprenorfinę (0,1 mg/kg masy ciała) należy podawać dwa razy dziennie przez 3 dni podskórnie, rozpoczynając bezpośrednio po zabiegu w celu zmniejszenia bólu. Gentamycynę (5 mg/kg masy ciała) należy wstrzykiwać podskórnie raz dziennie przez 7 dni bezpośrednio po zabiegu, aby zapobiec i zmniejszyć zakażenie. Wstrzykuj 10 ml roztworu Ringersa z mleczanami podskórnie dwa razy dziennie przez 7 dni w celu nawodnienia.</li>
	<li>Opróżniaj pęcherze ręcznie dwa razy dziennie, aż do powrotu funkcji pęcherza. Jeśli dojdzie do infekcji pęcherza moczowego, podawaj podskórnie 10 ml soli fizjologicznej, aż mocz stanie się czysty. Jeśli nie nastąpi poprawa w ciągu dwóch dni, należy wstrzyknąć gentamycynę (5 mg/kg masy ciała raz na dobę) podskórnie, aż mocz stanie się klarowny.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem w tworzeniu skutecznego modelu przecięcia jest przecięcie rdzenia kręgowego w jednym lub dwóch cięciach. W miejscu przecięcia powinna być obecna szczelina 2-2,5 mm między kikutami rostralnymi i ogonowymi rdzenia kręgowego. Trzy najbardziej prawdopodobne powody, dla których taka przerwa się nie pojawiła, to: (1) korzenie grzbietowe/brzuszne nie zostały prawidłowo usunięte, (2) opona twarda brzuszna nie została odpowiednio usunięta i/lub (3) zwierzę nie zostało prawidłowo umieszczone na rolce umieszc...

Naprawa urazów rdzenia kręgowego to złożony i wymagający problem, który będzie wymagał kombinatorycznej strategii leczenia, obejmującej, na przykład, użycie komórek i biomateriału w celu zapewnienia korzystnego mikrośrodowiska dla funkcji przeszczepionej komórki i regeneracji aksonów w miejscu urazu. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 i zakończ transsection10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 Modele są często wykorzystywane do oceny efektów terapii pomostowych opartych na biomateriale. Zaletą stosowania modelu hemisekcji jest to, że zapewnia on większą stabilność konstrukcji mostkowej w porównaniu z pełnym przecięciem. Jednak w modelach hemisekcji trudno jest udowodnić regenerację aksonów jako wynik zastosowanej metody terapeutycznej ze względu na obecność oszczędzonej tkanki. Kompletny model przecięcia jest najbardziej rygorystyczną metodą demonstracji regeneracji aksonów.
Różne naturalne i syntetyczne materiały zostały przebadane pod kątem użycia jako żel do wstrzykiwań, wstępnie uformowany żel umieszczony w modelach stłuczenia lub hemisekcji, lub jako strukturalny kanał do modeli hemisekcji lub kompletnych transsekcji (szczegółowo opisanych w recenzjach23,24,25). Żelowanie in situ mieszaniny matrycy/SC do wstrzykiwań tworzy bardziej permisywny interfejs między przeszczepem a sznurem gospodarza dla krzyżowania aksonów26,27 w porównaniu z wstępnie zżelowanymi implantami matrix/SC5,18,19,28. Żelowanie in situ pozwoliło matrycy na konturowanie wokół nieregularnych interfejsów hosta, podczas gdy bardziej sztywny i ustrukturyzowany przewód lub mniej podatny na formowanie, wstępnie uformowany żel nie mógł. Strukturalny przewód często zapewnia prowadzenie kontaktu i stabilność implantu, w przeciwieństwie do matrycy do wstrzykiwań. Przedstawione tutaj protokoły opisują procedurę chirurgiczną, która wykorzystuje zarówno wstrzykiwalną macierz błony podstawnej (np. Matrigel, patrz Tabela materiałów, określana tutaj jako matryca do wstrzykiwań), jak i ustrukturyzowany przewód do oceny regeneracji aksonów w najbardziej rygorystycznym modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego.
Elektroprzędzone włókniste puste przewody z poli-winylidenodifluorku trifluoroetylenu (PVDF-TrFE) są używane w naszym eksperymentalnym podejściu. PVDF-TrFE jest polimerem piezoelektrycznym, który generuje ładunek przejściowy po mechanicznym odkształceniu i wykazano, że sprzyja wydłużaniu neurytów i regeneracji aksonów zarówno in vitro29,30, jak i in vivo31. Elektroprzędzenie jest powszechną metodą wytwarzania rusztowań, która pozwala szybko wytworzyć niezawodne rusztowania włókniste przy użyciu różnych polimerów o kontrolowanych właściwościach, takich jak wyrównanie włókien, średnica włókien i grubość rusztowania do zastosowań neuronowych i innych32,33,34.
Liczne badania na szczurach SC przeszczepionych do miejsc uszkodzenia rdzenia kręgowego wykazały skuteczność leczenia5,9,18,19,20,21,26. Przeszczepy te działają neuroprotekcyjnie na tkankę otaczającą zmianę, zmniejszają rozmiar jamy zmiany i wspomagają regenerację aksonów do miejsca zmiany / przeszczepu oraz mielinizację zregenerowanych aksonów. Ludzkie SC mogą być przeszczepiane autologicznie, co jest zaletą w porównaniu z większością innych komórek związanych z neuronami24. Po biopsji nerwów obwodowych SC można wyizolować i oczyścić, a następnie rozprzestrzenić się do pożądanej ilości do przeszczepu ludziom. Udowodniono, że autologiczny przeszczep SC u pacjentów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego jest bezpieczny w Iranie35,36,37,38, Chiny39,40 oraz Stany Zjednoczone41,42. Wiadomo, że SC wydzielają liczne czynniki neurotroficzne i białka macierzy zewnątrzkomórkowej ważne dla wzrostu aksonów i odgrywają istotną rolę w regeneracji aksonów po uszkodzeniu nerwów obwodowych. Naszym celem jest tutaj opisanie metod, które mogą badać projekty przewodów w celu poprawy wyników przeszczepu SC w kompletnym modelu przecięcia rdzenia kręgowego szczura.

