Zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie i walidacja oddziaływania heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA w układzie heterologicznym na potrzeby dowolnych badań genomiki funkcjonalnej w warunkach standardowego laboratorium. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny genomiki funkcjonalnej, takie jak genomika planowana. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona wykryć oddziaływania białko-DNA z udziałem więcej niż jednego białka lub czynnika transkrypcyjnego.

Rozpocznij tę procedurę w popołudnie dnia, który zostanie określony jako dzień pierwszy. Przygotuj hodowlę o objętości 5 ml w syntetycznym medium zdefiniowanym (SD) bez uracylu, pobierając materiał ze świeżo posianej płytki Petriego. Inkubuj przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C.

Następnego popołudnia zaszczep 10 ml pożywki YPDA za pomocą 500 µL kultury nocnej i inkubuj przez noc w wytrząsarku w temperaturze 30 °C. Wczesnym rankiem następnego dnia zaszczep 100 ml pożywki YPDA za pomocą 2 ml kultury nocnej. Hoduj tę świeżą kulturę w temperaturze 30 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0,4 do 0,8.

Odwiruj przy 1000 ×g w temperaturze 21 °C przez 5 minut. Odlej nadsącz. Dodaj 10 ml sterylnej wody i resuspenduj osad za pomocą vortexa.

Odwiruj przy 1000 ×g i 21 °C przez pięć minut. Odlej nadsącz, dodaj 2 ml buforu TE z octanem litu i resuspenduj osad za pomocą vortexa. Odwiruj przy 1000 ×g i 21 °C przez pięć minut.

Odrzuć supernatant. Dodaj 4 mililitrów octanu litu w buforze TE oraz 400 mikrolitrów DNA z plemni łososia i resuspenduj osad, pipetując go w górę i w dół. Komórki są teraz gotowe do transformacji, co zostanie zaprezentowane w następnym segmencie.

Kotransformację komórek przeprowadza się w 96-dołkowej płytce mieszającej z dnem w kształcie litery U. Najpierw do każdego dołka płytki 96-dołkowej nanosi się 20 µL kompetentnych komórek. Następnie do dołków dodaje się po 150 ng każdego z dwóch plazmidów oraz kontroli normalizacji.

Ten schemat przedstawia ogólną konfigurację płytki do kotransformacji komórek drożdży białkiem docelowym. Konfiguracja płytki może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentu oraz liczby testowanych regionów lub fragmentów DNA. Do każdego dołka należy dodać 100 µL octanu litu w buforze TE z glikolem polietylenowym i wymieszać trzykrotnie za pomocą pipety.

Przykryj płytkę przepuszczalną dla powietrza uszczelką i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 20 do 30 minut. Przeprowadź szok termiczny w temperaturze 42 °C przez dokładnie 20 minut. Po szoku termicznym odwiruj próbki przy 1000 ×g i 21 °C przez 5 minut.

Za pomocą pipety wielokanałowej usunąć nadkład. Dodać 110 µL buforu TE i wymieszać. Ponownie odwirować przez 5 minut.

Odsącz 100 µL supernatantu z każdej studzienki. Zanurz wycinak w 100% etanolu, wysterylizuj go nad płomieniem, odczekaj jedną minutę do ostygnięcia igieł wycinaka, a następnie za pomocą sterylnego wycinaka resuspenduj osad. Przenieś komórki na płytki SD z brakiem tryptofanu i leucyny.

Inkubuj płytki w temperaturze 30°C przez dwa dni. Piątego dnia po południu wyjmij płytki z świdrem z inkubatora. Napełnij każdą studzienkę sterylnej płytki mieszającej z dnem w kształcie litery U o 96 studzienkach 50 µL buforu TE. Zwilż sterylny wycinak w buforze TE, wybij kolonie z płytki SD z brakiem tryptofanu i leucyny, a następnie resuspenduj je w płytce wypełnionej buforem TE.

Przenieś kolonie na nowe płytki agarowe SD z pominięciem tryptofanu i leucyny, aby zapewnić optymalne pokrycie powierzchni. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 2 dni. Po południu 7. dnia wyjmij płytki agarowe z inkubatora.

