Name: Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metody oceny homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą wychwytu synaptosomalnego i HPLC. Techniki te pozwalają mierzyć poziom dopaminy i aktywność transportera po manipulacjach in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Doskonałości UCPH 2016 (U.G., A.R., K.J.), Fundację Lundbecka (M.R.), Centrum Biomembran w Nanomedycynie Fundacji Lundbecka (U.G.), National Institute of Health Grants P01 DA 12408 (U.G.), Duńską Radę ds. Niezależnych Badań - Nauk Medycznych (U.G.).

<ol><li>Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+modulation+of+synaptic+transmission+in+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum.</a> Neuron. 76, 33-50 (2012).</li>
<li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li>
<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6+neurotransmitter+transporters%3A+structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).</li>
<li>Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoamine+transporters%3A+from+genes+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Monoamine transporters: from genes to behavior.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).</li>
<li>Runegaard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+dopaminergic+homeostasis+and+dopamine-related+behaviour+in+hemizygous+TH-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice.</a> Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).</li>
<li>Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation+of+synaptic+vesicles+from+nerve-ending+particles+%28%27synaptosomes%27%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes').</a> Biochem J. 90, 293-303 (1964).</li>
<li>Hornykiewicz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+%283-hydroxytyramine%29+and+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function.</a> Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).</li>
<li>Schultz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+dopamine+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral dopamine signals.</a> Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperlocomotion+and+indifference+to+cocaine+and+amphetamine+in+mice+lacking+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter.</a> Nature. 379, 606-612 (1996).</li>
<li>Torres, G. E., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+monoamine+transporters%3A+new+visions+of+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).</li>
<li>Jones, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+neuronal+plasticity+in+response+to+inactivation+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).</li>
<li>Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slice+biotinylation%3A+an+ex+vivo+approach+to+measure+region-specific+plasma+membrane+protein+trafficking+in+adult+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Rickhag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+PDZ+domain-binding+sequence+is+required+for+striatal+distribution+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter.</a> Nat Commun. 4, 1580(2013).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+synaptosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of synaptosome research.</a> J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).</li>
<li>Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission.</a> J Neurochem. 87, 273-289 (2003).</li>
<li>Yang, L., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+neurotransmitter+levels+in+models+of+Parkinson%27s+disease+by+HPLC-ECD%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD.</a> Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).</li>
<li>Earles, C., Schenk, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotating+disk+electrode+voltammetric+measurements+of+dopamine+transporter+activity%3A+an+analytical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation.</a> Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).</li>
<li>Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+increases+in+nucleus+accumbens+dopamine+after+systemic+cocaine+administration+are+caused+by+unique+characteristics+of+dopamine+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission.</a> J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).</li>
<li>Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+constant+potential+amperometry+for+investigations+of+dopaminergic+neurotransmission+kinetics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo.</a> J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).</li>
<li>Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regulation+of+dopamine+transporters+by+tyrosine+kinases+in+rat+neuronal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations.</a> J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).</li>
<li>Hansen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+dopamine+transporter+mutations+associate+with+adult+parkinsonism+and+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD.</a> J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).</li>
<li>Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+substantia+nigra+of+the+human+brain.+II.+Patterns+of+loss+of+dopamine-containing+neurons+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease.</a> Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).</li>
<li>Atack, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+dopamine+by+a+modification+of+the+dihydroxyindole+fluorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay.</a> Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitive+liquid+chromatographic+method+for+determination+of+neuronal+release+of+serotonin%2C+noradrenaline+and+dopamine+monitored+by+microdialysis+in+the+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex.</a> J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).</li>
<li>Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+neurodegenerative+and+behavioural+changes+induced+by+AAV-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons.</a> Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).</li>
<li>Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA+pharmacokinetics+in+the+MPTP-lesioned+macaque+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease.</a> Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).</li>
<li>Mikkelsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP-induced+Parkinsonism+in+minipigs%3A+A+behavioral%2C+biochemical%2C+and+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study.</a> Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+dopamine+regulation+in+substantia+nigra+and+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Van Dam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+biogenic+amines%2C+amino+acids+and+cholinergic+markers+in+the+CNS+of+the+C57BL%2F6+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain.</a> Amino Acids. 28, 377-387 (2005).</li>
<li>Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones+affect+neurotransmitters+and+shape+the+adult+female+brain+during+hormonal+transition+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods.</a> Front Neurosci. 9 (37), (2015).</li>
<li>Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+bulb+monoamine+concentrations+vary+with+time+of+day%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day.</a> Neuroscience. 247, 234-241 (2013).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+and+impaired+response+habituation+in+hyperdopaminergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).</li>
<li>Ungerstedt, U., Pycock, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4371656">Functional correlates of dopamine neurotransmission.</a> Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).</li>
<li>Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Rapid+Dopamine+Dynamics+with+Fast+Scan+Cyclic+Voltammetry+During+Intra-oral+Tastant+Administration+in+Awake+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats.</a> J Vis Exp. , e52468(2015).</li>
<li>Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
<li>Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+in+vivo+dynamics+of+neurotransmitter+release+and+serotonin+uptake+after+acute+para-methoxyamphetamine+and+3%2C4-methylenedioxymethamphetamine+revealed+by+chronoamperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry.</a> Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten manuskrypt opisuje przydatne protokoły eksperymentalne do nakreślenia homeostazy DA w dowolnym wybranym modelu myszy. Zapewniamy szczegółowe protokoły pomiaru poziomów DA w tkance mózgowej myszy za pomocą HPLC i wychwytu synaptosomalnego DA w celu oceny funkcjonalnego transportu DA przez DAT. Procedury, protokoły i limity dla eksperymentu HPLC i testu wychwytu synaptosomalnego DA zostaną omówione poniżej.
Protokół wychwytu synaptosomalnego może dostarczyć użytecznych informacji na temat fu...

