Name: Zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj zmodyfikowany system hybrydowy drożdży do badania interakcji heteromerycznych kompleksów białkowych z DNA. Ta metoda umożliwia wykrywanie wiązań wielu czynników transkrypcyjnych w genomice funkcjonalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy S.S. Wangowi, M. Amarowi i A. Galli za krytyczną lekturę manuskryptu. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerami nagród RO1GM067837 i RO1GM056006 (dla S.A.K). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

1. Przygotowanie plazmidu do konstruowania i raportowania
<ol>
	<li>PCR amplifikuje regiony / "fragmenty" promotora (najlepiej ~250 - 500 pz) docelowego DNA, które mają być analizowane w celu dalszego klonowania do wektora wejściowego przy użyciu E. coli (TOP10).</li>
	<li>Po potwierdzeniu sekwencjonowania należy sklonować dodatni klon w zgodnym wektorze wyrażenia pGLacZi 7, jak opisano wcześniej 8,9,10,11.</li>
	<li>Przekształć szczep drożdży do integracji promotora (YM4271) przez homologiczną rekombinację pGLacZi w celu wygenerowania szczepu reporterowego drożdży, jak opisano wcześniej 12,13. Etapy transformacji i potwierdzenia szczepu drożdży z regionem DNA wraz z recepturą pożywki nie są tutaj opisane, ponieważ kroki są podobne do klasycznego protokołu Y1H 9,10,11,12,13. Plazmid kontrolny pEXP-AD502 może być używany do celów normalizacji podczas ilościowego określania aktywności β-galaktozydazy, jak opisano wcześniej 8.</li>
	<li>Sklonuj TF lub białko będące przedmiotem zainteresowania, a następnie sklonuj oddziałującego partnera białkowego do wektorów ekspresyjnych pDEST22 i pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus domena wiążąca DNA). Przekształcone fragmenty promotora drożdży i klony TF są następnie wykorzystywane w dalszej części protokołu.</li>
</ol>
2. Zmodyfikowany protokół Y1.5H
<ol>
	<li>W dniu 1 (po południu) rozpocząć od 5 ml kultury w SD-Ura z szalki Petriego lub bulionu glicerolowego i inkubować przez noc w shakerze o temperaturze 30 °C. 
	UWAGA: Hodowlę tę można rozpocząć ze świeżo pokrytej płytką lub bezpośrednio z 25% lub 30% glicerolu klonu drożdży z fragmentem DNA.</li>
	<li>W dniu 2 (po południu) zaszczepić 10 ml pożywki YPDA 500 μl nocnej kultury i inkubować przez noc w shakerze o temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Dzień 3 (wcześnie rano i całe popołudnie): Przygotuj kompetentne komórki (wcześnie rano).
	<ol>
		<li>Zaszczepić 100 ml pożywki YPDA 2 ml nocnej kultury i inkubować w wytrząsarce o temperaturze 30 °C. Uprawiaj tę świeżą kulturę, aż OD600 osiągnie 0,4-0,8 (3-5 h). 
		UWAGA: Sprawdź OD600 nocnej hodowli i upewnij się, że punkt początkowy OD600 dla tego kroku wynosi 0,1 - 0,2. Stosowanie nadmiernie lub niedostatecznie wyrośniętych kultur może przedłużyć eksperyment.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 21 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Rozpuść granulki w 10 ml sterylnej wody, używając wiru lub pipetowania w górę iw dół.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 21 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Rozpuść granulki w 2 ml kwasu tris-etylenodiaminotetraoctowego (TE)/ octanu litu (LiAc) za pomocą wiru lub pipetowania w górę iw dół. 
		UWAGA: Proszę zapoznać się z przepisem na TE/LiAc w Tabeli 1.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut 1000 x g w temperaturze 21°C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad w 4 ml TE/LiAc + 400 μl DNA plemników łososia (10 mg/ml), pipetując w górę iw dół i przejdź do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kotransformacja: szok cieplny komórek (późnym popołudniem)
	<ol>
		<li>Rozprowadzić 20 μl komórek na studzienkę w 96-dołkowej płytce mieszającej (U-bottom).</li>
		<li>Dodaj po 150 ng (~1,5 μL) każdego z pDEST22: plazmid TF, pDEST32ΔDBD: plazmid TF i pEXP-AD502 plus pDEST32ΔDBD: TF (kontrola normalizacji) do studzienek. 
		UWAGA: Oczekuje się, że optymalne wyniki uzyska się przy ~150 ng każdy z plazmidu pDEST22: TF i pDEST32ΔDBD: TF dla udanej kotransformacji. Może się różnić w zależności od konstruktu i ekspresji plazmidu, dlatego musi być optymalizowany w każdym eksperymencie. Inny element sterujący pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD może być również dołączony według uznania użytkownika.</li>
		<li>Dodaj 100 μl TE/ LiAc / glikolu polietylenowego (PEG) na dołek (wymieszaj trzy razy). 
		UWAGA: Proszę zapoznać się z przepisem na TE/LiAc/PEG w tabeli 1.</li>
		<li>Przykryj płytkę oddychającą uszczelką i inkubuj przez 20 - 30 minut (może być dłużej) w temperaturze 30 °C (bez konieczności mieszania).</li>
		<li>Szok termiczny przez 20 min (dokładnie) w temperaturze 42 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ułóż komórki na płytce.
	<ol>
		<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety wielokanałowej. Dodać 110 μl TE i wymieszać.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć 100 μl supernatantu za pomocą pipety wielokanałowej. Ponownie zawiesić śrut za pomocą dziurkacza.</li>
		<li>Przenieś komórki na płytkach agarowych SD-Trp-Leu. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C do następnego etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 5 (popołudnie): Przenieść komórki na nowe płytki za pomocą dziurkacza/replikatora mikropłytek.
	<ol>
		<li>Napełnij sterylną 96-dołkową płytkę mieszającą (U-bottom) 50 μl TE za pomocą pipety wielokanałowej. Wstępnie zwilż dziurkacz w TE. 
		UWAGA: Dziurkacz lub replikator mikropłytek należy wysterylizować przed tym krokiem, a następnie w dalszej części protokołu. Można zastosować powszechny sposób sterylizacji dziurkacza, taki jak zanurzenie go w etanolu (100%; nie klasy biologii molekularnej), a następnie spalenie go do płomienia. Odczekaj 1 minutę, aby schłodzić kołki dziurkacza. 
		ostrożność: W przypadku wykonywania sterylizacji na stole; Upewnij się, że ławka jest wstępnie oczyszczona etanolem i wolna od wszelkich materiałów palnych w pobliżu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).</li>
		<li>Dziurkować kolonie i ponownie zawiesić na płytce wypełnionej TE. 
		UWAGA: Jeśli na płytce występuje gładki wzrost, kolonie można przebić bezpośrednio na płytkę wypełnioną TE lub alternatywnie, pojedynczą kolonię (w przypadku wielu kolonii) należy pobrać za pomocą wysterylizowanej wykałaczki do płytki wypełnionej TE, a następnie użyć dziurkacza do następnego kroku.</li>