Napełnij każde dołeczka sterylnej 96-dołeczkowej płytki miksującej z dnem w kształcie litery U 50 µL pożywki SD z pominięciem tryptofanu i leucyny. Napełnij każdą dołeczkę sterylnego 96-dołeczkowego bloku głębokiego 180 µL pożywki SD z pominięciem tryptofanu i leucyny. Sterylizuj wycinak, zwilż go oraz pożywkę, a następnie przenieś kolonie z płytki do dołeczek zawierających 50 µL pożywki.

Przenieś 20 µL drożdży do 180 µL pożywki SD z brakiem tryptofanu i leucyny. Zamknij blok przepuszczalną membraną i inkubuj w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przez 36 godzin. Dziewiątego dnia rano przenieś 100 µL kultury do 500 µL pożywki YPDA w sterylnym bloku 96-dołkowym o głębokich dołkach.

Przykryć przepuszczalną dla powietrza zapieczarką i inkubować w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm przez trzy do pięciu godzin. Po trzech do pięciu godzinach resuspender kulturę i przenieść 125 µL z każdej studni na płytkę do spektrofotometru. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm, aby upewnić się, że mieści się ona w zakresie od 0,3 do 0,6.

Odwiruj pozostałe komórki w bloku z głębokimi dołkami przy 3000 ×g i 21 °C przez 10 minut. Usuń nadsącz poprzez odwrócenie bloku. Do każdego dołka dodaj 200 µL buforu Z i wymieszaj za pomocą wortexa.

Wiruj w wirowarce z prędkością 3000 G w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez pięć minut. Usuń nadsącz poprzez odwrócenie probówki. Do każdego dołka dodaj 21 µL buforu Z i wymieszaj w wstrząsarzu typu vortex.

Przykryj płytkę folią uszczelniającą odporną na cykle zamrażania i rozmrażania. W dygestorium przeprowadź 4 cykle zamrażania i rozmrażania, wykorzystując ciekły azot oraz kąpiel wodną o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Do każdego dołka dodaj 200 µL świeżo przygotowanego roztworu buforu Z z beta-merkaptoetanolem i ONPG.

Inkubować w temperaturze 30°C przez 17 do 24 godzin lub do momentu pojawienia się zabarwienia. Dziesiątego dnia rano sprawdzić, czy barwa się rozwinęła. Do każdej studzienki dodać 110 µL roztworu węglanu sodu o stężeniu 1 M, aby zatrzymać reakcję.

Zapisz czas i wymieszaj płytkę na wirówce wortex. Wirowarkuj z prędkością 3000 ×g w temperaturze 21°C przez dziesięć minut. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 125 µL supernatantu z każdej studzienki do płytki spektrofotometrycznej.

Zmierz gęstość optyczną przy 420 nanometrach. Oblicz aktywność beta-galaktydazy w arkuszu kalkulacyjnym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W niniejszym badaniu region promotorowy o długości 2600 par zasad powyżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji został podzielony na sześć regionów lub fragmentów.

To zdjęcie przedstawia przykład dobrze wyhodowanej, pozytywnej płytki po piątym dniu protokołu. Na tym reprezentatywnym wyniku fragmenty DNA jeden i cztery wykazują pozytywną interakcję z kompleksem białek A i B. Po pomiarze aktywności beta-galaktozydazy fragment pierwszy wykazuje czterokrotną indukcję aktywności genu reporterowego.

Należy pamiętać, że procedura ta jest zalecana do pozyskiwania informacji o regionach DNA dopiero po potwierdzeniu proponowanej interakcji białko-białko i nie jest przeznaczona do dostarczania informacji o miejscach docelowych. Po wykonaniu tych procedur można przeprowadzić inne metody, takie jak test chip lub Msar, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład w celu identyfikacji miejsc docelowych in vivo.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak testować i walidować rolę multimerycznych kompleksów białkowych wiążących się ze wspólnym celem DNA.