Name: Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę ChIP-seq do analizy gęstości nukleosomów, łączącą dostępność MNase z pomiarami modyfikacji histonów. Technika ta umożliwia badanie cech epigenetycznych na poziomie pojedynczego nukleosomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A.L. był wspierany przez Kanadyjskie Stypendium Absolwentów z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem. Praca ta była wspierana przez granty z Genome British Columbia i Canadian Institutes of Health Research (CIHR-120589) w ramach Canadian Epigenetics, Environment and Health Research Consortium Initiative oraz przez Terry Fox Research Institute Program Project Grant #TFF-122869 dla M.H. oraz Terry Fox Research Institute New Investigator Award (Grant # 1039) dla M.H.

<ol><li>Simpson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+Positioning%3A+Occurrence%2C+Mechanisms%2C+and+Functional+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome Positioning: Occurrence, Mechanisms, and Functional Consequences.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40, Issue C 143-184 (1991).</li>
<li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10458604">Twenty-five years of the nucleosome, fundmamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li>
<li>Schones, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+nucleosome+positioning+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome.</a> Cell. 132 (5), 887-898 (2008).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).</li>
<li>Shiio, Y., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+sumoylation+is+associated+with+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Histone sumoylation is associated with transcriptional repression.</a> PNAS. 100 (23), 13225-13230 (2003).</li>
<li>Li, L., Lorzadeh, A., Hirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+variation%3A+An+emerging+vantage+point+for+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Syst.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory variation: An emerging vantage point for cancer biology.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 6 (1), 37-59 (2014).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+acetylation+mechanism+by+GCN5+histone+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Investigation of the acetylation mechanism by GCN5 histone acetyltransferase.</a> PLoS ONE. 7 (5), (2012).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+in+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone methylation in transcriptional control.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 12 (2), 198-209 (2002).</li>
<li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat. Commun. 6, 6033(2015).</li>
<li>Lorzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+Density+ChIP-Seq+Identifies+Distinct+Chromatin+Modification+Signatures+Associated+with+MNase+Accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome Density ChIP-Seq Identifies Distinct Chromatin Modification Signatures Associated with MNase Accessibility.</a> Cell Rep. 17 (8), 2112-2124 (2016).</li>
<li>Noll, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+micrococcal+nuclease+on+chromatin+and+the+location+of+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1.</a> J. Mol. Biol. 109 (3), 393-404 (1977).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+generating+high-resolution+maps+of+genome+wide+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A simple method for generating high-resolution maps of genome wide protein binding.</a> eLife. 4, 09225(2015).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. -P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Cui, K., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+approaches+to+determining+nucleosome+occupancy+in+metazoans+using+MNase-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide approaches to determining nucleosome occupancy in metazoans using MNase-Seq.</a> Methods Mol. Biol. 833, 413-419 (2012).</li>
<li>Mieczkowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MNase+titration+reveals+differences+between+nucleosome+occupancy+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility.</a> Nat. Commun. 7, 11485(2016).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22JOVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> JOVE. (41), (2010).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective%2C+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li>
<li>Zheng, Y., Josefowicz, S. Z., Kas, A., Chu, T. T., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Foxp3+target+genes+in+developing+and+mature+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells.</a> Nature. 445 (7130), 936-940 (2007).</li>
<li>Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Binding+of+PARP-1+and+Histone+H1+at+Promoters+Specifies+Transcriptional+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Binding of PARP-1 and Histone H1 at Promoters Specifies Transcriptional Outcomes.</a> Science. 319 (5864), 819-821 (2008).</li>
