Name: Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj metodę profilowania przeciwciał IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu. Technika ta umożliwia wysokoprzepustową analizę w kontekście badań nad rakiem i przewlekłymi stanami zapalnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Nagrodę Rozwoju Kariery Badawczej z Izraelskiego Funduszu Badań nad Rakiem, grant od Izraelskiej Narodowej Inicjatywy Nanotechnologicznej i Helmsley Charitable Trust for a Focal Technology Area on Nanomedicines for Personalized Theranostics (V.P-K), oraz grant National Institutes of Health R01GM076360 (dla X.C.).

<ol><li>Padler-Karavani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aiming+at+the+sweet+side+of+cancer%3A+Aberrant+glycosylation+as+possible+target+for+personalized-medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine.</a> Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).</li>
<li>Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+in+immune+recognition+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Glycans in immune recognition and response.</a> Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).</li>
<li>Häuselmann, I., Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+tumor-cell+glycosylation+promotes+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis.</a> Front Oncol. 4, (2014).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+uptake+and+incorporation+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+into+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells.</a> J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+specificity%2C+abundance%2C+and+composition+of+anti-Neu5Gc+antibodies+in+normal+humans%3A+potential+implications+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease.</a> Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+xeno-autoantibodies+against+a+non-human+sialic+acid+serve+as+novel+serum+biomarkers+and+immunotherapeutics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer.</a> Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).</li>
<li>Cao, H., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+consideration+on+sialic+acid+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">General consideration on sialic acid chemistry.</a> Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).</li>
<li>Deng, L., Chen, X., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+sialic+Acid+diversity+and+biology+using+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays.</a> Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).</li>
<li>Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoside+Arrays%3A+New+Synthetic+Strategies+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Curr+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications.</a> Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).</li>
<li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+of+fluorescently-tagged+natural+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans.</a> Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).</li>
<li>Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays%3A+powerful+tools+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery.</a> Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).</li>
<li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+analysis+of+glycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation and analysis of glycan microarrays.</a> Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).</li>
<li>Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/cs/c2cs35401b#!divAbstract">Carbohydrate microarrays.</a> Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).</li>
<li>Struwe, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+sample+preparation+guidelines+for+reliable+reporting+of+glycomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets.</a> Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. , (2016).</li>
<li>Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mono-O-acetylated+N-acetylneuraminic+acids+in+human+and+rat+sera+by+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography.</a> Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-comparison+of+protein+recognition+of+sialic+acid+diversity+on+two+novel+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays.</a> J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).</li>
<li>Padler-Karavani, V., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+impact+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+on+transplant+rejection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk.</a> Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).</li>
<li>Samraj, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+meat-derived+glycan+promotes+inflammation+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).</li>
<li>Pearce, O. M., Läubli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+cancer+biology+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in cancer biology and immunity.</a> Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).</li>
<li>Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+risk+of+diseases+associated+with+red+meat+intake%3A+Analysis+of+current+theories+and+proposed+role+for+metabolic+incorporation+of+a+non-human+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid.</a> Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).</li>
<li>Pearce, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+hormesis+of+cancer+growth+mediated+by+narrow+ranges+of+tumor-directed+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).</li>
<li>Pham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+novel+human-specific+xeno-auto-antibody+response+against+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium.</a> Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).</li>
<li>Reuven, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immunogenic+Neu5Gc+in+bioprosthetic+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves.</a> Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).</li>
<li>Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+presence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+recombinant+therapeutic+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Udana produkcja mikromacierzy glikanowej wymaga starannego planowania i obejmuje kilka ważnych kroków w protokole. Obejmują one: (1) planowanie układów bloków i płyt, które definiują wszystkie kolejne parametry (np. odległości, odstępy, ilość próbek i druk); (2) czyszczenie kołków i zapewnienie integralności sworzni, co ma kluczowe znaczenie dla kontrolowania jednorodności plamki; (3) utrzymywanie wysokiej wilgotności podczas drukowania, co ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia parowania próbki podczas długich na...

