Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie bibliotek do natywnego sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w celu analizy gęstości nukleosomów. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na pytania z zakresu epigenetyki, takie jak ujawnianie cech epigenomicznych w populacji komórek na poziomie pojedynczego nukleosomu oraz rozdzielanie heterogenicznych sygnatur chromatyny na ich ciągłe elementy. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie właściwości MNase, polegającej na preferencyjnym dostępie do otwartych regionów chromatyny, w celu uzyskania pomiaru łączącego dostępność MNase z modyfikacjami histonów.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności z powodu problemów z uzyskaniem optymalnego trawienia przez MNaza. Należy rozpocząć ten protokół od przygotowania komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pierwszego dnia każdy osad komórkowy należy rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 10 sekund.

Następnie przenieść komórki na lód. Do każdego osadu komórkowego niezwłocznie dodać lodowaty bufor lizujący 1× z dodatkiem 1× PIC do końcowego stężenia 10 000 komórek na 20 µL. Wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.

Pracując na lodzie, nanieś po 20 µL otrzymanych lizatów do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę plastikową folią uszczelniającą przed inkubacją na lodzie przez 20 minut. Oznacz płytkę jako MNase i odnotuj rozmieszczenie próbek w dołkach w kluczu szablonu.

Tuż przed zakończeniem 20-minutowej lizy, rozcień enzym MNase one w buforze rozcieńczającym MNase one do stężenia końcowego 20 units per microliter i przechowuj go w lodzie. Pracując w lodzie, przygotuj master mix do trawienia MNase one zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie nalić 20 microliters master mixu na każdy rząd próbek, dodając pięć microliters dodatkowej objętości do płyty zbiornika 96-dołkowego.

Po zakończeniu inkubacji lizatów wyjmij płytkę do trawienia MNase z lodu. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 20 µL master miksu do trawienia MNnase do każdego rzędu próbek i wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy. Zmień końcówki między rzędami.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dokładnie pięć minut. Aby zatrzymać reakcję po pięciu minutach, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 6 µL 250 µM EDTA do każdego rzędu próbek, a następnie wymieszaj zawartość poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół. Pamiętaj o zmianie końcówek między rzędami.

Po dodaniu EDTA zmienić ustawienie pipety na 20 µL i wymieszać 10 razy w ten sam sposób co wcześniej, aby zapewnić całkowite zatrzymanie reakcji trawienia. Na koniec dodać sześć µL 10X buforu lizującego do każdego rzędu próbek trawionych MNazą i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Przykryć płytkę plastikową folią uszczelniającą i inkubować na lodzie przez 15 minut.

Przygotować płytkę z kompleksem przeciwciało-bead oraz płytkę do wstępnego oczyszczania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Obie płytki poddać krótkiemu wirowaniu przez 10 sekund przy 200×g. Następnie umieścić płytkę z kompleksem przeciwciało-bead na magnesie do płytek i odczekać 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz za pomocą pipety, uważając, aby nie poruszyć beadów.

Następnie należy zdjąć płytkę z magnesu i przechowywać ją w lodzie. Płytkę z reakcją wstępnego oczyszczania należy umieścić na magnesie i odczekać 15 sekund, aż kuleczki osadzą się, a roztwór stanie się klarowny. Nie naruszając osadu kuleczek, należy za pomocą pipety ostrożnie przenieść nadsącz do odpowiadających mu dołków na płytce z kompleksem przeciwciało-kuleczka przechowywanej w lodzie.

Każdą studzienkę delikatnie wymieszaj, pipetując 15 razy w górę i w dół. Szczelnie zamknij płytkę pokrywą aluminiową i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na platformie rotacyjnej. Po inkubacji oznacz płytkę jako Reakcja IP.

Drugiego dnia ustaw mieszadło grzejące na 65°C, a następnie przygotuj na lodzie bufor do płukania o niskim stężeniu soli oraz bufor do płukania o wysokim stężeniu soli. Wirowarką krótkotrwałą odwiruj płytkę reakcyjną IP przez 10 sekund przy 200 ×g. Umieść płytkę reakcyjną IP na magnesie do płytek i odczekaj 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Używając pipety wielokanałowej, ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz, uważając, aby nie poruszyć kulek.

Zdejmij płytkę z magnesu do płytek i umieść ją w lodzie. Do każdego rzędu próbek na płytce z reakcją IP dodaj 150 µL lodowatego buforu do płukania o niskiej zawartości soli i powoli wymieszaj pipetą w górę i w dół 10 razy, aby całkowicie resuspendować kulki. Umieść płytkę z reakcją IP z powrotem na magnesie do płytek i usuń nadsącz w taki sam sposób jak wcześniej.

