Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

W tym protokole wprowadzamy dwie techniki. Celem pierwszego z nich jest ocena funkcji transportera dopaminy poprzez pomiar wychwytu dopaminy z preparatów synaptosomalnych. Drugi służy do oceny poziomu dopaminy w tkance za pomocą analizy HPLC.

Metody te dostarczają ważnych parametrów homeostazy dopaminy, pokazując, jak mierzyć zawartość dopaminy w tkance i oceniać funkcjonalność transportera dopaminy u myszy. Główną zaletą tych technik jest to, że można je wykonywać po zabiegu in vivo, takim jak manipulacje chemogenetyczne, leczenie farmakologiczne in vivo lub trening behawioralny zwierząt. Procedurę HPLC zademonstruje Pia Weikop, profesor nadzwyczajny w Laboratorium Neuropsychiatrii.

Aby rozpocząć tę procedurę, odsłoń czaszkę, przecinając skórę i usuwając nadmiar tkanki. Następnie przetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego, aż do przodu. Umieść końcówki nożyczek w oczach i usuń pozostałą czaszkę, przecinając ją.

Szybko usuń mózg i umieść go w lodowatym PBS. Następnie, za pomocą macierzy mózgowej, wypreparuj trzymilimetrowy wycinek koronalny prążkowia. Następnie następuje drobniejsze rozwarstwienie z nakłuciem.

Następnie przenieś tkanki do 1,5-milimetrowej mikroprobówki wirówkowej w celu zważenia. Następnie powtórz procedury dla drugiego mózgu. Po odczekaniu dla obu mózgów, przenieś tkanki do szklanki homogenizacyjnej zawierającej jeden mililitr lodowatego buforu homogenizacyjnego.

Następnie homogenizuj tkankę za pomocą tłuczka napędzanego silnikiem. Następnie przenieś homogenię do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i zbierz pozostałą jednorodność ze szkła homogenizacyjnego, przepłukując je 0,5 mililitra dodatkowego buforu homogenizacyjnego. Następnie osadzaj jądra i resztki komórek przez odwirowanie.

Następnie przenieś supernatant zawierający błony komórkowe i cytoplazmę do nowych 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych i wiruj przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odrzuć supernatant zawierający cytoplazmę i ponownie zawiesić osad zawierający surowe synaptosomy w 40 mikrolitrach na miligram tkanki w buforze homogenizacyjnym. Na tym etapie dodaj 440 mikrolitrów buforu absorpcyjnego, liganda i kokainy do 12 wyznaczonych 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych i 440 mikrolitrów buforu absorpcyjnego i liganda do 36 pozostałych 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych.

Oznacz sześć dwumililitrowych mikroprobówek wirówkowych jako 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 i 0.31. Następnie dodaj 750 mikrolitrów buforu absorpcyjnego i liganda do pięciu mikroprobówek wirówkowych o najniższej liczbie. Następnie dodaj 1 455,4 mikrolitrów buforu wychwytowego i liganda, 14,6 mikrolitrów nieznakowanej dopaminy i 30 mikrolitrów tritiowanej dopaminy do probówki oznaczonej 10.

Następnie przenieś 750 mikrolitrów mieszaniny z probówki oznaczonej 10 do probówki oznaczonej 5. Dobrze wymieszaj i przenieś 750 mikrolitrów mieszaniny z tej probówki do probówki oznaczonej 2,5. Powtórzyć to rozcieńczenie z pozostałymi probówkami.

Następnie należy wstępnie przepłukać filtry z mikrowłókna szklanego czterema mililitrami buforu absorpcyjnego po umieszczeniu w 12-dołkowym wiadrze filtrującym. Następnie dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny błony synaptosomalnej do pierwszych 24 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych zawierających bufor 440 mikrolitrów. Ostrożnie wiruj i krótko wiruj, aby upewnić się, że synaposomy są zanurzone w buforze.

Następnie pozostaw je w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Po 10 minutach dodaj 50 mikrolitrów dopaminy o mocy 10 mikromolowych i pięciu mikromolowych do pierwszych dwóch kolumn i pozostaw je w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut z potrząsaniem. Po pięciu minutach zatrzymaj reakcję, dodając jeden mililitr lodowatego buforu absorpcyjnego, powtórz ją z 2,5 mikromola i 1,25 mikromola, a następnie z 0,62 mikromola i 0,31 mikromola.

Dodaj próbki do wstępnie przepłukanych filtrów z mikrowłókien i umyj je pięcioma, czterema mililitrami lodowatego buforu absorpcyjnego. Po dodaniu pierwszych 12 próbek do filtrów przenieś filtry do probówek scyntylacyjnych. Powtórz to z następnymi 12 próbkami.