Dopamina (DA) jest modulującym neuroprzekaźnikiem krytycznym dla zachowania motorycznego, nagrody i funkcji poznawczych1,7,8,9. Nierównowaga w homeostazie DA jest związana z kilkoma chorobami neuropsychiatrycznymi, takimi jak zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi, uzależnienie od narkotyków, depresja i choroba Parkinsona1. DA jest uwalniany z neuronu presynaptycznego do szczeliny synaptycznej, gdzie wiąże się i aktywuje receptory na błonie pre- i postsynaptycznej, przekazując w ten sposób dalej sygnał. Poziom DA w synapsie po uwolnieniu jest przestrzennie i czasowo kontrolowany przez DAT3,10. Transporter sekwestruje DA z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, a tym samym utrzymuje fizjologiczne poziomy DA3,11. Genetyczne usunięcie DAT u myszy powoduje fenotyp hiperdopaminergiczny charakteryzujący się podwyższonym poziomem synaptycznego DA, wyczerpaniem wewnątrzkomórkowych pul DA i głębokimi zmianami w postsynaptycznej sygnalizacji DAergic class<="xref">10,12.
Tutaj prezentowane są dwa oddzielne protokoły, jeden do pomiaru zawartości tkanki DA, a drugi do oceny funkcjonalności DAT. W połączeniu z testem biotynylacji powierzchniowej opisanym przez Gabriela i wsp.13 te dwie metody dostarczają informacji o zawartości DA i funkcjonalnych poziomach DAT dla dokładnej oceny homeostazy DA. Dzięki tym metodom można scharakteryzować i opisać homeostazę DA różnych myszy transgenicznych lub modeli chorób. Narzędzia te zostały wdrożone i zoptymalizowane i są standardowym zastosowaniem w naszych laboratoriach. Obecne testy posłużyły do zbadania wpływu na homeostazę DA zmiany C-końca DAT14 lub ekspresji rekombinazy Cre pod promotorem hydroksylazy tyrozynowej (TH) 5.