		<li>Przenieś je na nowe płytki agarowe SD-Trp-Leu, aby uzyskać optymalne pokrycie powierzchni. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C do następnego etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 7 (popołudnie): Rozpocznij hodowlę w celu zmierzenia aktywności β-galaktozydazy.
	<ol>
		<li>Napełnij sterylną 96-dołkową płytkę mieszającą (U-bottom) 50 μl pożywki SD-Trp-Leu za pomocą wielokanałowej pipety.</li>
		<li>Napełnij sterylny blok studzienki o głębokości 96 litrami 180 μl pożywki SD-Trp-Leu za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Wstępnie zwilż dziurkacz w podłożu i przenieś kolonie z płytki do 50 μl podłoża.</li>
		<li>Przenieś 20 μl drożdży do 180 μl pożywki SD-Trp-Leu i uszczelnij blok oddychającą uszczelką. Inkubować przez 36 godzin w temperaturze wytrząsającej w temperaturze 30 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 9 (rano): Rozpocznij hodowlę w celu pomiaru enzymatycznego.
	<ol>
		<li>Przenieś 100 μl kultury do 500 μl pożywki YPDA w wysterylizowanym bloku 96 głębokich studzienek.</li>
		<li>Przykryć wysterylizowaną płytkę z głęboką studzienką oddychającą uszczelką i inkubować przez 3-5 godzin w temperaturze 30 °C z mieszaniem przy 200 obr./min (do OD600 0,3-0,6).</li>
		<li>Ponownie zawiesić hodowlę i przenieść 125 μl za pomocą pipety wielokanałowej na płytce spektrofotometru (zmierzyć OD600). 
		UWAGA: Uwaga: Nie dozuj ostatniej kropli, aby uniknąć pęcherzyków, jeśli OD600 jest poniżej 0,3 - 0,6, inkubuj pozostałe komórki przez 1 - 2 godziny więcej w oparciu o odczyt. Kultura o pojemności 125 μl użyta na tym etapie może zostać odrzucona lub przeniesiona z powrotem do pierwotnego bloku studni głębinowej według uznania użytkownika.</li>
		<li>Odwirować pozostałe komórki w bloku studzienki głębinowej przez 10 minut w temperaturze 3000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć supernatant przez odwrócenie.</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu Z i vortex. 
		UWAGA: Proszę zapoznać się z przepisem na bufor Z w tabeli 1.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 3000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć supernatant przez odwrócenie.</li>
		<li>Dodać 20 μl buforu Z i odwirować.</li>
		<li>Przykryj płytkę folią uszczelniającą, która jest odporna na cykle zamrażania i rozmrażania. Wykonać 4 cykle zamrażania/rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu w dygestorium, a następnie w temperaturze 42 ºC w łaźni wodnej (2 minuty każdy).</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu Z/beta-merkaptoetanolu (β-ME)/orto-nitrofenylo-β-galaktozydu (ONPG) (odpowiednio 12 ml, 21 μl, 8,4 mg, aby otrzymać 20 ml roztworu; zawsze przygotowuj świeże). 
		UWAGA: ONPG potrzebuje trochę czasu, aby prawidłowo się rozpuścić, więc przygotuj roztwór na godzinę przed osiągnięciem tego etapu. ONPG służy jako substrat do pomiaru aktywności β-galaktozydazy.</li>
		<li>Inkubować do 17 - 24 godzin w temperaturze 30 °C (sprawdź w międzyczasie, czy kolor rozwinął się wcześniej, przejdź do następnego kroku).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 10 (rano): Przerwij reakcję i zmierz.
	<ol>
		<li>Dodaj 110 μL 1M Na2CO3 aby zatrzymać reakcję i nagrać czas.</li>
		<li>Wirować i wirować przez 10 minut w temperaturze 3000 x g i temperaturze 21 °C.</li>
		<li>Pobrać 125 μl supernatantu za pomocą wielokanałowego i zmierzyć OD420, 
		UWAGA: Uwaga, nie dozuj ostatniej kropli, aby uniknąć bąbelków.</li>
		<li>Obliczać aktywność β-galonów: 1000 x OD420 / (czas (min) x objętość (ml) x OD600 w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+formulations+for+various+two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Media formulations for various two-hybrid systems.</a> Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+one-hybrid+assays%3A+A+historical+and+technical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective.</a> Methods. 57 (4), 441-447 (2012).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Gavin, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li>
<li>Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+B-BOX32+interacts+with+CONSTANS-LIKE3+to+regulate+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).</li>
<li>Helfer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUX+ARRHYTHMO+encodes+a+nighttime+repressor+of+circadian+gene+expression+in+the+Arabidopsis+core+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock.</a> Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).</li>
<li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).</li>
<li>Wanke, D., Harter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Plant+Regulatory+DNA+sequences+by+the+Yeast-One-Hybrid+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay.</a> Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).</li>
<li>Klein, P., Dietz, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-Binding+Proteins+and+Protein-Protein+Interactions+by+Yeast+One-Hybrid+and+Yeast+Two-Hybrid+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen.</a> Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).</li>
<li>Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+Transcriptional+Regulators+by+Yeast+One-Hybrid+Screens+Using+a+Transcription+Factor+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome.</a> Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).</li>
<li>Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/5/pdb.prot4590.full">Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens.</a> CSH Protoc. 2006 (5), (2006).</li>
<li>Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gateway-compatible+yeast+one-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A gateway-compatible yeast one-hybrid system.</a> Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Istniejąca standardowa procedura Y1H jest odpowiednia do identyfikacji pojedynczej ofiary białkowej wiążącej się ze swoją przynętą DNA. Dzięki różnym modyfikacjom technicznym istniejący system został wykorzystany do zdefiniowania transkrypcyjnych sieci regulacyjnych. Wiadomo jednak, że TF funkcjonują jako część kompleksów składających się z dwóch lub więcej TF lub białek, przy czym tylko część TF jest zdolna do wiązania się z DNA. Białka lub TF, które posiadają tylko domeny wiążące białka i nie mają zdolności do wiązania...

