Name: Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metody oceny homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą wychwytu synaptosomalnego i HPLC. Techniki te pozwalają mierzyć poziom dopaminy i aktywność transportera po manipulacjach in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Doskonałości UCPH 2016 (U.G., A.R., K.J.), Fundację Lundbecka (M.R.), Centrum Biomembran w Nanomedycynie Fundacji Lundbecka (U.G.), National Institute of Health Grants P01 DA 12408 (U.G.), Duńską Radę ds. Niezależnych Badań - Nauk Medycznych (U.G.).

<ol><li>Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+modulation+of+synaptic+transmission+in+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum.</a> Neuron. 76, 33-50 (2012).</li>
<li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li>
<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6+neurotransmitter+transporters%3A+structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).</li>
<li>Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoamine+transporters%3A+from+genes+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Monoamine transporters: from genes to behavior.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).</li>
<li>Runegaard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+dopaminergic+homeostasis+and+dopamine-related+behaviour+in+hemizygous+TH-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice.</a> Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).</li>
<li>Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation+of+synaptic+vesicles+from+nerve-ending+particles+%28%27synaptosomes%27%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes').</a> Biochem J. 90, 293-303 (1964).</li>
<li>Hornykiewicz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+%283-hydroxytyramine%29+and+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function.</a> Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).</li>
<li>Schultz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+dopamine+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral dopamine signals.</a> Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperlocomotion+and+indifference+to+cocaine+and+amphetamine+in+mice+lacking+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter.</a> Nature. 379, 606-612 (1996).</li>
<li>Torres, G. E., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+monoamine+transporters%3A+new+visions+of+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).</li>
<li>Jones, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+neuronal+plasticity+in+response+to+inactivation+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).</li>
<li>Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slice+biotinylation%3A+an+ex+vivo+approach+to+measure+region-specific+plasma+membrane+protein+trafficking+in+adult+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Rickhag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+PDZ+domain-binding+sequence+is+required+for+striatal+distribution+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter.</a> Nat Commun. 4, 1580(2013).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+synaptosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of synaptosome research.</a> J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).</li>
<li>Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission.</a> J Neurochem. 87, 273-289 (2003).</li>
<li>Yang, L., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+neurotransmitter+levels+in+models+of+Parkinson%27s+disease+by+HPLC-ECD%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD.</a> Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).</li>
<li>Earles, C., Schenk, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotating+disk+electrode+voltammetric+measurements+of+dopamine+transporter+activity%3A+an+analytical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation.</a> Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).</li>
<li>Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+increases+in+nucleus+accumbens+dopamine+after+systemic+cocaine+administration+are+caused+by+unique+characteristics+of+dopamine+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission.</a> J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).</li>
<li>Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+constant+potential+amperometry+for+investigations+of+dopaminergic+neurotransmission+kinetics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo.</a> J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).</li>
<li>Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regulation+of+dopamine+transporters+by+tyrosine+kinases+in+rat+neuronal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations.</a> J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).</li>
<li>Hansen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+dopamine+transporter+mutations+associate+with+adult+parkinsonism+and+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD.</a> J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).</li>
<li>Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+substantia+nigra+of+the+human+brain.+II.+Patterns+of+loss+of+dopamine-containing+neurons+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease.</a> Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).</li>
<li>Atack, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+dopamine+by+a+modification+of+the+dihydroxyindole+fluorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay.</a> Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitive+liquid+chromatographic+method+for+determination+of+neuronal+release+of+serotonin%2C+noradrenaline+and+dopamine+monitored+by+microdialysis+in+the+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex.</a> J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).</li>
<li>Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+neurodegenerative+and+behavioural+changes+induced+by+AAV-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons.</a> Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).</li>
<li>Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA+pharmacokinetics+in+the+MPTP-lesioned+macaque+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease.</a> Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).</li>
<li>Mikkelsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP-induced+Parkinsonism+in+minipigs%3A+A+behavioral%2C+biochemical%2C+and+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study.</a> Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+dopamine+regulation+in+substantia+nigra+and+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Van Dam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+biogenic+amines%2C+amino+acids+and+cholinergic+markers+in+the+CNS+of+the+C57BL%2F6+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain.</a> Amino Acids. 28, 377-387 (2005).</li>
<li>Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones+affect+neurotransmitters+and+shape+the+adult+female+brain+during+hormonal+transition+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods.</a> Front Neurosci. 9 (37), (2015).</li>
<li>Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+bulb+monoamine+concentrations+vary+with+time+of+day%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day.</a> Neuroscience. 247, 234-241 (2013).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+and+impaired+response+habituation+in+hyperdopaminergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).</li>
<li>Ungerstedt, U., Pycock, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4371656">Functional correlates of dopamine neurotransmission.</a> Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).</li>
<li>Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Rapid+Dopamine+Dynamics+with+Fast+Scan+Cyclic+Voltammetry+During+Intra-oral+Tastant+Administration+in+Awake+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats.</a> J Vis Exp. , e52468(2015).</li>
<li>Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
<li>Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+in+vivo+dynamics+of+neurotransmitter+release+and+serotonin+uptake+after+acute+para-methoxyamphetamine+and+3%2C4-methylenedioxymethamphetamine+revealed+by+chronoamperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry.</a> Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten manuskrypt opisuje przydatne protokoły eksperymentalne do nakreślenia homeostazy DA w dowolnym wybranym modelu myszy. Zapewniamy szczegółowe protokoły pomiaru poziomów DA w tkance mózgowej myszy za pomocą HPLC i wychwytu synaptosomalnego DA w celu oceny funkcjonalnego transportu DA przez DAT. Procedury, protokoły i limity dla eksperymentu HPLC i testu wychwytu synaptosomalnego DA zostaną omówione poniżej.
Protokół wychwytu synaptosomalnego może dostarczyć użytecznych informacji na temat fu...