<table><tbody><tr><td>Inhibitor COMT</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>RO-41-0960</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr> <tr><td>[3H]-Dopamina</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA</td><td>NET67-3001MC</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Filtry z mikrowłókna szklanego</td><td>GF / C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire</td><td>1822-024</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>HiSafe Płyn scyntylacyjny</td><td>Perkin Elmer</td><td>1200-437</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>MicroBeta2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białka BCA</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23225</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td>Do protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Life Science</td><td>S7903</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>P9541</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck KGaA</td><td>10043-52-4</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Life Science</td><td>63065</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0278</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Life Science</td><td>G7021</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Pargyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-8013</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Dezypramina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3900</td><td>Dla wychwytu synaptosomalnego DA </td></tr><tr><td>protokół Dopamina</td><td>Sigma Life Science</td><td>H8502</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Kokaina</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5776</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Instrumenty ASI</td> macierzy<td>mózgu</td><td>RBM2000C</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA</td></tr><tr><td>Cafano Mechaniczny zakłócacz teflonu</td><td>& Holm</td><td>wycofany</td><td>Dla protokołu wychwytu synaptosomalnego DA (homogenizacja)</td></tr><tr><td>Antec Decade (detektor amperometryczny)</td><td>Antec, Leiden, Holandia</td><td>Wycofane: nowy model DECADE Elite / Lite&trade; Detektor elektrochemiczny typu 175 i 176</td><td>Do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Avantec 0.22 &mu; m filtr szklany</td><td>Frisenette ApS, Dania</td><td>13CP020AS</td><td>Do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Kolumna: Prodigy 3 &mu; ODS-3 C18</td><td>Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Niemcy</td><td>Numer części: 00A-3300-E0</td><td>Dla protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Oprogramowanie rozwiązania LC</td><td>Stacja robocza Shimadzu</td><td>LabSolutions</td><td>Series do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy 0,1 M</td><td>Fluka Analytical</td><td>35418-500ml</td><td>Do protokołu HPLC (przygotowanie tkanki)</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-50g</td><td>Do protokołu</td></tr> <tr><td>HPLCNatriumdihydrogenphosphar</td><td>Bie& Berntsen</td><td>1.06346 1000g</td><td>Do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Monohydrat 1-oktanosulfonianu sodu</td><td>Aldrich</td><td>74885 -10g</td><td>Do protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitryl, izokratyczny stopień HPLC</td><td>Scharlau</td><td>AC03402500</td><td>Dla protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Filtre 0,22um</td><td>Frisenette ApS, Dania</td><td>Avantec 13CP020AS</td><td>Do protokołu HPLC (Przygotowanie tkanek)</td></tr> <tr><td>Kwas ortofosforowy 85%</td><td>Merck</td><td>1.00563. 1000 ml</td><td>dla protokołu HPLC</td></tr><tr><td>Elektroda</td><td>Antec, Leiden, Holandia</td><td>AN1161300</td><td>Dla protokołu HPLC (patrz instrukcja online)</td></tr><tr><td>Program detektora na detektorze elektrochemicznym DECADE II</td><td>Antec, Leiden, Holandia</td><td>Lite&trade; Detektor elektrochemiczny typu 175 i 176</td><td>dla protokołu HPLC</td></tr></tbody></table>

ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamina (DA) jest modulującym neuroprzekaźnikiem kontrolującym aktywność motoryczną, procesy nagradzania i funkcje poznawcze. Upośledzenie neuroprzekaźnictwa dopaminergicznego (DAergic) jest silnie związane z kilkoma chorobami związanymi z ośrodkowym układem nerwowym, takimi jak choroba Parkinsona, zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi i uzależnienie od narkotyków1,2,3,4. Nakreślenie mechanizmów chorobowych związanych z brakiem równowagi DA jest krytycznie zależne od modeli zwierzęcych w naśladowaniu aspektów chorób, a zatem protokoły oceniające określone części homeostazy DA są ważne dla zapewnienia nowych spostrzeżeń i możliwych celów terapeutycznych dla tych chorób.
Tutaj prezentujemy dwa użyteczne protokoły eksperymentalne, które w połączeniu zapewniają funkcjonalny odczyt systemu DAergic u myszy. Parametry biochemiczne i funkcjonalne homeostazy DA uzyskuje się poprzez ocenę poziomu DA i funkcjonalności transportera dopaminy (DAT)5. Podczas badania systemu DA niezbędna jest możliwość wiarygodnego pomiaru endogennych poziomów DA w dorosłym mózgu. Dlatego przedstawiamy, jak przeprowadzić wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) na tkance mózgowej myszy w celu określenia poziomów DA. Eksperyment przeprowadzamy na tkance z prążkowia grzbietowego (dStr) i jądra półleżącego (NAc), ale metoda jest również odpowiednia dla innych obszarów mózgu unerwionych DA.
DAT jest niezbędny do wychwytu zwrotnego DA do terminala presynaptycznego, tym samym kontrolując czasową i przestrzenną aktywność uwolnionego DA. Znajomość poziomów i funkcjonalności DAT w prążkowiu ma ogromne znaczenie przy ocenie homeostazy DA. W tym miejscu udostępniamy protokół, który pozwala jednocześnie wydedukować informacje o poziomach powierzchniowych i funkcji za pomocą testu wychwytu DA synaptosomal6.
Obecne metody w połączeniu ze standardowymi protokołami immunoblottingu dostarczają badaczowi odpowiednich narzędzi do scharakteryzowania systemu DAergic.