Następnie należy umieścić płytkę z powrotem w lodzie i powtórzyć etapy płukania, aby łącznie przeprowadzić dwa płukania. Pracując w lodzie, należy dodać 150 µL buforu do płukania o wysokim zasoleniu do każdego rzędu próbek na płytce do reakcji IP. Próbki należy wymieszać powoli, pipetując w górę i w dół 10 razy, aby całkowicie resuspendować kuleczki.

Po usunięciu supernatantu w sposób opisany wcześniej, należy umieścić płytkę z reakcją IP na lodzie i schłodzić obok niej nową płytkę 96-dołkową. Do każdego rzędu próbek w płytce z reakcją IP należy dodać 150 µL buforu do płukania z wysoką zawartością soli i wymieszać powoli 10 razy poprzez pipetowanie w górę i w dół, aby całkowicie resuspender kulki. Po resuspensji należy przenieść każdy rząd próbek do odpowiadającego mu rzędu w nowej, schłodzonej płytce 96-dołkowej.

Wyrzuć starą płytkę. Umieść nową płytkę do reakcji IP na magnesie do płytek i odlej nadsącz w ten sam sposób co wcześniej. Przechowuj płytkę w temperaturze pokojowej.

Do każdego rzędu próbek na płytce do reakcji IP dodaj 30 µL buforu do elucji ChIP i wymieszaj powoli, pipetując w górę i w dół 10 razy. Należy uważać, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza. Uszczelnij płytkę pokrywą do PCR i inkubuj w mieszalniku termicznym w temperaturze 65 °C przez 1 1/2 godziny przy prędkości mieszania 1 350 RPM.

Po 1,5-godzinnej inkubacji odwiruj płytkę z reakcją IP z prędkością 200 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Następnie umieść płytkę z reakcją IP na magnesie do płytek i odczekaj, aż roztwór stanie się klarowny. Używając pipety wielokanałowej, bez naruszania kulek, ostrożnie przenieś 20 µL supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej, używając nowych końcówek dla każdego rzędu.

Oznakuj płytkę jako „Reakcja IP” i pozostaw ją w temperaturze pokojowej. Przejdź do trawienia białek, a następnie do konstrukcji biblioteki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywne dla optymalnego, niedostatecznego oraz nadmiernego trawienia chromatyny za pomocą MNase przed generowaniem biblioteki.

Profil optymalnie strawionej chromatyny jest zdominowany przez fragmenty o wielkości pojedynczego nukleosomu, przy jednoczesnym uniknięciu nadmiernej digestii, co umożliwia odzyskanie fragmentów nukleosomów wyższego rzędu. Suboptymalne strawienie chromatyny będzie widoczne również w profilu biblioteki sekwencyjnej wygenerowanej z materiału IP. W celu walidacji bibliotek za pomocą qPCR, oceniono krotność wzbogacenia bibliotek IP w stosunku do biblioteki wejściowej (input) dla celów pozytywnych i negatywnych.

Ponadto analiza wyrównanych odczytów z bibliotek o wysokim poziomie wzbogacenia ocenionym za pomocą qPCR w przeglądarce genomu powinna wykazać wizualnie wykrywalne wzbogacenia w porównaniu z biblioteką wejściową. Pomyślnie przygotowane biblioteki ChIP-seq do badania gęstości nukleosomów będą zawierać silnie skorelowane replikaty, w których znacząca część wyrównanych odczytów znajduje się w obrębie szczytów wzbogacenia zidentyfikowanych przez MACS2. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym przeprowadzeniu, proces ten można zrealizować w ciągu dwóch dni.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat generowania natywnych bibliotek do sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w celu analizy gęstości nukleosomów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że chromatyna została optymalnie strawiona, oraz stosować wyłącznie przeciwciała wykazujące wysokie powinowactwo do interesującego epitopu i niewielką lub żadną reaktywność krzyżową z innymi epitopami. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać modelowanie obliczeniowe dostępności MNase, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące np. sygnatur epigenetycznych wynikających z heterogeniczności w obrębie populacji komórek.

Metoda ta pozwala na poznanie kombinowanego wpływu pozycji i lokalnej gęstości nukleosomów, a także modyfikacji potranslacyjnych ich podjednostek histonowych i może być stosowana w dowolnych systemach, takich jak organizmy ludzkie lub mysie, komórki pierwotne oraz zamrożone tkanki.