<li>Mendenhall, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+editing+of+histone+modifications+at+endogenous+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers.</a> Nat. Biotechnol. 31 (12), 1133-1136 (2013).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Reference Epigenome Standards - IHEC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/">http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/</a> (2017).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol. Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li>
<li>Fraley, C., Raftery, A. E. <a target="_blank" href="https://www.stat.washington.edu/raftery/Research/PDF/fraley1999.pdf">MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis.</a> J. Classif. 16 (2), 297-306 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Biorąc pod uwagę kombinatoryczny charakter modyfikacji chromatyny i pozycjonowania nukleosomów w regulacji transkrypcji, metoda, która umożliwia jednoczesne pomiary tych cech, prawdopodobnie dostarczy nowych informacji na temat regulacji epigenetycznej. Przedstawiony tutaj protokół ndChIP-seq jest natywnym protokołem ChIP-seq zoptymalizowanym pod kątem umożliwienia jednoczesnego badania modyfikacji histonów i gęstości nukleosomów w rzadkich komórkach pierwotnych 9,10. ndChIP-seq wykorzystuje enzymatyczne trawienie chromatyny, które w połączeniu z masowo równoległym sekwencjonowaniem parowanym końcem i modelem dystrybucji mieszaniny Gaussa pozwala na badanie modyfikacji histonów na poziomie pojedynczego nukleosomu i dekonwolucję profili epigenomicznych napędzanych heterogenicznością w populacji. Korzystając z tego protokołu, wcześniej informowaliśmy o unikalnym rozkładzie rozmiarów fragmentów wytrąconych immunologicznie, określonych przez granice odczytu sparowanych końców, związanych ze specyficznymi stanami chromatyny zdefiniowanymi przez ChromHMM10,24.
Jakość biblioteki ndChIP-seq zależy od wielu czynników, takich jak swoistość i czułość przeciwciał, optymalne warunki trawienia MNazy oraz jakość chromatyny. Specyficzność zastosowanych przeciwciał ma kluczowe znaczenie dla stworzenia udanej biblioteki ndChIP-seq. Idealne przeciwciało wykazuje wysokie powinowactwo do epitopu będącego przedmiotem zainteresowania przy niewielkiej reaktywności krzyżowej z innymi epitopami. Równie ważne jest, aby wybrać kulki magnetyczne o najwyższym powinowactwie do wybranego przeciwciała.
Trawienie MNazy jest krytyczną i wrażliwą na czas i stężenie reakcją w tym protokole. Dlatego przy przetwarzaniu wielu próbek ważne jest, aby każda reakcja była inkubowana przez równoważny czas (patrz krok 2.2). Jakość chromatyny jest kolejnym czynnikiem, który znacząco wpływa na wynik sekwencji ndChIP. Rozdrobniona chromatyna prowadzi do nieoptymalnego profilu trawienia MNazy i skutkuje bibliotekami o niskim stosunku sygnału do szumu. Próbki pierwotne o niskiej żywotności komórek lub zdegradowanej chromatynie, takie jak tkanka zatopiona w parafinie (FFPE) utrwalona w formalinie, nie są zalecane do tego protokołu.
Dodanie podczas ekstrakcji chromatyny zmniejsza niepożądaną (tj. losową) fragmentację chromatyny i zachowuje integralność ogonów histonowych. W związku z tym należy dodać do buforu do lizy i buforu immunoprecypitacyjnego tuż przed użyciem. Wybierając komórki za pomocą cytometrii przepływowej, należy wybrać żywe komórki i upewnić się, że komórki są sortowane przy niskim natężeniu przepływu, aby zwiększyć dokładność oszacowania liczby komórek i żywotności komórek. Unikaj sortowania komórek bezpośrednio do buforu do lizy. Bufor osłonki rozcieńcza bufor do lizy i zapobiega skutecznemu przenikaniu błony komórkowej do MNazy. W zależności od rodzaju komórek lub organizmu, może być wymagane miareczkowanie MNazy w celu uzyskania optymalnego trawienia.
ndChIP-seq na komórkach ssaków wymaga minimalnej głębokości sekwencjonowania 50 milionów sparowanych odczytów (25 milionów fragmentów) dla wąskich znaczników i 100 milionów sparowanych odczytów (50 milionów fragmentów) dla szerokich znaczników i danych wejściowych. Algorytm dystrybucji mieszanin Gaussa nie będzie działał optymalnie w bibliotekach, które zostały zsekwencjonowane do głębokości znacznie poniżej tego zalecenia. ndChIP-seq nie sklasyfikuje promotorów z niewielką separacją między ważoną wartością rozkładu dla długości fragmentów mono- i dinukleosomów na promotory zdominowane przez mono- lub dinukleosom. W związku z tym promotory te muszą zostać usunięte w późniejszej analizie. Można wygenerować kontrpróby biologiczne w celu zwiększenia pewności przewidywanych rozkładów i identyfikacji zmienności technicznej w trawieniu MNazy i budowie biblioteki.
W przeciwieństwie do poprzednich iteracji natywnych protokołów ChIP-seq, ndChIP-seq zapewnia środki do badania kombinatorycznego wpływu struktury chromatyny i modyfikacji histonów poprzez wykorzystanie wielkości fragmentu po immunoprecypitacji do integracji gęstości nukleosomów, określonej przez dostępność MNazy, z pomiarami modyfikacji histonów. Zastosowanie ndChIP-seq do pierwotnych komórek i tkanek dostarczy nowych informacji na temat integracyjnej natury regulacji epigenetycznej i umożliwi identyfikację sygnatur epigenetycznych wynikających z heterogeniczności w populacji.

