Zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA

Opisany tutaj zmodyfikowany test na jedną hybrydę drożdży jest rozszerzeniem klasycznego testu na hybrydę drożdży (Y1H) do badania i walidacji interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA w systemie heterologicznym dla dowolnego funkcjonalnego badania genomicznego.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie i walidacja interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA w systemie heterologicznym dla dowolnego funkcjonalnego badania genomowego w zwykłych warunkach laboratoryjnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki funkcjonalnej, takie jak genomika planowana. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykrywa ona interakcje białkowe DNA obejmujące więcej niż jedno białko lub czynnik transkrypcyjny.

Rozpocznij tę procedurę po południu w dniu, który zostanie wyznaczony jako dzień pierwszy. Rozpocznij hodowlę o pojemności 5 mililitrów w syntetycznym pożywce zdefiniowanej lub SD bez uracylu ze świeżo posmarowanej szalki Petriego. Inkubować przez noc w shakerze o temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnego popołudnia zaszczepić 10 mililitrów pożywki YPDA 500 mikrolitrami nocnej kultury i inkubować przez noc w shakerze o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Wczesnym rankiem następnego dnia zaszczepić 100 mililitrów pożywki YPDA z 2 mililitrami nocnej kultury. Uprawiaj tę świeżą kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,4 do 0,8.

Wirować w temperaturze 1000 razy G i 21 stopni Celsjusza przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Dodać 10 mililitrów sterylnej wody i rozpuść osad przez wirowanie.

Wirować w temperaturze 1000 razy G i 21 stopni Celsjusza przez pięć minut. Wyrzuć supernatant, dodaj 2 mililitry octanu litu TE i rozpuść osad przez wirowanie. Wirować w temperaturze 1000 razy G i 21 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Odrzucić supernatant. Dodaj 4 mililitry octanu litu TE oraz 400 mikrolitrów DNA plemników łososia i ponownie zawieś osad, pipetując w górę iw dół. Komórki są teraz gotowe do transformacji, jak pokazano w następnym segmencie.

Kotransformacja komórek odbywa się w 96-dołkowej płytce mieszającej z dnem w kształcie litery U. Najpierw rozprowadź 20 mikrolitrów kompetentnych komórek na studzienkę w płytce 96-dołkowej. Następnie dodaj do studzienek po 150 nanogramów każdego z dwóch plazmidów i kontrolę normalizacji.

Ten schemat przedstawia ogólną płytkę ustawioną do kotransformacji komórek drożdży z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Ustawienie płytki może być modyfikowane w zależności od potrzeb eksperymentu i liczby badanych regionów lub fragmentów DNA. Dodać 100 mikrolitrów glikolu polietylenowego octanu litu TE do dołka i trzykrotnie wymieszać przez pipetowanie.

Przykryj płytkę oddychającą uszczelką i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Szok termiczny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez dokładnie 20 minut. Po szoku cieplnym odwirować w temperaturze 1000 razy G i 21 stopni Celsjusza przez 5 minut.

Użyj pipety wielokanałowej, aby usunąć supernatant. Dodaj 110 mikrolitrów TE i wymieszaj. Wirować ponownie przez 5 minut.

Usunąć 100 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki. Zanurz dziurkacz w 100% etanolu, podpal go, odczekaj minutę, aż kołki dziurkacza ostygną, a następnie użyj sterylnego dziurkacza do ponownego zawieszenia granulki. Przenieś komórki na płytki ślimakowe SD tryptofanu i lucyny.

Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni. Po południu piątego dnia wyjmij płytki ślimakowe z inkubatora. Napełnij każdą studzienkę sterylnej 96-dołkowej płytki mieszającej z dnem w kształcie litery U 50 mikrolitrami TE. Wstępnie zwilż sterylny dziurkacz w TE, wybij kolonie z płytki SD tryptofanu i lucyny, a następnie umieść je ponownie na płytce wypełnionej TE.

