Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Ogólnym celem tej procedury interwencji chirurgicznej jest użycie przewodu wypełnionego komórkami Schwanna i matrycą do wstrzykiwań w celu ustanowienia mostu między całkowicie przeciętymi kikutami rdzenia kręgowego w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek mostu. Naszym celem jest wypełnienie mostka w miejscu urazu rdzenia kręgowego u szczura, aby przywrócić jego funkcję. Uraz, z którego korzystamy, polega na stworzeniu całkowitej luki w przecięciu.

Tylko dzięki zastosowaniu tego rodzaju urazu możemy z całą pewnością stwierdzić, że aksony się zregenerowały, gdy znajdziemy je w miejscu urazu. Most, którego używamy, to kanał polimerowy, który zawiera komórki Schwanna, które są tak ważne dla regeneracji aksonów. W tym filmie pokazujemy, jak wprowadzić taki most w całkowitą lukę transsekcyjną.

Badacze, którzy są nowicjuszami w tej metodzie, będą potrzebować praktyki, ponieważ całkowite przecięcie rdzenia kręgowego i wprowadzenie przewodu może być wyzwaniem dla początkujących. Przed rozpoczęciem procedury użyj ostrza numer 10, aby przyciąć przewód do pięciu milimetrów. W razie potrzeby można to również wykonać pod mikroskopem preparacyjnym.

Delikatnie złóż przewód wzdłuż podłużnej strony i za pomocą nożyczek Vannas o prostych krawędziach wytnij cztery małe nacięcia o długości około 0,4 milimetra, co najmniej jeden milimetr od otworów i około jednego milimetra od siebie. Następnie rozłóż przewód i przetnij między dwoma nacięciami po tej samej stronie, aby utworzyć dwa okna obok siebie, upewniając się, że okna można prawidłowo otwierać i zamykać wzdłuż nieodciętej strony. Aby wykonać laminektomię T7-T9, po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej samicy szczura Fischera o wadze od 180 do 200 gramów, zlokalizuj punkt orientacyjny dla wyrostków kolczystych T9-T11.

Będą odczuwane jak mały trójkątny guzek przez skórę. Używając ostrza numer 10, wykonaj od czterech do pięciu centymetrów nacięcie skóry w linii środkowej od T4 do T11, a następnie małe nacięcie w powierzchownej warstwie tłuszczu za pomocą zakrzywionych nożyczek z końcówkami. Po wycięciu tłuszczu użyj ostrza numer 10, aby zlokalizować wyrostki kolczyste T7-T9 i użyj kleszczy, aby utrzymać mięsień na poziomie około T4. Wykonaj nacięcie w mięśniu wzdłuż każdej strony kręgów od T6 do T10 jak najbliżej kręgów, aby zrobić czysty otwór i spowodować minimalne obrażenia zwierzęcia.

Umieść zwijacz wokół T7 do T9. Użyj ostrza numer 10, aby przeciąć mięśnie i więzadła między poszczególnymi wyrostkami od T6 do T10 i użyj rongeur, aby usunąć wszelkie mięśnie lub więzadła na blaszkach od T7 do T9 tak bocznie, jak to możliwe. Gdy przerwy między wyrostkami poprzecznymi od T7 do T9 są widoczne, użyj rongeur, aby usunąć wyrostek kolczysty T9, delikatnie podnosząc wyrostek kolczysty T8 kleszczami, aby podnieść blaszkę T9 w małym otworze między wyrostkami T9 i T10. Następnie użyj rongeur, aby usunąć blaszkę tak bocznie, jak to możliwe, zaczynając od otworu i poruszając się obrotowo w T9. Po usunięciu wszystkich blaszek potwierdź, że przerwy między wyrostkami poprzecznymi są widoczne, szczególnie w T8 i zbadaj kości po obu stronach między T7 i T9, aby upewnić się, że nie ma wystających na zewnątrz fragmentów kości, a korzenie grzbietowe powinny stać się widoczne.

Za pomocą kątowych nożyczek sprężynowych odetnij korzenie grzbietowe i brzuszne powyżej i poniżej T8 i dodaj sól fizjologiczną do rdzenia kręgowego, aby zatrzymać krwawienie. Następnie umieść kątowe nożyczki sprężynowe nad rdzeniem kręgowym w szczelinach między wyrostkami poprzecznymi w T8 i wykonaj jedno cięcie, aby całkowicie przeciąć tkankę nerwową. Umieść mały kawałek sprasowanej pianki w powstałej szczelinie od dwóch do 2,5 milimetra i natychmiast dodaj sól fizjologiczną do tego obszaru.

Czekając, aż odcięte kikuty pępowiny osiągną hemostazę, pokrój trójkąty absorpcyjne na cienkie, długie kawałki i wyjmij przewód z magazynu PBS. Umieść kilka trójkątów w przewodzie, aby usunąć nadmiar PBS i upewnij się, że wstępnie przycięte okna są otwarte. Następnie usuń pożywkę z granulki komórek Schwanna GFP i ponownie zawieś komórki Schwanna w 10 mikrolitrach zimnego DMEM / F-12.

Dodać 10 mikrolitrów zimnego żelu do wstrzykiwań do zawiesiny komórek i dobrze wymieszać, powtarzając pipetowanie. Następnie umieść zawiesinę komórkową na lodzie. Gdy kikuty pępowiny są gotowe, usuń skompresowaną pianę, a następnie użyj długich kawałków trójkątów absorpcyjnych, aby usunąć sól fizjologiczną i krew z obszaru laminektomii.

Następnie za pomocą mikroszpatułki delikatnie podnieś kikut rostralny i wsuń przewód na kikut oknami skierowanymi do góry, uważając, aby cały kikut był włożony i aby nie było nadmiernego krwawienia do przewodu. Delikatnie podnieś kikut ogonowy i nasuń na niego drugi koniec przewodu, uważając, aby cały kikut był włożony i aby okna znajdowały się na powierzchni grzbietowej. Następnie za pomocą mikropipety wyposażonej w końcówkę ładującą western blot wstrzyknąć 20 mikrolitrów mieszaniny matrycowej GFP Schwann Cell do wstrzykiwań do przewodu przez jedno z wstępnie wyciętych okienek i zamknąć okienka.

Uwaga ku przestrodze. Bardzo ważne jest, aby z kikutami sznurowymi obchodzić się tak szybko i ostrożnie, jak to możliwe. Opóźnienie może spowodować obrzęk kikutów, co utrudni przesunięcie przewodu przez rdzeń kręgowy, powodując dalsze obrażenia.

Trzy tygodnie po przeszczepie konfokalne obrazy fluorescencyjne skrawków kriostatu strzałkowego tkanki rdzenia ujawniają równomierne rozmieszczenie komórek Schwanna wzdłuż i wewnątrz przewodu, a także naczyń krwionośnych i mielinizowanych aksonów w środku mostu. Regeneracja aksonów jest również ściśle związana z obecnością komórek Schwanna, co potwierdza skuteczność stosowania mostka komórkowego Schwanna w ustrukturyzowanym przewodzie w celu promowania regeneracji aksonów wzdłuż mostu między kikutami rostralnymi i ogonowymi. Po opanowaniu tej procedury można ją wykonać w 45 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak śledzenie EndoRay, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład, ile aksonów regeneruje się do mostu, a ile z nich opuszcza most, aby ponownie wejść do rdzenia kręgowego? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeciąć rdzeń kręgowy, wprowadzić przewód i wstrzyknąć komórki w matrycy, aby stworzyć niezawodny pomost do regeneracji aksonów i innych ocen wyników.