Genom eukariotyczny jest upakowany w chromatynę za pomocą powtarzających się struktur nukleosomów, które składają się z dwóch kopii czterech białek histonowych (np. H2A, H2B, H3 i H4) ograniczonych przez 146 par zasad DNA1,2. Kompleksy przebudowujące chromatynę kontrolują położenie nukleosomów w granicach promotora genów i uczestniczą w regulacji ekspresji genów poprzez zmianę dostępności DNA dla czynników transkrypcyjnych i maszynerii polimerazy RNA3,4.
Końcowe ogony aminowe histonów w nukleosomie są poddawane różnym modyfikacjom kowalencyjnym, w tym acetylacji, metylacji, fosforylacji, ubikwitylacji, sumoilacji, formylacji i hydroksylacji określonych aminokwasów5,6,7,8. Pozycje i stopnie tych modyfikacji dyktują stan chromatyny, który wpływa na strukturę chromatyny i kontroluje dostęp kompleksów molekularnych, które umożliwiają aktywację transkrypcji7. Biorąc pod uwagę, że zarówno gęstość nukleosomów, jak i modyfikacja histonów odgrywają rolę w lokalnej kontroli transkrypcji genów, opracowaliśmy natywne podejście ChIP, które umożliwia jednoczesny pomiar gęstości nukleosomów i modyfikacji histonów9,10.
Native ChIP-seq wykorzystuje endonukleazę mikrokokowca (MNazę) do trawienia nienaruszonej chromatyny w jej natywnym stanie w jądrze11,12, właściwość, która została wykorzystana do mapowania pozycjonowania nukleosomów13,14,15. Gęstość nukleosomów ChIP-seq (ndChIP-seq) wykorzystuje właściwość preferencyjnego dostępu MNazy do otwartych regionów chromatyny w celu wygenerowania pomiarów, które łączą dostępność MNazy z modyfikacją histonów10. ndChIP-seq nadaje się do profilowania modyfikacji histonów w rzadkich komórkach pierwotnych, tkankach i hodowanych komórkach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który umożliwia generowanie zestawów danych sekwencji odpowiednich dla wcześniej opisanej ramy analitycznej work10, która integruje rozmiar fragmentu po immunoprecypitacji, określony przez granice odczytu sparowanych końców, w celu jednoczesnego zbadania dostępności MNazy z pomiarami modyfikacji histonów. Wcześniej zastosowanie tego protokołu do 10 000 pierwotnych komórek CD34 + pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych ujawniło unikalne relacje między strukturą chromatyny a modyfikacjami histonów w tych typach komórek10. Biorąc pod uwagę jego zdolność do jednoczesnego pomiaru dostępności nukleosomów i modyfikacji histonów, ndChIP-seq jest w stanie ujawnić cechy epigenomiczne w populacji komórek na poziomie pojedynczego nukleosomu i rozdzielić heterogeniczne sygnatury na ich elementy składowe. Przykładem eksploracji heterogenicznych populacji komórkowych przez ndChIP-seq jest badanie promotorów biwalentnych, w których obecne są zarówno H3K4me3, znak aktywny, jak i H3K27me3, znak represyjny10.