<table><tbody><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>25382-428</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco: mieszanka składników odżywczych F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039-021</td><td>"DMEM/F12" w protokole.</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>"Pen/Strep" w protkol.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclon</td><td>SH300-70-03</td> <td>"FBS" w protokole.</td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki mózgowej</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-215</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin</td><td>R& D Systems</td><td>396-HB/CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>"PLL" w protokole.</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane medium Eagle firmy Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td> <td>"DMEM" w protokole.</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td><td>"HBSS" w protokole.</td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Samica szczura Fischer (160-180g)</td><td>Nożyczki Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas, proste</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Vedco Inc</td><td>5098976106</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc</td><td>AnaSed</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-010-02</td><td>Może być dowolną marką.</td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>FST</td><td>10089-11</td><td>Może być dowolnej marki.</td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki z końcem</td><td>FST</td><td>14017-18</td><td>Może być dowolną marką.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td>Może być dowolnej marki.</td></tr><tr><td>rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td>Może być dowolną marką do wyboru.</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe kątowe</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td>Może być dowolnej marki.</td></tr><tr><td>Trójkąty absorpcyjne</td><td>FST</td><td>18105-03</td><td>Może być dowolną marką.</td></tr><tr><td>Pianka żelowa</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>"Pianka skompresowana" w protokole.</td></tr><tr><td>#10 ostrzy</td><td>Sklar</td><td>06-3010</td><td>Może być dowolną marką.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>"Matryca iniekcyjna" w protokole.</td></tr><tr><td>Przeciwciało białkowe przeciw zielonej fluorescencji</td> kurczaka <td>Mysz Millipore</td><td>AB16901</td><td></td></tr><tr><td>RT97 Przeciwciało hybrydoma</td><td>DSHB</td><td>RT97</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-neurofilamentowe królika</td><td>Encor Biotechnology, Inc</td><td>PRCA-NF-H</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne królik anty-glejowe fibrylarne kwaśne przeciwciało</td> białkowe <td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-kurczaka IgG (H + L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 kozia anty-królicza IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 kozia anty-królicza IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21244</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 kozia anty-mysia IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Nikon</td><td>clsi</td><td></td></tr></tbody></table>

przeszczep komórek schwanna wewnątrz przewodów pvdf-trfe w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Wśród różnych modeli uszkodzenia rdzenia kręgowego u szczurów, najczęściej używany jest model kontuzji, ponieważ jest to najczęstszy rodzaj uszkodzenia rdzenia kręgowego u człowieka. Kompletny model transsekcji, choć nie tak istotny klinicznie jak model stłuczenia, jest najbardziej rygorystyczną metodą oceny regeneracji aksonów. W modelu kontuzji trudno jest odróżnić aksony zregenerowane od porośniętych lub oszczędzonych ze względu na obecność pozostałej tkanki po urazie. W kompletnym modelu transsekcji konieczna jest metoda mostkowa, aby wypełnić lukę i stworzyć ciągłość od kikutów rostralnych do ogonowych w celu oceny skuteczności zabiegów. Niezawodna chirurgia pomostowa jest niezbędna do testowania miar wyników poprzez zmniejszenie zmienności wynikającej z metody chirurgicznej. Opisane tutaj protokoły służą do przygotowania komórek Schwanna (SC) i przewodów przed przeszczepem, całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego na poziomie klatki piersiowej 8 (T8), wprowadzenia przewodu i przeszczepienia SC do przewodu. Podejście to wykorzystuje również żelowanie in situ wstrzykiwanej macierzy błony podstawnej z przeszczepem SC, co umożliwia lepszy wzrost aksonów w poprzek interfejsów rostralnych i ogonowych z tkanką gospodarza.