Dopamina (DA) jest modulującym neuroprzekaźnikiem krytycznym dla zachowania motorycznego, nagrody i funkcji poznawczych1,7,8,9. Nierównowaga w homeostazie DA jest związana z kilkoma chorobami neuropsychiatrycznymi, takimi jak zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi, uzależnienie od narkotyków, depresja i choroba Parkinsona1. DA jest uwalniany z neuronu presynaptycznego do szczeliny synaptycznej, gdzie wiąże się i aktywuje receptory na błonie pre- i postsynaptycznej, przekazując w ten sposób dalej sygnał. Poziom DA w synapsie po uwolnieniu jest przestrzennie i czasowo kontrolowany przez DAT3,10. Transporter sekwestruje DA z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, a tym samym utrzymuje fizjologiczne poziomy DA3,11. Genetyczne usunięcie DAT u myszy powoduje fenotyp hiperdopaminergiczny charakteryzujący się podwyższonym poziomem synaptycznego DA, wyczerpaniem wewnątrzkomórkowych pul DA i głębokimi zmianami w postsynaptycznej sygnalizacji DAergic class<="xref">10,12.
Tutaj prezentowane są dwa oddzielne protokoły, jeden do pomiaru zawartości tkanki DA, a drugi do oceny funkcjonalności DAT. W połączeniu z testem biotynylacji powierzchniowej opisanym przez Gabriela i wsp.13 te dwie metody dostarczają informacji o zawartości DA i funkcjonalnych poziomach DAT dla dokładnej oceny homeostazy DA. Dzięki tym metodom można scharakteryzować i opisać homeostazę DA różnych myszy transgenicznych lub modeli chorób. Narzędzia te zostały wdrożone i zoptymalizowane i są standardowym zastosowaniem w naszych laboratoriach. Obecne testy posłużyły do zbadania wpływu na homeostazę DA zmiany C-końca DAT14 lub ekspresji rekombinazy Cre pod promotorem hydroksylazy tyrozynowej (TH) 5.