<table><tbody><tr><td>1M Tris-HCl &ndash; pH 7,5</td><td>Thermo Scientific</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl &ndash; pH 8</td><td>Thermo Scientific</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5 m NaCl</td><td>Sigma 1001385276</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>1001412354</td> Deoksycholan sodu Sigma 1001437582 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Thermo Scientific</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher</td><td>Scientific S233-500</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V-dolna 96-dołkowa płytka (AB 1400)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1400-L</td><td></td></tr><tr><td>Pikuler Gilson P2</td><td>Mandel</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Pikulator Gilson P10</td><td>Mandel</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P20 Pikuler</td><td>Mandel</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pikuler Gilson P100</td><td>Mandel</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Pikularz Gilson P200</td><td>Mandel</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pikularz Gilson P1000</td><td>Mandel</td><td>F123603</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokowa&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Mixer C (Mieszarka z blokiem grzewczym)</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12-kanałowy Pippet P20</td><td>Rainin</td><td>17013803</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12-kanałowy Pippet P200</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Rurka LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa osłona płyty</td><td>Edge Bio</td><td>48461</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywa PCR</td><td>Bio Rad</td><td>MSD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa pokrywa płyty</td><td>Bio Rad</td><td>MSF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny (bufor EB)</td><td>Wirówka Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>1M DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22625004</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Białko G dynabeadsy</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Białko A dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Platforma obrotowa</td><td>Mandel</td><td>1b109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Magnes płytkowy</td><td>Alpaqua</td><td>2523</td><td></td></tr><tr><td>Wypukły pasek 12-nasadkowy</td><td>Bio Rad</td><td>TCS1201</td><td></td></tr><tr><td>Bufor G2</td><td>Qiagen</td><td>1014636</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>Magnes rurkowy (DynaMag-2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Magnes rurkowy (DynaMag-2)</td><td>LabCore</td><td>730-006</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy zbiornik w kształcie litery V</td><td>Mandel</td><td>S0100A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Mandel</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fuge</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS2035</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mandel</td><td>LB109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny do szybkiej ligacji, 5X</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I, duży (Klenow) fragment</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (egzo 3'-5')</td><td>NEB</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa</td><td>T4 NEB</td><td>M0201S Mieszanina roztworów</td><td></td></tr><tr><td>deoksynukleotydów, 10mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dATP 10mM</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>Szybka ligaza</td> <td>DNA T4NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan (ATP), 25mM</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor soli Hanka</td><td>Thermo Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>A3160702</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy solny&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>H3K4me3</td><td>9751S</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410037</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>pAb-069-050</td><td></td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410056</td><td></td></tr><tr><td>SeraMag&nbsp; superparamagnetyczny Koraliki</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Prezentujemy zmodyfikowany protokół eksperymentalny sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny (ChIP-seq) zgodny z metodologią analizy opartej na dystrybucji mieszaniny Gaussa (gęstość nukleosomów ChIP-seq; ndChIP-seq), która umożliwia generowanie połączonych pomiarów dostępności nukleazy mikrokokowej (MNazy) z modyfikacją histonów w całym genomie. Pozycja nukleosomów i gęstość lokalna oraz potranslacyjna modyfikacja ich podjednostek histonów działają zgodnie w celu regulacji lokalnych stanów transkrypcji. Kombinatoryczne pomiary dostępności nukleosomów z modyfikacją histonów generowane przez ndChIP-seq pozwalają na jednoczesne badanie tych cech. Metodologia ndChIP-seq ma zastosowanie do niewielkiej liczby komórek pierwotnych, niedostępnych dla protokołów ChIP-seq opartych na sieciowaniu. Podsumowując, ndChIP-seq umożliwia pomiar modyfikacji histonów w połączeniu z lokalną gęstością nukleosomów w celu uzyskania nowych informacji na temat wspólnych mechanizmów regulujących transkrypcję RNA w rzadkich pierwotnych populacjach komórek.