Celem zastosowania tej techniki chirurgicznej jest ocena wykorzystania ustrukturyzowanego przewodu i wstrzykiwalnej macierzy, które maksymalizują funkcję SC po transplantacji do całkowicie przerwanych rdzeni kręgowych. Trzy tygodnie po transplantacji zwierzęta są perfundowane 4% paraformaldehydem, a kolumny kręgowe są makroskopowo preparowane i utrwalane w tym samym utrwalaczu przez kolejne 24 h. Następnie rdzeń kręgowy jest preparowany, a próbki do sagittalnych przekrojów krioskopowych s...

Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

Ogólnym celem tej procedury interwencji chirurgicznej jest wykorzystanie przewodu wypełnionego komórkami Schwanna i macierzy wstrzykiwalnej w celu ustanowienia pomostu między całkowicie przerwanymi kikutami rdzenia kręgowego, aby stymulować regenerację aksonów w obrębie tego pomostu. Naszym celem jest połączenie miejsca uszkodzenia rdzenia kręgowego u szczura w celu przywrócenia jego funkcji. Stosowanym przez nas modelem uszkodzenia jest stworzenie przerwy w wyniku całkowitego przerwania ciągłości rdzenia.Dopiero zastosowanie tego rodzaju uszkodzenia pozwala z pewnością stwierdzić, że aksony uległy regeneracji, gdy zostaną one odnalezione w miejscu urazu. Wykorzystany przez nas pomost to kanał polimerowy zawierający komórki Schwanna, które są kluczowe dla regeneracji aksonów. W tym filmie pokazujemy, jak wprowadzić taki pomost w miejsce całkowitego przerwania ciągłości nerwu.Badacze, którzy po raz pierwszy stosują tę metodę, będą potrzebować wprawy, ponieważ całkowite przerwanie rdzenia kręgowego i wprowadzenie przewodu może być dla początkujących wyzwaniem. Przed rozpoczęciem procedury należy użyć skalpela o ostrzu nr 10, aby przyciąć przewód do długości pięciu milimetrów. Czynność tę można również wykonać pod mikroskopem dissectingowym, jeśli jest to preferowane.Delikatnie zegnij przewód wzdłuż strony podłużnej i za pomocą prostych nożyczek Vannasa wykonaj cztery niewielkie nacięcia o długości około 0,4 milimetra, w odległości co najmniej jednego milimetra od otworów i w odstępach około jednego milimetra od siebie. Następnie rozprostuj przewód i przetnij materiał pomiędzy dwiema nacięciami po tej samej stronie, aby utworzyć dwa sąsiadujące okna, upewniając się, że okna mogą być prawidłowo otwierane i zamykane wzdłuż nieprzeciętej strony. Aby przeprowadzić laminektomię T7-T9, po potwierdzeniu braku reakcji na uciśnięcie palca u znieczulonej samicy szczura Fischer o masie od 180 do 200 gramów, zlokalizuj punkty orientacyjne dla wyrostków kolczystych T9-T11.Będą one wyczuwalne przez skórę jako małe, trójkątne wypukłości. Za pomocą skalpela z ostrzem nr 10 wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej o długości od 4 do 5 cm od poziomu T4 do T11, a następnie wykonaj niewielkie nacięcie w powierzchownej warstwie tłuszczu za pomocą zakrzywionych nożyczek z tępymi końcami. Po odseparowaniu tkanki tłuszczowej użyj ostrza nr 10, aby zlokalizować wyrostki kolczyste T7-T9, i użyj pęsety tępym końcem, aby przytrzymać mięsień mniej więcej na wysokości T4. Wykonaj nacięcie w mięśniu wzdłuż każdej strony kręgów od T6 do T10, tak blisko kręgów, jak to możliwe, aby uzyskać czysty dostęp i zminimalizować urazy zwierzęcia.Umieść rozwieracz wokół kręgów od T7 do T9. Użyj ostrza nr 10 do przecięcia mięśni i więzadeł pomiędzy poszczególnymi wyrostkami od T6 do T10, a następnie za pomocą kleszczy kuretażowych usuń wszelkie mięśnie lub więzadła z blaszek łukowych od T7 do T9, przesuwając się tak bocznie, jak to możliwe. Gdy przerwy między wyrostkami poprzecznymi od T7 do T9 staną się widoczne, użyj kleszczy kuretażowych do usunięcia wyrostka kolczystego T9, delikatnie unosząc wyrostek kolczysty T8 kleszczykami tępymi, aby unieść blaszkę