Ogólnie, aby zrozumieć interakcje białko-DNA, test Y1H jest preferowanym systemem z powodzeniem stosowanym w warunkach laboratoryjnych 1. Podstawowy test Y1H obejmuje dwa elementy: a) konstrukt reporterowy z DNA będącym przedmiotem zainteresowania, z powodzeniem sklonowany przed genem kodującym białko reporterowe; oraz b) konstrukt ekspresji, który wygeneruje białko fuzyjne między TF będącym przedmiotem zainteresowania a domeną aktywacji transkrypcji drożdży (AD). DNA będące przedmiotem zainteresowania jest powszechnie określane jako "przynęta", podczas gdy białko fuzyjne jest znane jako "zdobycz". W ubiegłych latach opracowano wiele wersji testu Y1H w celu zaspokojenia konkretnych potrzeb z własnymi zaletami 2. Istniejący test Y1H może być z powodzeniem wdrożony do identyfikacji i walidacji interakcji jednego białka na raz z jego przynętą DNA, ale brakuje mu możliwości identyfikacji heterodimerycznych lub multimerycznych interakcji białko-DNA.
Opisana tutaj metoda jest zmodyfikowaną wersją istniejącego Y1H, umożliwiającą badaczom jednoczesne badanie wielu białek wiążących się z ich docelowymi sekwencjami DNA. Celem tego testu jest ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania domeną aktywacyjną (pDEST22: TF) i ocena aktywacji kandydujących regionów DNA połączonych z reporterem w obecności i/lub braku oddziałującego partnera białkowego (pDEST32ΔDBD-TF) w układzie drożdży. Ten test pozwoli nam określić, czy interakcja między tymi dwoma białkami jest wymagana do aktywacji celu. Jest to system kompatybilny z klonowaniem GATEWAY, a zatem możliwy do użycia w zwykłych warunkach laboratoryjnych. Protokół ten opiera się na bezpośredniej transformacji, która zapewnia łatwość kotransformacji różnych TF w systemie drożdży. W związku z tym jest to korzystna strategia walidacji kompleksów białkowych wiążących się z ich możliwymi celami DNA w celu walidacji molekularnej i funkcjonalnej in vitro dla dowolnego systemu. Obecne techniki, takie jak metody tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP), są kosztowne i pracochłonne, ale pozwalają na wykrywanie hetrokompleksów białkowych na dużą skalę 3,4,5. Ta zmodyfikowana hybryda drożdży może być z powodzeniem wykonywana w zwykłych warunkach laboratoryjnych na małą skalę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) i jest również opłacalna. Test Y1.5H może ułatwić naukowcom z całej społeczności przetestowanie i walidację ich hipotezy w kierunku zdefiniowania roli wiązania kompleksu białek multimerycznych ze wspólnym celem DNA przy użyciu systemu heterologicznego. Na podstawie uzyskanych wyników hipotezę można zweryfikować in vivo w preferowanym systemie badań. Ostatnio zastosowaliśmy to podejście do zdefiniowania roli TF i jego sposobu działania w celu regulacji kwitnienia u Arabidopsis 6.