Prezentujemy zmodyfikowaną metodologię sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny natywnej (ChIP-seq) do generowania zestawów danych sekwencji odpowiednich dla struktury analitycznej gęstości nukleosomów ChIP-seq integrującej dostępność nukleazy mikrokokowej (MNazy) z pomiarami modyfikacji histonów.

Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie bibliotek do natywnego sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w celu analizy gęstości nukleosomów. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na pytania z zakresu epigenetyki, takie jak ujawnianie cech epigenomicznych w populacji komórek na poziomie pojedynczego nukleosomu oraz rozdzielanie heterogenicznych sygnatur chromatyny na ich ciągłe elementy. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie właściwości MNase, polegającej na preferencyjnym dostępie do otwartych regionów chromatyny, w celu uzyskania pomiaru łączącego dostępność MNase z modyfikacjami histonów.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności z powodu problemów z uzyskaniem optymalnego trawienia przez MNaza. Należy rozpocząć ten protokół od przygotowania komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pierwszego dnia każdy osad komórkowy należy rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 10 sekund.Następnie przenieść komórki na lód. Do każdego osadu komórkowego niezwłocznie dodać lodowaty bufor lizujący 1× z dodatkiem 1× PIC do końcowego stężenia 10 000 komórek na 20 µL. Wymieszać 10 razy, pipetując w górę i w dół, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.Pracując na lodzie, nanieś po 20 µL otrzymanych lizatów do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę plastikową folią uszczelniającą przed inkubacją na lodzie przez 20 minut. Oznacz płytkę jako MNase i odnotuj rozmieszczenie próbek w dołkach w kluczu szablonu.Tuż przed zakończeniem 20-minutowej lizy, rozcień enzym MNase one w buforze rozcieńczającym MNase one do stężenia końcowego 20 units per microliter i przechowuj go w lodzie. Pracując w lodzie, przygotuj master mix do trawienia MNase one zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie nalić 20 microliters master mixu na każdy rząd próbek, dodając pięć microliters dodatkowej objętości do płyty zbiornika 96-dołkowego.Po zakończeniu inkubacji lizatów wyjmij płytkę do trawienia MNase z lodu. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 20 µL master miksu do trawienia MNnase do każdego rzędu próbek i wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy. Zmień końcówki między rzędami.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dokładnie pięć minut. Aby zatrzymać reakcję po pięciu minutach, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 6 µL 250 µM EDTA do każdego rzędu próbek, a następnie wymieszaj zawartość poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół. Pamiętaj o zmianie końcówek między rzędami.Po dodaniu EDTA zmienić ustawienie pipety na 20 µL i wymieszać 10 razy w ten sam sposób co wcześniej, aby zapewnić całkowite zatrzymanie reakcji trawienia. Na koniec dodać sześć µL 10X buforu lizującego do każdego rzędu próbek trawionych MNazą i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Przykryć płytkę plastikową folią uszczelniającą i inkubować na lodzie przez 15 minut.Przygotować płytkę z kompleksem przeciwciało-bead oraz płytkę do wstępnego oczyszczania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Obie płytki poddać krótkiemu wirowaniu przez 10 sekund przy 200×g. Następnie umieścić płytkę z kompleksem przeciwciało-bead na magnesie do płytek i odczekać 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz za pomocą pipety, uważając, aby nie poruszyć beadów.Następnie należy zdjąć płytkę z magnesu i przechowywać ją w lodzie. Płytkę z reakcją wstępnego oczyszczania należy umieścić na magnesie i odczekać 15 sekund, aż kuleczki osadzą się, a roztwór stanie się klarowny. Nie naruszając osadu kuleczek, należy za pomocą pipety ostrożnie przenieść nadsącz do odpowiadających mu dołków na płytce z kompleksem przeciwciało-kuleczka przechowywanej w lodzie.Każdą studzienkę delikatnie wymieszaj, pipetując 15 razy w górę i w dół. Szczelnie zamknij płytkę pokrywą aluminiową i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na platformie rotacyjnej. Po inkubacji oznacz płytkę jako Reakcja IP.Drugiego dnia ustaw mieszadło grzejące na 65°C, a następnie przygotuj na lodzie bufor do płukania o niskim stężeniu soli oraz bufor do płukania o wysokim stężeniu soli. Wirowarką krótkotrwałą odwiruj płytkę reakcyjną IP przez 10 sekund przy 200 ×g. Umieść płytkę reakcyjną IP na magnesie do płytek i odczekaj 