Przygotuj trzy probówki do liczenia maksimum, umieszczając filtr z mikrofibry na dnie probówek scyntylacyjnych, od 49 do 51 i dodając 25 mikrolitrów maksymalnej dopaminy 10 mikromolów na górze. Następnie pozostaw wszystkie 51 rurek scyntylacyjnych w dygestoriach na jedną godzinę. Następnie dodaj trzy mililitry płynu scyntylacyjnego do każdej probówki scyntylacyjnej i energicznie wstrząsaj na wytrząsarce przez godzinę.

Aby policzyć trytiowaną dopaminę w liczniku beta przez jedną minutę, otwórz program i wybierz odpowiednie ustawienia. Do oznaczania białek należy użyć standardowego zestawu do oznaczania białek BCA, aby określić stężenia białek w synaptosomach w celu dostosowania i prawidłowego porównania wychwytu między próbkami. W celu przygotowania tkanek dodać 500 mikrolitrów roztworu homogenizacyjnego do każdej próbki i homogenizować wszystkie próbki za pomocą ultrahomogenizatora na pełnych obrotach przez około 30 sekund.

Podczas homogenizacji próbki należy przechowywać w lodowatej wodzie. Następnie odwiruj próbki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, 14 000 x G. Następnie przenieś około 200 mikrolitrów każdej próbki do szklanego filtra 0,22 mikrona przed analizą próbek według metodologii EC-HPLC. Aby skonfigurować detektor, ustaw wyjście na 700 miliwoltów i temperaturę na 32 stopnie Celsjusza na piecu detektora.

Umieścić fiolki w podajniku próbek automatycznych. Stwórz program zakresu, korzystając z podręcznika online i dodaj program czasowy zgodnie z tabelą drugą. Skonfiguruj system, otwierając program.

Następnie wpisz identyfikator użytkownika i hasło, a następnie kliknij OK. Następnie poczekaj, aż program połączy się z instrumentami. Następnie przejdź do tabeli wsadowej i uzupełnij informacje o danych.

Zapisz plik, przechodząc do pliku, a następnie kliknij, zapisz plik wsadowy jako, a następnie zapisz. Następnie wstrzyknąć pierwszą próbkę, naciskając przycisk start batch. Następnie przejdź do akwizycji danych, aby podążać za chromatogramem, gdy próbki są gotowe.

Następnie przejdź do analizy LC po uruchomieniu i wybierz nazwę pliku. Następnie kliknij widok. Na pasku integracji ręcznej dodaj wszystkie piki do zintegrowania, a następnie przejdź do raportu danych i wydrukuj odczyt.

Po dodaniu programu do detektora należy wykonać trzypunktową krzywą kalibracyjną, wstrzykując przygotowany wzorzec w pięciu, 10 i 15 mikrolitrach. Na tym rysunku reprezentatywne dane przedstawiają krzywą wysycenia wychwytu dopaminy przez transporter dopaminy z preparatów synaptosomalnych u myszy typu dzikiego. Czarne kropki to wartości czterech myszy pokazanych osobno.

Zielona krzywa pokazuje, jak normalnie przedstawiane są dane, łącząc dane z czterech do sześciu myszy na grupę. Oto wykres nasycenia surowych danych przed dostosowaniem do rzeczywistego stężenia białka w próbkach. Wykres ten przedstawia liczby w próbkach zawierających kokainę, które są wykorzystywane do odjęcia tła od danych dotyczących wychwytu.

Kontrola ta jest niezbędna do określenia wiarygodności danych dotyczących wychwytu. Ten histogram pokazuje zdolność wychwytu transportera dopaminy, a ten histogram pokazuje, że Km dla transportera dopaminy wynosi 0,1 plus minus 0,03 mikromola, co dobrze odpowiada metodzie woltamperometrii z obrotowym dyskiem, która przedstawia wartości Km transportera dopaminy jako 0,6 do 1,2 mikromola. Podczas próby zabiegu synaptosomalnego oporu ważne jest, aby przez cały czas utrzymywać tkankę na lodzie, przygotowując synaptosomy.

Po teście wychwytu dopaminy w synaptosomie można przeprowadzić dodatkowe procedury, takie jak test biotynylacji powierzchniowej, w celu ustalenia, czy zaburzony wychwyt dopaminy można wytłumaczyć zmienioną ekspresją powierzchniową transportera dopaminy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać homeostazę dopaminy u myszy, uzyskując dostęp do funkcjonalności transportera dopaminy i poziomów dopaminy w preparatach tkanki prążkowia.