<table><tbody><tr><td>pDEST22 vector</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>zestaw systemu hybrydowego Pro-Quest Two</td></tr><tr><td>pDEST32delatDBD</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000102</td><td>zestaw systemu hybrydowego Pro-Quest Two; ten układ jest zmodyfikowany. Jest to pDEST32 minus wiązanie DNA</td></tr><tr><td>Domena pENTR/D-TOPO Zestaw do klonowania</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>YM4271 Szczep</td><td>Clontech</td><td>K1603-1</td><td>MATCHMAKER One-Hybrid System</td></tr><tr><td>pEXP-AD502</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two zestaw systemu hybrydowego</td></tr><tr><td>GATEWAY LR Clonase II mieszanka enzymów</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>YPDA media</td><td>Clontech</td><td>630410</td><td></td></tr><tr><td>SD-Agar</td><td>Clontech</td><td>630412</td><td></td></tr><tr><td>SD Minimalna pożywka</td><td>Clontech</td><td>630411</td><td></td></tr><tr><td>Uracil DO Suplement</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Tryptofan Do Suplement</td><td>Clontech</td><td>630413</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>LiAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Saplmon Sperma (10 mg / ml)</td> <td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka z okrągłym dnem</td><td>Greiner bio-one</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>PEG3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1546547</td><td></td></tr><tr><td>Blok studni o głębokości 96</td><td>USD Scientific</td><td>1896-2000</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniana</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td></td></tr><tr><td>Araseal</td><td>Excel Scientific</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>034461-100</td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73660</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223484</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83266</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA54-4</td><td></td></tr><tr>Termo <td>Fischer</td><td></td><td></td>do<td>kąpieli w suchej kąpieli</td></tr><tr><td></td><td>Wirówka Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wirówka Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Urządzenie</td><td></td><td>molekularne Spektrofotometr</td></tr> <tr><td>mikropłytkowy SPECTRAMAX PLUSInkubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model nr 5250- 37 stopni, 6250-30 stopni</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator wytrząsarki</td><td>New Brunswick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Thermo Fisher</td><td>IsoTemp 205</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falocn</td><td>BD Zlewka Sokoła</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kolba Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petryplates (150mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i dna