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Używając pipety wielokanałowej, ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz, uważając, aby nie poruszyć kulek.Zdejmij płytkę z magnesu do płytek i umieść ją w lodzie. Do każdego rzędu próbek na płytce z reakcją IP dodaj 150 µL lodowatego buforu do płukania o niskiej zawartości soli i powoli wymieszaj pipetą w górę i w dół 10 razy, aby całkowicie resuspendować kulki. Umieść płytkę z reakcją IP z powrotem na magnesie do płytek i usuń nadsącz w taki sam sposób jak wcześniej.Następnie należy umieścić płytkę z powrotem w lodzie i powtórzyć etapy płukania, aby łącznie przeprowadzić dwa płukania. Pracując w lodzie, należy dodać 150 µL buforu do płukania o wysokim zasoleniu do każdego rzędu próbek na płytce do reakcji IP. Próbki należy wymieszać powoli, pipetując w górę i w dół 10 razy, aby całkowicie resuspendować kuleczki.Po usunięciu supernatantu w sposób opisany wcześniej, należy umieścić płytkę z reakcją IP na lodzie i schłodzić obok niej nową płytkę 96-dołkową. Do każdego rzędu próbek w płytce z reakcją IP należy dodać 150 µL buforu do płukania z wysoką zawartością soli i wymieszać powoli 10 razy poprzez pipetowanie w górę i w dół, aby całkowicie resuspender kulki. Po resuspensji należy przenieść każdy rząd próbek do odpowiadającego mu rzędu w nowej, schłodzonej płytce 96-dołkowej.Wyrzuć starą płytkę. Umieść nową płytkę do reakcji IP na magnesie do płytek i odlej nadsącz w ten sam sposób co wcześniej. Przechowuj płytkę w temperaturze pokojowej.Do każdego rzędu próbek na płytce do reakcji IP dodaj 30 µL buforu do elucji ChIP i wymieszaj powoli, pipetując w górę i w dół 10 razy. Należy uważać, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza. Uszczelnij płytkę pokrywą do PCR i inkubuj w mieszalniku termicznym w temperaturze 65 °C przez 1 1/2 godziny przy prędkości mieszania 1 350 RPM.Po 1,5-godzinnej inkubacji odwiruj płytkę z reakcją IP z prędkością 200 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Następnie umieść płytkę z reakcją IP na magnesie do płytek i odczekaj, aż roztwór stanie się klarowny. Używając pipety wielokanałowej, bez naruszania kulek, ostrożnie przenieś 20 µL supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej, używając nowych końcówek dla każdego rzędu.Oznakuj płytkę jako „Reakcja IP” i pozostaw ją w temperaturze pokojowej. Przejdź do trawienia białek, a następnie do konstrukcji biblioteki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywne dla optymalnego, niedostatecznego oraz nadmiernego trawienia chromatyny za pomocą MNase przed generowaniem biblioteki.Profil optymalnie strawionej chromatyny jest zdominowany przez fragmenty o wielkości pojedynczego nukleosomu, przy jednoczesnym uniknięciu nadmiernej digestii, co umożliwia odzyskanie fragmentów nukleosomów wyższego rzędu. Suboptymalne strawienie chromatyny będzie widoczne również w profilu biblioteki sekwencyjnej wygenerowanej z materiału IP. W celu walidacji bibliotek za pomocą qPCR, oceniono krotność wzbogacenia bibliotek IP w stosunku do biblioteki wejściowej (input) dla celów pozytywnych i negatywnych.Ponadto analiza wyrównanych odczytów z bibliotek o wysokim poziomie wzbogacenia ocenionym za pomocą qPCR w przeglądarce genomu powinna wykazać wizualnie wykrywalne wzbogacenia w porównaniu z biblioteką wejściową. Pomyślnie przygotowane biblioteki ChIP-seq do badania gęstości nukleosomów będą zawierać silnie skorelowane replikaty, w których znacząca część wyrównanych odczytów znajduje się w obrębie szczytów wzbogacenia zidentyfikowanych przez MACS2. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym przeprowadzeniu, proces ten można zrealizować w ciągu dwóch dni.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat generowania natywnych bibliotek do sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w celu analizy gęstości nukleosomów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że chromatyna została optymalnie strawiona, oraz stosować wyłącznie przeciwciała wykazujące wysokie powinowactwo do interesującego epitopu i niewielką lub żadną reaktywność krzyżową z innymi epitopami. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać modelowanie obliczeniowe dostępności MNase, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące np. sygnatur epigenetycznych wynikających z heterogeniczności w obrębie populacji komórek.Metoda ta pozwala na poznanie kombinowanego wpływu pozycji i lokalnej gęstości nukleosomów, a także modyfikacji potranslacyjnych ich podjednostek histonowych i może być stosowana w dowolnych systemach, takich jak organizmy ludzkie lub mysie, komórki pierwotne oraz zamrożone tkanki.