Przenieś kolonie na nowe płytki ślimakowe z tryptofanem SD i lucyną, aby uzyskać optymalne pokrycie powierzchni. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 2 dni. Po południu 7 dnia wyjmij płytki ślimakowe z inkubatora.

Napełnij każdą studzienkę sterylnej 96-dołkowej płytki mieszającej z dnem 50 mikrolitrami tryptofanu SD i pożywki lucyny. Napełnij każdą studzienkę sterylnego bloku studzienki o głębokości 96 180 mikrolitrami SD tryptofanu i pożywki lucyny. Wysterylizuj dziurkacz, wstępnie zwilż dziurkacz i pożywkę, a następnie przenieś kolonie z płytki do studzienek, z których każdy zawiera 50 mikrolitrów pożywki.

Przenieś 20 mikrolitrów drożdży do 180 mikrolitrów pożywki SD z tryptofanem i lucyną. Uszczelnij blok oddychającą uszczelką i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając przez 36 godzin. Rankiem dziewiątego dnia przenieś 100 mikrolitrów kultury do 500 mikrolitrów pożywki YPDA w wysterylizowanym bloku 96 głębokich studzienek.

Przykryj oddychającą uszczelką i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem przy 200 obr./min przez trzy do pięciu godzin. Po trzech do pięciu godzinach ponownie zawiesić hodowlę i przenieść 125 mikrolitrów z każdej studzienki na płytkę spektrofotometru. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach, aby upewnić się, że mieści się w zakresie od 0,3 do 0,6.

Odwirować pozostałe komórki w bloku studzienki głębinowej w temperaturze 3000 razy G i 21 stopni Celsjusza przez 10 minut. Usunąć supernatant przez odwrócenie. Dodaj 200 mikrolitrów buforu Z do każdej studzienki i wiruj.

Wirować w temperaturze 3000 g i 21 stopni Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant przez odwrócenie. Dodaj 21 mikrolitrów buforu Z do każdej studzienki i wiruj.

Przykryj płytkę folią uszczelniającą, która jest odporna na cykle zamrażania i rozmrażania. W dygestorium wykonaj 4 cykle zamrażania/rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu i łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Dodać 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu ONPG buforu Z beta merkaptoetanolu ONPG do każdej studzienki.

Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 17 do 24 godzin lub do momentu powstania koloru. Rankiem 10 dnia sprawdź, czy rozwinął się kolor. Dodaj 110 mikrolitrów jednego molowego węglanu sodu do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję.

Zapisz czas i zawiruj płytkę. Wirować w temperaturze 3000 razy G i 21 stopni Celsjusza przez dziesięć minut. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 125 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki na płytkę spektrofotometru.

Zmierz gęstość optyczną przy 420 nanometrach. Oblicz aktywność beta galaktozydazy w arkuszu kalkulacyjnym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu region promotora składający się z 2600 par zasad znajdujących się przed początkiem miejsca rozpoczęcia transkrypcji został podzielony na sześć regionów lub fragmentów.

To zdjęcie jest przykładem dobrze wyrośniętej i pozytywnej płyty po piątym dniu protokołu. W tym reprezentatywnym wyniku fragmenty DNA pierwszy i czwarty wykazują dodatnią interakcję z kompleksem białek A i B. Po zmierzeniu aktywności beta golaktyzydazy, fragment pierwszy wykazuje czterokrotną indukcję aktywności genu reporterowego.

Należy pamiętać, że procedura ta jest zalecana do uzyskiwania informacji o regionach DNA dopiero po potwierdzeniu proponowanej interakcji białkowej i nie ma na celu dostarczenia informacji o miejscach docelowych. Zgodnie z tymi procedurami można wykonać inne metody, takie jak test chipowy i msar, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład identyfikacja miejsc docelowych in vivo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak testować i walidować rolę multimerycznych kompleksów białkowych wiążących się ze wspólnym celem DNA.