łukową T9 w niewielkim otworze między wyrostkami T9 i T10. Następnie, używając kleszczy kuretażowych, usuń blaszkę łukową tak bocznie, jak to możliwe, zaczynając od otworu i przesuwając się rostralnie w obrębie T9. Po usunięciu wszystkich blaszek łukowych upewnij się, że przerwy między wyrostkami poprzecznymi są widoczne, szczególnie w T8, i obejrzyj kości po obu stronach między T7 a T9, aby potwierdzić brak wystających na zewnątrz fragmentów kostnych; korzenie grzbędowe powinny stać się widoczne.Używając skośnych nożyczek sprężynowych, przetnij korzenie grzbietowe i brzuszne powyżej i poniżej poziomu T8, a następnie dodaj sól fizjologiczną do rdzenia kręgowego, aby pomóc w zahamowaniu krwawienia. Następnie umieść skośne nożyczki sprężynowe nad rdzeniem kręgowym w przerwach między wyrostkami poprzecznymi na poziomie T8 i wykonaj jedno cięcie, aby całkowicie przeciąć tkankę nerwową. Umieść niewielki fragment pianki kompresyjnej w powstałej szczelinie o szerokości od 2 do 2,5 mm i natychmiast podaj w to miejsce sól fizjologiczną.Oczekując na uzyskanie hemostazy w kikutach przekcięcia rdzenia, potnij trójkąty absorpcyjne na cienkie, długie paski i wyjmij przewód z roztworu PBS. Włóż kilka trójkątów do przewodu, aby usunąć nadmiar PBS i upewnić się, że wstępnie wycięte okna są otwarte. Następnie usuń medium z peletu komórek Schwanna GFP i resuspenderuj komórki Schwanna w 10 µL zimnego DMEM/F-12.Dodaj 10 µL zimnego żelu do wstrzykiwania do zawiesiny komórkowej i wymieszaj dokładnie, kilkukrotnie pipetując. Następnie umieść zawiesinę komórkową na lodzie. Po przygotowaniu kikutów rdzenia usuń ściśniętą gąbkę, a następnie użyj długich fragmentów trójkątów absorpcyjnych, aby usunąć sól fizjologiczną i krew z obszaru laminektomii.Następnie, za pomocą mikrospatułki ostrożnie unieś pień rostralny i nasuń przewód na pień tak, aby okienka były skierowane do góry, dbając o to, by cały pień został wprowadzony i aby do wnętrza przewodu nie przedostawało nadmiar krwi. Ostrożnie unieś pień kaudalny i nasuń na niego drugi koniec przewodu, upewniając się, że cały pień jest wewnątrz, a okienka znajdują się na powierzchni grzbietowej. Następnie, używając mikropipety wyposażonej w końcówkę do nakładania próbek do western blot, wstrzyknij 20 µL mieszaniny wstrzykiwalnej macierzy z komórkami Schwanna GFP do przewodu przez jedno z wcześniej wyciętych okienek, a następnie zamknij okienka.Uwaga. Bardzo ważne jest, aby końce rdzenia manipulować tak szybko i ostrożnie, jak to tylko możliwe. Opóźnienie może spowodować obrzęk końców, co utrudni nasunięcie prowadnicy na rdzeń kręgowy, prowadząc do dalszych obrażeń.Trzy tygodnie po transplantacji, konfokalne obrazy fluorescencyjne sagittalnych przekrojów tkanki rdzenia kręgowego przygotowanych metodą kriosztatu wykazują równomierny rozkład komórek Schwanna wzdłuż i wewnątrz konduitu, a także naczynia krwionośne i zmielinizowane aksony w centrum mostu. Regeneracja aksonów jest ściśle powiązana z obecnością komórek Schwanna, co potwierdza skuteczność zastosowania mostu z komórek Schwanna wewnątrz strukturalnego konduitu w celu promowania regeneracji aksonów wzdłuż mostu pomiędzy kikutami rostralnym i kaudalnym. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w 45 minut przy zachowaniu prawidłowego przebiegu prac.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak śledzenie EndoRay, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład: ile aksonów regeneruje się w obrębie mostka i ile z nich opuszcza go, aby ponownie wejść do rdzenia kręgowego? Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeciąć rdzeń kręgowy, wprowadzić kanał oraz wstrzyknąć komórki w macierzy, aby stworzyć wiarygodny mostek do regeneracji aksonów oraz innych ocen efektów.