generation-native-chromatin-immunoprecipitation-sequencing-libraries

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie demonstrujemy technikę immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji miejsc wiązania białek w określonych regionach genomowego DNA komórek prekursorowych oligodendrocytów poprzez selektywną immunoprecypitację fragmentów chromatyny związanych z białkiem. Metoda ta pomaga badać interakcje kilku białek regulatorowych, w tym czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w regulację genów.

Immunoprecypitacja chromatyny w celu identyfikacji docelowych miejsc wiązania białek w genomowym DNA

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.

Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Tutaj opisujemy protokół efektywnej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA (ChIP-seq) brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) wyizolowanej od myszy. Protokół ten nadaje się zarówno do mapowania modyfikacji histonów, jak i badania lokalizacji w całym genomie białek niehistonowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo.

Immunoprecypitacja chromatyny mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej

Ten artykuł opisuje półautomatyczny, mikroskalowany protokół ChIP-Seq regionów DNA związanych z specyficzną modyfikacją histonu (H3K27ac) przy użyciu platformy ChIP do obsługi cieczy, a następnie przygotowanie biblioteki za pomocą tagmentacji. Procedura obejmuje ocenę kontrolną pod względem jakościowym i ilościowym i może być dostosowana do innych modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych.

Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Poznaj zmodyfikowaną metodę ChIP-seq do analizy gęstości nukleosomów, łączącą dostępność MNase z pomiarami modyfikacji histonów. Technika ta umożliwia badanie cech epigenetycznych na poziomie pojedynczego nukleosomu.

Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

Przeglądaj więcej filmów