<table><tbody><tr><td>Inhibitor COMT</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>RO-41-0960</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr> <tr><td>[3H]-Dopamina</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA</td><td>NET67-3001MC</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Filtry z mikrowłókna szklanego</td><td>GF / C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire</td><td>1822-024</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>HiSafe Płyn scyntylacyjny</td><td>Perkin Elmer</td><td>1200-437</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>MicroBeta2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białka BCA</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23225</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Life Science</td><td>S7903</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>P9541</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck KGaA</td><td>10043-52-4</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Life Science</td><td>63065</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0278</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Life Science</td><td>G7021</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Pargyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-8013</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Dezypramina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3900</td><td>Dla wychwytu synaptosomalnego DA </td></tr><tr><td>protokół Dopamina</td><td>Sigma Life Science</td><td>H8502</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Kokaina</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5776</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Instrumenty ASI</td> macierzy<td>mózgu</td><td>RBM2000C</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Cafano Mechaniczny zakłócacz teflonu</td><td>& Holm</td><td>wycofany</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA (homogenizacja)</td></tr><tr><td>Antec Decade (detektor amperometryczny)</td><td>Antec, Leiden, Holandia</td><td>Wycofane: nowy model DECADE Elite / Lite&trade; Detektor elektrochemiczny typu 175 i 176</td><td>Do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Avantec 0.22 &mu; m filtr szklany</td><td>Frisenette ApS, Dania</td><td>13CP020AS</td><td>Do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Kolumna: Prodigy 3 &mu; ODS-3 C18</td><td>Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Niemcy</td><td>Numer części: 00A-3300-E0</td><td>Dla protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Oprogramowanie rozwiązania LC</td><td>Stacja robocza Shimadzu</td><td>LabSolutions</td><td>Series do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy 0,1 M</td><td>Fluka Analytical</td><td>35418-500ml</td><td>Do protokołu HPLC (przygotowanie tkanki)</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-50g</td><td>Do protokołu</td></tr> <tr><td>HPLCNatriumdihydrogenphosphar</td><td>Bie& Berntsen</td><td>1.06346 1000g</td><td>Do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Monohydrat 1-oktanosulfonianu sodu</td><td>Aldrich</td><td>74885 -10g</td><td>Do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitryl, izokratyczny stopień HPLC</td><td>Scharlau</td><td>AC03402500</td><td>Dla protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Filtre 0,22um</td><td>Frisenette ApS, Dania</td><td>Avantec 13CP020AS</td><td>Do protokołu HPLC (Przygotowanie tkanek)</td></tr> <tr><td>Kwas ortofosforowy 85%</td><td>Merck</td><td>1.00563. 1000 ml</td><td>dla protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Elektroda</td><td>Antec, Leiden, Holandia</td><td>AN1161300</td><td>Dla protokołu HPLC (patrz instrukcja online)</td></tr><tr><td>Program detektora na detektorze elektrochemicznym DECADE II</td><td>Antec, Leiden, Holandia</td><td>Lite&trade; Detektor elektrochemiczny typu 175 i 176</td><td>dla protokołu HPLC</td></tr></tbody></table>

ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamina (DA) jest modulującym neuroprzekaźnikiem kontrolującym aktywność motoryczną, procesy nagradzania i funkcje poznawcze. Upośledzenie neuroprzekaźnictwa dopaminergicznego (DAergic) jest silnie związane z kilkoma chorobami związanymi z ośrodkowym układem nerwowym, takimi jak choroba Parkinsona, zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi i uzależnienie od narkotyków1,2,3,4. Nakreślenie mechanizmów chorobowych związanych z brakiem równowagi DA jest krytycznie zależne od modeli zwierzęcych w naśladowaniu aspektów chorób, a zatem protokoły oceniające określone części homeostazy DA są ważne dla zapewnienia nowych spostrzeżeń i możliwych celów terapeutycznych dla tych chorób.
Tutaj prezentujemy dwa użyteczne protokoły eksperymentalne, które w połączeniu zapewniają funkcjonalny odczyt systemu DAergic u myszy. Parametry biochemiczne i funkcjonalne homeostazy DA uzyskuje się poprzez ocenę poziomu DA i funkcjonalności transportera dopaminy (DAT)5. Podczas badania systemu DA niezbędna jest możliwość wiarygodnego pomiaru endogennych poziomów DA w dorosłym mózgu. Dlatego przedstawiamy, jak przeprowadzić wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) na tkance mózgowej myszy w celu określenia poziomów DA. Eksperyment przeprowadzamy na tkance z prążkowia grzbietowego (dStr) i jądra półleżącego (NAc), ale metoda jest również odpowiednia dla innych obszarów mózgu unerwionych DA.
DAT jest niezbędny do wychwytu zwrotnego DA do terminala presynaptycznego, tym samym kontrolując czasową i przestrzenną aktywność uwolnionego DA. Znajomość poziomów i funkcjonalności DAT w prążkowiu ma ogromne znaczenie przy ocenie homeostazy DA. W tym miejscu udostępniamy protokół, który pozwala jednocześnie wydedukować informacje o poziomach powierzchniowych i funkcji za pomocą testu wychwytu DA synaptosomal6.
Obecne metody w połączeniu ze standardowymi protokołami immunoblottingu dostarczają badaczowi odpowiednich narzędzi do scharakteryzowania systemu DAergic.