Obecny protokół pobierania DA (Rysunek 1) obejmuje wszystkie kroki niezbędne do oceny funkcjonalności DAT w synaptosomach myszy. Nasze reprezentatywne dane z metody pobierania DA (Rysunek 2) przedstawiają krzywą nasycenia z danymi nieskorygowanymi (Rysunek 2B) oraz danymi skorygowanymi (Rysunek 2A). Krzywa nasycenia obrazuje pobieranie u myszy typu dzikiego. Zazwyczaj po...

Wychwyt synaptosomalnej dopaminy i wysokosprawna chromatografia cieczowa stanowią eksperymentalne narzędzia do badania homeostazy dopaminy u myszy, oceniając odpowiednio funkcję transportera dopaminy i poziom dopaminy w tkance prążkowia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

W niniejszym protokole przedstawiamy dwie techniki. Celem pierwszej jest ocena funkcji transportera dopaminy poprzez pomiar poboru dopaminy z preparatów synaptosomalnych. Druga służy do oceny poziomu dopaminy w tkance za pomocą analizy HPLC.Metody te dostarczają istotnych parametrów homeostazy dopaminy, demonstrując sposób pomiaru zawartości dopaminy w tkankach oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy u myszy. Główną zaletą tych technik jest możliwość ich przeprowadzenia po manipulacjach in-vivo, takich jak manipulacje chemogenetyczne, podawanie leków in-vivo lub trening behawioralny zwierząt. Procedurę HPLC zaprezentuje Pia Weikop, profesor nadzwyczajny w Laboratorium Neuropsychiatrii.Aby rozpocząć tę procedurę, odsłoń czaszkę, rozcinając skórę i usuwając nadmiar tkanki. Następnie przetnij czaszkę wzdłuż sutura sagittalis, aż do przedniej części. Wprowadź końcówki nożyczek do oczu i usuń pozostałą część czaszki, rozcinając ją.Szybko wyjmij mózg i umieść go w lodowatym PBS. Następnie, używając matrycy do mózgu, wycinaj trzymilimetrowy przekrój koronarny prążkowia. Następnie wykonaj precyzyjną dyssekcję za pomocą igły.Następnie przenieś tkanki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w celu zważenia. Następnie powtórz procedury dla drugiego mózgu. Po uzyskaniu masy obu mózgów przenieś tkanki do szklanego homogenizatora zawierającego 1 ml lodowatego buforu do homogenizacji.Następnie homogenizuj tkankę za pomocą tłuczka napędzanego silnikiem. Potem przenieś homogenat do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i zbierz pozostały homogenat ze szkła do homogenizacji, płukząc je 0,5 ml dodatkowego buforu do homogenizacji. Po tym procesie odwirowuj jądra komórkowe i szczątki komórkowe w celu ich osadzenia.Następnie przenieś supernatant zawierający błony komórkowe i cytoplazmę do nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra i wiruj przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po tym czasie odlej supernatant zawierający cytoplazmę, a pellet zawierający surowe synaptosomy zawieś ponownie w 40 mikrolitrach na miligram tkanki w buforze do homogenizacji. Na tym etapie dodaj 440 mikrolitrów buforu do pobierania, ligand i kokainę do 12 wyznaczonych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra oraz 440 mikrolitrów buforu do pobierania i ligand do pozostałych 36 probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra.Sześć probówek do mikrowirówki o pojemności dwóch mililitrów należy oznakować jako 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 i 0,31. Następnie do pięciu probówek z najniższymi numerami należy dodać 750 µL buforu do pobierania i ligandu. Kolejno do probówki oznakowanej jako 10 należy dodać 1455,4 µL buforu do pobierania i ligandu, 14,6 µL nieoznakowanej dopaminy oraz 30 µL dopaminy trytowanej.Następnie przenieś 750 µL mieszaniny z probówki oznaczonej jako 10 do probówki oznaczonej jako 5. Wymieszaj dokładnie i przenieś 750 µL mieszaniny z tej probówki do probówki oznaczonej jako 2,5. Powtórz to rozcieńczenie z pozostałymi probówkami.Następnie wstępnie przepłucz szklane filtry z mikrowłókien czterema mililitrami buforu do pobierania po umieszczeniu ich w 12-dołkowym koszyczku do filtrów. Po tym dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny błon synaptosomalnych do pierwszych 24 probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra zawierających 440 mikrolitrów buforu. Ostrożnie wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj, aby upewnić się, że synaptosomy są zanurzone w buforze.Następnie pozostaw je w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Po 10 minutach dodaj 50 µL dopaminy o stężeniu 10 µM i 5 µM do dwóch pierwszych kolumn i inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć minut przy potrząsaniu. Po pięciu minutach zatrzymaj reakcję, dodając 1 mL lodowatego buforu do pobierania; powtórz tę procedurę dla stężeń 2,5 µM i 1,25 µM, a następnie dla 0,62 µM i 0,31 µM.Przenieś próbki na uprzednio przepłukane filtry z mikrowłókien i przemyj je pięcioma porcjami po 4 ml lodowatego buforu do pobierania. Po naniesieniu pierwszych 12 próbek na filtry, przenieś filtry do probówek scyntylacyjnych. Powtórz tę procedurę dla kolejnych 12 próbek.Przygotuj trzy probówki do pomiaru maksymalnego, umieszczając filtr z mikrowłókien na dnie probówek scyntylacyjnych nr 49 do 51 i dodając na wierzch 25 µL dopaminy o maksymalnym stężeniu 10 µM. Następnie pozostaw wszystkie 51 probówek scyntylacyjnych w dygestorium na jedną godzinę. Po tym czasie dodaj trzy mililitry płynu scyntylacyjnego do każdej probówki i wstrząsaj intensywnie na wytrząsarce przez jedną godzinę.Aby zmierzyć ilość tritiowanej dopaminy w liczniku beta przez jedną minutę, otwórz program i wybierz odpowiednie ustawienia. Do oznaczania białka wykorzystaj standardowy zestaw do analizy białek BCA, aby wyznaczyć stężenia białka w synaptosomach w celu przeprowadzenia korekt oraz właściwego porównania wychwytu między próbkami. W celu przygotowania tkanki dodaj 500 µL roztworu do homogenizacji do każdej próbki i zhomogenizuj wszystkie próbki za pomocą ultra-homogenizatora z pełną prędkością przez około 30 sekund.Próbki należy przechowywać w wodzie z lodem podczas homogenizacji. Następnie odwiruj próbki przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy 14 000 ×g. Po tym czasie przenieś około 200 µL każdej próbki na szklany filtr 0,22 µm przed analizą próbek metodą EC-HPLC. Aby skonfigurować detektor, ustaw wyjście na 700 mV, a temperaturę w termostacie detektora na 32 °C.Umieść fiolki w autosamplerze. Utwórz program zakresu, korzystając z instrukcji online, i dodaj program czasowy zgodnie z tabelą 2. Skonfiguruj system, uruchamiając program.Następnie wprowadź identyfikator użytkownika oraz hasło i kliknij OK. Poczekaj, aż program połączy się z instrumentami. Następnie przejdź do tabeli partii (batch table) i uzupełnij informacje o danych.Zapisz plik, przechodząc do menu plik, następnie kliknij „zapisz partię jako”, a następnie „zapisz”. Następnie wprowadź pierwszą próbkę, naciskając przycisk start partii. Po tym przejdź do akwizycji danych, aby śledzić chromatogram po zakończeniu analizy próbek.Następnie przejdź do analizy po uruchomieniu LC i wybierz nazwę pliku. Następnie kliknij widok. Na pasku integracji ręcznej dodaj wszystkie piki do integracji, a następnie przejdź do raportu danych i wydrukuj odczyt.Po dodaniu programu do detektora należy sporządzić trójpunktową krzywą kalibracyjną, wstrzykując przygotowany standard w objętościach 5, 10 i 15 µL. Na tym rysunku reprezentatywne dane przedstawiają krzywą nasycenia wychwytu dopaminy przez transporter dopaminy w preparatach synaptosomalnych myszy typu dzikiego. Czarne kropki reprezentują wartości dla czterech myszy przedstawione oddzielnie.Zielona krzywa pokazuje, w jaki sposób dane są zazwyczaj przedstawiane poprzez połączenie wyników od czterech do sześciu myszy na grupę. Poniżej znajduje się wykres nasycenia dla danych surowych przed korektą o rzeczywiste stężenie białka w próbkach. Wykres ten przedstawia zliczenia z próbek zawierających kokainę, które służą do odjęcia tła z danych dotyczących poboru.Kontrola ta jest niezbędna do określenia wiarygodności danych dotyczących wychwytu. Ten histogram przedstawia zdolność wychwytową transportera dopaminy, a ten histogram wykazuje, że Km dla transportera dopaminy wynosi 0,1 ± 0,03 µM, co dobrze koreluje z metodą woltamperometrii z obrotową elektrodą dyskową, w której wartości Km transportera dopaminy wynoszą od 0,6 do 1,2 µM. Podczas przeprowadzania procedury synaptosomalnej ważne jest, aby podczas przygotowywania synaptosomów tkanka była przez cały czas utrzymywana w lodzie.Po przeprowadzeniu analizy wychwytu dopaminy w synaptosomach można wykonać dodatkowe procedury, takie jak analiza biotynylacji powierzchniowej, aby ustalić, czy zaburzenia wychwytu dopaminy można wyjaśnić zmianioną ekspresją transportera dopaminy na powierzchni komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat badania homeostazy dopaminy u myszy poprzez analizę funkcjonalności transportera dopaminy oraz poziomu dopaminy w preparatach tkanki prążkowia.