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Z biegiem lat, test na jedną hybrydę drożdży okazał się ważną techniką identyfikacji i walidacji fizycznych interakcji między białkami, takimi jak czynniki transkrypcyjne (TF) a ich celem DNA. Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje podstawową koncepcję Y1H, ale jest dalej modyfikowana w celu zbadania i walidacji kompleksów białkowych wiążących się z docelowym DNA. Dlatego nazywa się go testem zmodyfikowanej hybrydy drożdży (Y1,5H). Ten test jest opłacalny i można go łatwo wykonać w zwykłych warunkach laboratoryjnych. Opisana metoda, choć wykorzystująca system heterologiczny, może być cennym narzędziem do testowania i walidacji heteromerycznego kompleksu białkowego wiążącego się z ich celem DNA na potrzeby genomiki funkcjonalnej w dowolnym systemie badań, zwłaszcza genomiki roślin.

Ogólna procedura przygotowania płytek do ko-transformacji regionów DNA w komórkach drożdży z białkiem zainteresowania (Rysunek 2). Układ płytek może być modyfikowany w zależności od potrzeb eksperymentu oraz liczby testowanych regionów/fragmentów DNA. Po 5. dniu protokołu powinna być widoczna dobrze wyrosła i pozytywna płytka, jak pokazano na Rysunku 3. W naszym badaniu region promotora o długości 260 bp powyżej miejsca rozpoczęc...

Opisany tutaj zmodyfikowany test na jedną hybrydę drożdży jest rozszerzeniem klasycznego testu na hybrydę drożdży (Y1H) do badania i walidacji interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA w systemie heterologicznym dla dowolnego funkcjonalnego badania genomicznego.

Zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie i walidacja oddziaływania heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA w układzie heterologicznym na potrzeby dowolnych badań genomiki funkcjonalnej w warunkach standardowego laboratorium. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny genomiki funkcjonalnej, takie jak genomika planowana. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona wykryć oddziaływania białko-DNA z udziałem więcej niż jednego białka lub czynnika transkrypcyjnego.Rozpocznij tę procedurę w popołudnie dnia, który zostanie określony jako dzień pierwszy. Przygotuj hodowlę o objętości 5 ml w syntetycznym medium zdefiniowanym (SD) bez uracylu, pobierając materiał ze świeżo posianej płytki Petriego. Inkubuj przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C.Następnego popołudnia zaszczep 10 ml pożywki YPDA za pomocą 500 µL kultury nocnej i inkubuj przez noc w wytrząsarku w temperaturze 30 °C. Wczesnym rankiem następnego dnia zaszczep 100 ml pożywki YPDA za pomocą 2 ml kultury nocnej. Hoduj tę świeżą kulturę w temperaturze 30 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0,4 do 0,8.Odwiruj przy 1000 ×g w temperaturze 21 °C przez 5 minut. Odlej nadsącz. Dodaj 10 ml sterylnej wody i resuspenduj osad za pomocą vortexa.Odwiruj przy 1000 ×g i 21 °C przez pięć minut. Odlej nadsącz, dodaj 2 ml buforu TE z octanem litu i resuspenduj osad za pomocą vortexa. Odwiruj przy 1000 ×g i 21 °C przez pięć minut.Odrzuć supernatant. Dodaj 4 mililitrów octanu litu w buforze TE oraz 400 mikrolitrów DNA z plemni łososia i resuspenduj osad, pipetując go w górę i w dół. Komórki są teraz gotowe do transformacji, co zostanie zaprezentowane w następnym segmencie.Kotransformację komórek przeprowadza się w 96-dołkowej płytce mieszającej z dnem w kształcie litery U. Najpierw do każdego dołka płytki 96-dołkowej nanosi się 20 µL kompetentnych komórek. Następnie do dołków dodaje się po 150 ng każdego z dwóch plazmidów oraz kontroli normalizacji.Ten schemat przedstawia ogólną konfigurację płytki do kotransformacji komórek drożdży białkiem docelowym. Konfiguracja płytki może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentu oraz liczby testowanych regionów lub fragmentów DNA. Do każdego dołka należy dodać 100 µL octanu litu w buforze TE z glikolem polietylenowym i wymieszać trzykrotnie za pomocą pipety.Przykryj płytkę przepuszczalną dla powietrza uszczelką i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 20 do 30 minut. Przeprowadź szok termiczny w temperaturze 42 °C przez dokładnie 20 minut. Po szoku termicznym odwiruj próbki przy 1000 ×g i 21 °C przez 5 minut.Za pomocą pipety wielokanałowej usunąć nadkład. Dodać 110 µL buforu TE i wymieszać. Ponownie odwirować przez 5 minut.Odsącz 100 µL supernatantu z każdej studzienki. Zanurz wycinak w 100% etanolu, wysterylizuj go nad płomieniem, odczekaj jedną minutę do ostygnięcia igieł wycinaka, a następnie za pomocą sterylnego wycinaka resuspenduj osad. Przenieś komórki na płytki SD z brakiem tryptofanu i leucyny.Inkubuj płytki w temperaturze 30°C przez dwa dni. Piątego dnia po południu wyjmij płytki z świdrem z inkubatora. Napełnij każdą studzienkę sterylnej płytki mieszającej z dnem w kształcie litery U o 96 studzienkach 50 µL buforu TE. Zwilż sterylny wycinak w buforze TE, wybij kolonie z płytki SD z brakiem tryptofanu i leucyny, a następnie resuspenduj je w płytce wypełnionej buforem TE.Przenieś kolonie na nowe płytki agarowe SD z pominięciem tryptofanu i leucyny, aby zapewnić optymalne pokrycie powierzchni. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 2 dni. Po południu 7. dnia wyjmij płytki agarowe z inkubatora.Napełnij każde dołeczka sterylnej 96-dołeczkowej płytki miksującej z dnem w kształcie litery U 50 µL pożywki SD z pominięciem tryptofanu i leucyny. Napełnij każdą dołeczkę sterylnego 96-dołeczkowego bloku głębokiego 180 µL pożywki SD z pominięciem tryptofanu i leucyny. Sterylizuj wycinak, zwilż go oraz pożywkę, a następnie przenieś kolonie z płytki do dołeczek zawierających 50 µL pożywki.Przenieś 20 µL drożdży do 180 µL pożywki SD z brakiem tryptofanu i leucyny. Zamknij blok przepuszczalną membraną i inkubuj w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przez 36 godzin. Dziewiątego dnia rano przenieś 100 µL kultury do 500 µL pożywki YPDA w sterylnym bloku 96-dołkowym o głębokich dołkach.Przykryć przepuszczalną dla powietrza zapieczarką i inkubować w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm przez trzy do pięciu godzin. Po trzech do pięciu godzinach resuspender kulturę i przenieść 125 µL z każdej studni na płytkę do spektrofotometru. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm, aby upewnić się, że mieści się ona w zakresie od 0,3 do 0,6.Odwiruj pozostałe komórki w bloku z głębokimi dołkami przy 3000 ×g i 21 °C przez 10 minut. Usuń nadsącz poprzez odwrócenie bloku. Do każdego dołka dodaj 200 µL buforu Z i wymieszaj za pomocą wortexa.Wiruj w wirowarce z prędkością 3000 G w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez pięć minut. Usuń nadsącz poprzez odwrócenie probówki. Do każdego dołka dodaj 21 µL buforu Z i wymieszaj w wstrząsarzu typu vortex.Przykryj płytkę folią uszczelniającą odporną na cykle zamrażania i rozmrażania. W dygestorium przeprowadź 4 cykle zamrażania i rozmrażania, wykorzystując ciekły azot oraz kąpiel wodną o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Do każdego dołka dodaj 200 µL świeżo przygotowanego roztworu buforu Z z beta-merkaptoetanolem i ONPG.Inkubować w temperaturze 30°C przez 17 do 24 godzin lub do momentu pojawienia się zabarwienia. Dziesiątego dnia rano sprawdzić, czy barwa się rozwinęła. Do każdej studzienki dodać 110 µL roztworu węglanu sodu o stężeniu 1 M, aby zatrzymać reakcję.Zapisz czas i wymieszaj płytkę na wirówce wortex. Wirowarkuj z prędkością 3000 ×g w temperaturze 21°C przez dziesięć minut. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 125 µL supernatantu z każdej studzienki do płytki spektrofotometrycznej.Zmierz gęstość optyczną przy 420 nanometrach. Oblicz aktywność beta-galaktydazy w arkuszu kalkulacyjnym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W niniejszym badaniu region promotorowy o długości 2600 par zasad powyżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji został podzielony na sześć regionów lub fragmentów.To zdjęcie przedstawia przykład dobrze wyhodowanej, pozytywnej płytki po piątym dniu protokołu. Na tym reprezentatywnym wyniku fragmenty DNA jeden i cztery wykazują pozytywną interakcję z kompleksem białek A i B. Po pomiarze aktywności beta-galaktozydazy fragment pierwszy wykazuje czterokrotną indukcję aktywności genu reporterowego.Należy pamiętać, że procedura ta jest zalecana do pozyskiwania informacji o regionach DNA dopiero po potwierdzeniu proponowanej interakcji białko-białko i nie jest przeznaczona do dostarczania informacji o miejscach docelowych. Po wykonaniu tych procedur można przeprowadzić inne metody, takie jak test chip lub Msar, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład w celu identyfikacji miejsc docelowych in vivo.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak testować i walidować rolę multimerycznych kompleksów białkowych wiążących się ze wspólnym celem DNA.