Obecny protokół pobierania DA (Rysunek 1) obejmuje wszystkie kroki niezbędne do oceny funkcjonalności DAT w synaptosomach myszy. Nasze reprezentatywne dane z metody pobierania DA (Rysunek 2) przedstawiają krzywą nasycenia z danymi nieskorygowanymi (Rysunek 2B) oraz danymi skorygowanymi (Rysunek 2A). Krzywa nasycenia obrazuje pobieranie u myszy typu dzikiego. Zazwyczaj po...

Wychwyt synaptosomalnej dopaminy i wysokosprawna chromatografia cieczowa stanowią eksperymentalne narzędzia do badania homeostazy dopaminy u myszy, oceniając odpowiednio funkcję transportera dopaminy i poziom dopaminy w tkance prążkowia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

W niniejszym protokole przedstawiamy dwie techniki. Celem pierwszej jest ocena funkcji transportera dopaminy poprzez pomiar poboru dopaminy z preparatów synaptosomalnych. Druga służy do oceny poziomu dopaminy w tkance za pomocą analizy HPLC.Metody te dostarczają istotnych parametrów homeostazy dopaminy, demonstrując sposób pomiaru zawartości dopaminy w tkankach oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy u myszy. Główną zaletą tych technik jest możliwość ich przeprowadzenia po manipulacjach in-vivo, takich jak manipulacje chemogenetyczne, podawanie leków in-vivo lub trening behawioralny zwierząt. Procedurę HPLC zaprezentuje Pia Weikop, profesor nadzwyczajny w Laboratorium Neuropsychiatrii.Aby rozpocząć tę procedurę, odsłoń czaszkę, rozcinając skórę i usuwając nadmiar tkanki. Następnie przetnij czaszkę wzdłuż sutura sagittalis, aż do przedniej części. Wprowadź końcówki nożyczek do oczu i usuń pozostałą część czaszki, rozcinając ją.Szybko wyjmij mózg i umieść go w lodowatym PBS. Następnie, używając matrycy do mózgu, wycinaj trzymilimetrowy przekrój koronarny prążkowia. Następnie wykonaj precyzyjną dyssekcję za pomocą igły.Następnie przenieś tkanki do probówki do mikrocentryfugi

assessment-dopaminergic-homeostasis-mice-use-high-performance-liquid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono &gt;95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.

Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Ten film pokazuje ocenę wychwytu dopaminy w synaptosomach pobranych z mózgów myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania synaptosomów do wychwytu dopaminy za pośrednictwem transporterów dopaminy, traktowania ich różnymi stężeniami dopaminy znakowanej radioaktywnie, izolowania synaptosomów i pomiaru radioaktywności w celu ilościowego określenia wychwytu dopaminy.

Pomiar wychwytu dopaminy w synaptosomach mózgu myszy za pomocą dopaminy znakowanej radioaktywnie

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Izoenzymy lipooksygenazy (LOX) mogą generować produkty, które mogą zwiększać lub zmniejszać stan zapalny układu nerwowego i neurodegenerację. Badanie interakcji gen-środowisko może zidentyfikować efekty specyficzne dla izoenzymu LOX. Wykorzystanie modelu 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) uszkodzenia nigrostriatalnego w dwóch liniach transgenicznych z niedoborem izoenzymów LOX pozwala na porównanie wpływu izoenzymów LOX na integralność dopaminergiczną i stan zapalny.

Modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie Parkinsona

Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

Ta metoda wprowadza prostą technikę wykrywania endogennego uwalniania monoamin za pomocą ostrych wycinków mózgu. Zestaw wykorzystuje 48-dołkową płytkę zawierającą uchwyt na tkankę do uwalniania monoamin. Uwolniona monoamina jest analizowana za pomocą HPLC w połączeniu z detekcją elektrochemiczną. Ponadto technika ta zapewnia metodę przesiewową w celu odkrywania leków.

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Poznaj metody oceny homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą wychwytu synaptosomalnego i HPLC. Techniki te pozwalają mierzyć poziom dopaminy i aktywność transportera po manipulacjach in vivo.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy (Wideo) | JoVE Journal

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Przeglądaj więcej filmów