assessment-dopaminergic-homeostasis-mice-use-high-performance-liquid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono &gt;95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.

Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Ten film pokazuje ocenę wychwytu dopaminy w synaptosomach pobranych z mózgów myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania synaptosomów do wychwytu dopaminy za pośrednictwem transporterów dopaminy, traktowania ich różnymi stężeniami dopaminy znakowanej radioaktywnie, izolowania synaptosomów i pomiaru radioaktywności w celu ilościowego określenia wychwytu dopaminy.

Pomiar wychwytu dopaminy w synaptosomach mózgu myszy za pomocą dopaminy znakowanej radioaktywnie

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Izoenzymy lipooksygenazy (LOX) mogą generować produkty, które mogą zwiększać lub zmniejszać stan zapalny układu nerwowego i neurodegenerację. Badanie interakcji gen-środowisko może zidentyfikować efekty specyficzne dla izoenzymu LOX. Wykorzystanie modelu 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) uszkodzenia nigrostriatalnego w dwóch liniach transgenicznych z niedoborem izoenzymów LOX pozwala na porównanie wpływu izoenzymów LOX na integralność dopaminergiczną i stan zapalny.

Modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie Parkinsona

Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

Ta metoda wprowadza prostą technikę wykrywania endogennego uwalniania monoamin za pomocą ostrych wycinków mózgu. Zestaw wykorzystuje 48-dołkową płytkę zawierającą uchwyt na tkankę do uwalniania monoamin. Uwolniona monoamina jest analizowana za pomocą HPLC w połączeniu z detekcją elektrochemiczną. Ponadto technika ta zapewnia metodę przesiewową w celu odkrywania leków.

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Poznaj metody oceny homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą wychwytu synaptosomalnego i HPLC. Techniki te pozwalają mierzyć poziom dopaminy i aktywność transportera po manipulacjach in vivo.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy (Wideo) | JoVE Journal

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Przeglądaj więcej filmów