transplantation-schwann-cells-inside-pvdf-trfe-conduits-to-bridge

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Uraz rdzenia kręgowego zaburza komunikację z mózgiem. Aby przywrócić utraconą łączność, wykorzystujemy przeszczep nerwu obwodowego, który stanowi podłoże dla regenerujących się włókien, w połączeniu z czynnikami neurotroficznymi i enzymami modyfikującymi macierz, które usuwają cząsteczki hamujące w celu promowania wzrostu na duże odległości.

Połączenie przeszczepu nerwu obwodowego i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura

Weźmy znieczulonego szczura z odsłoniętym nienaruszonym prawym nerwem kulszowym, który kontroluje ruch nóg i czucie.Wytnij segment nerwowy, tworząc szczelinę, przecinając aksony neuronów i zakłócając transmisję sygnału.Odcięte dystalne aksony pogarszają się, odrywając wyspecjalizowane komórki naprawy nerwów lub komórki Schwanna.Zszyj bioniczne rusztowanie nerwu przewodzącego, miękką rurkę z mikrokanałami, do epineurium, zewnętrznej warstwy nerwu, na obu odciętych końcach.Elektrody sparowane z...

Naprawa nerwów za pomocą bionicznego rusztowania przewodzącego w połączeniu ze stymulacją elektryczną

Źródło: Lee, Y., et.al. Przeszczep komórek Schwanna do przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie piezoelektrycznego przewodu polimerowego wysianego komórkami Schwanna w celu promowania regeneracji aksonów w rdzeniu kręgowym szczura przeciętym przez sieć. Przewód zapewnia przewodnictwo strukturalne, a jego właściwości bioelektryczne stymulują...

Przewody wysiewane komórkami Schwanna do regeneracji aksonów po urazie rdzenia kręgowego

Matryce fibrynowe zawierające czynniki wzrostu zostały użyte do zatrzymania przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych w miejscach całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego. Przeszczepione komórki całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się w wiele typów komórek nerwowych, w tym neurony, które rozciągały aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na duże odległości.

Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego

Przedstawiamy protokół korzystania z systemu radio-telemetrycznego do rejestrowania parametrów sercowo-naczyniowych u szczurów z transektem rdzenia kręgowego T4 osiem tygodni po przeszczepieniu embrionalnej nerwowej komórki macierzystej pnia mózgu w miejsce uszkodzenia. Telemetria to zaawansowana technika dokładnej oceny funkcji układu krążenia u przytomnych, swobodnie poruszających się szczurów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego.

System radiotelemetryczny do monitorowania funkcji układu krążenia u szczurów z przecięciem rdzenia kręgowego i przeszczepami embrionalnych nerwowych komórek macierzystych

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Poważne urazy rdzenia kręgowego często skutkują wadami tkanek. Opisano dwie możliwości skutecznego wypełnienia takich luk w celu promowania adaptacji tkanek, reakcji regeneracyjnych i poprawy funkcjonalnej u szczurów poprzez wszczepienie mechanicznego systemu mikrołączników po ostrym urazie i pięć tygodni po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego.

Eksperymentalne strategie wypełniania dużych luk tkankowych w uszkodzonym rdzeniu kręgowym po ostrym i przewlekłym uszkodzeniu

Tutaj prezentujemy technikę in vivo transferu genów do komórek Schwanna (SC) w nerwie kulszowym gryzoni. Ta prosta technika jest przydatna do badania mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w rozwój i utrzymanie mielinizujących się SC.

In vivo (in vivo) Transfer genów do komórek Schwanna w nerwie kulszowym gryzoni za pomocą elektroporacji

Elektroporacja to skuteczne podejście do dostarczania interesujących genów do komórek. Stosując to podejście in vivo na neuronach zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (DRG), opisujemy model do badania regeneracji aksonów in vivo.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

W niniejszym filmie zaprezentowano model ortotopowego przeszczepu aorty jako prosty model do badania rozwoju waskulopatii przeszczepu (TVP) u szczurów. <br...

Ortotopowy przeszczep aorty: model szczurzy do badania rozwoju przewlekłej waskulopatii

Poznaj technikę przeszczepu komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE do zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura. Ta metoda chirurgiczna promuje regenerację aksonów w poprzek miejsca urazu.

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki (Wideo) | JoVE Journal

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Przeglądaj więcej filmów