a-modified-yeast-one-hybrid-system-for-heteromeric-protein-complex

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda MYTH umożliwia czułą detekcję przejściowych i trwałych oddziaływań między białkami ekspresowanymi w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae. Została ona z powodzeniem zastosowana do badania egzogennych oraz drożdżowych białek błonowych w celu wysokoprzepustowej identyfikacji ich partnerów interakcji.

System błonowego dwuhybrydowego badania drożdży (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie: potężne narzędzie do identyfikacji oddziaływań białko-białko

Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny screening dwuhybrydowy drożdżowy, który jest skutecznym narzędziem genetycznym w identyfikacji oddziaływań białkowych. Modyfikacja ta znacznie skraca cały proces, zmniejsza nakład pracy i, co najważniejsze, redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich. Ponadto podejście to jest powtarzalne i wiarygodne.

Zmodyfikowany system dwuhybrydowy drożdżowy do identyfikacji białek oddziałujących z czynnikiem wzrostu progranuliną

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży wybranych do pozytywnych interakcji drożdży z hybrydami 2 potencjalnie dostarcza wielu informacji na temat oddziałujących białek partnerskich. W tym miejscu opisujemy działanie konkretnych narzędzi bioinformatycznych i dostosowanego zaktualizowanego oprogramowania do analizy danych sekwencyjnych z takich ekranów.

Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół badań przesiewowych drożdży z jedną hybrydą, aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne (TF), które mogą wiązać się z interesującym nas regionem ludzkiego DNA. Ta metoda wykorzystuje potok przesiewowy o wysokiej przepływności, który może badać wiązanie &gt;1 000 TF w jednym eksperymencie.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Interakcje biomolekuł, takie jak interakcje białko-białko, są molekularną podstawą funkcji biologicznych. Jeśli uda się wyizolować mutanty bez interakcji/upośledzone, które specyficznie nie mają odpowiedniej interakcji, znacznie pomogą one w zrozumieniu funkcji tej interakcji. W tym artykule przedstawiono skuteczny sposób izolowania mutantów bez interakcji/z upośledzeniem.

Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Poznaj zmodyfikowany system hybrydowy drożdży do badania interakcji heteromerycznych kompleksów białkowych z DNA. Ta metoda umożliwia wykrywanie wiązań wielu czynników transkrypcyjnych w genomice funkcjonalnej.

Zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA

Przeglądaj więcej filmów