Sias to kwaśne cukry pokrywające łańcuchy glikanów na powierzchni komórki glikoproteiny i glikolipidy u kręgowców. Ekspresja Sia jest modyfikowana w komórkach nowotworowych1 i koreluje z progresją i/lub przerzutami2,3. Dwie z głównych form Sia u ssaków to Neu5Ac i jego hydroksylowana forma, Neu5Gc2. Ludzie nie mogą syntetyzować Neu5Gc z powodu specyficznej inaktywacji genu kodującego enzym CMAH . Ta nie-ludzka Sia metabolicznie włącza się do ludzkich komórek jako "ja", pochodząca z pokarmów bogatych w Neu5Gc (np. czerwone mięso)4,5. Neu5Gc występuje w niewielkich ilościach na powierzchni komórek ludzkiego nabłonka i śródbłonka, ale szczególnie kumuluje się w rakach. Neu5Gc jest rozpoznawany jako obcy przez ludzki humoralny układ odpornościowy2,6. Złożoność antygenowa glikanów Neu5Gc może powstać na wielu poziomach, w tym modyfikacji Neu5Tc, wiązania, leżących u podstaw glikanów i rusztowań oraz ich gęstości, a wszystko to odzwierciedla złożoność odpowiedzi przeciwciał anty-Neu5Gc u ludzi6. Niektóre z tych przeciwciał służą jako biomarkery raka i potencjalne immunoterapeutyki7. Pojawienie się chemoenzymatycznej syntezy różnych sialoglikanów8 utorowało drogę do bardziej dogłębnej analizy takich przeciwciał, ułatwionej dzięki zastosowaniu technologii mikromacierzy glikanowej9,10. W ten sposób, dzięki ułatwionemu przygotowywaniu i manipulowaniu dużymi bibliotekami naturalnych i syntetycznych węglowodanów, mikromacierze glikanowe stały się potężną, wysokowydajną technologią do badania interakcji węglowodanów z niezliczonymi biomolekułami10,11,12,13. W formacie matrycowym używane są minimalne ilości materiałów, a ten wielowartościowy wyświetlacz biologicznie istotnych glikanów pozwala na badanie tysięcy interakcji wiążących w jednym eksperymencie. Co ważne, technologia ta może być również stosowana do odkrywania biomarkerów i monitorowania odpowiedzi immunologicznej w różnych próbkach7,12.
Udana produkcja mikromacierzy glikanowej wymaga rozważenia trzech ważnych aspektów: typu robota drukarki, chemii koniugacji glikanów i optyki detekcyjnej. Jeśli chodzi o rozważania dotyczące przyrządów drukujących, dostępne są dwie techniki: drukarki kontaktowe i bezdotykowe. W druku kontaktowym 1-48 stalowych kołków zanurza się w wielodołkowej płytce źródłowej zawierającej roztwór glikanu i nakraplacza się je na funkcjonalizowanych szkiełkach podstawowych poprzez bezpośredni kontakt z powierzchnią szkiełka. Ilość roztworu dostarczonego do szkiełka jest funkcją czasu utrzymywania się na powierzchni szkiełka. Zazwyczaj próbki są najpierw wstępnie nakrapiane na pustaku szklanym (w celu uzyskania jednorodnych miejsc), zanim zostaną wydrukowane na powierzchni szkiełka. W drukarkach bezdotykowych (np. drukarkach piezoelektronicznych) glikany są drukowane ze szklanej kapilary za pomocą kontrolowanych sygnałów elektrycznych. Sygnał elektryczny można precyzyjnie skalibrować, aby uzyskać bardziej precyzyjne drukowanie w porównaniu z drukowaniem kontaktowym. Wielkość i morfologia plam są również stosunkowo bardziej jednorodne. Dodatkowym atutem jest recykling próbki z powrotem na płytę źródłową po wydrukowaniu. Niemniej jednak główną wadą drukarek piezoelektronicznych jest ograniczenie końcówek drukujących (4 lub 8), co skutkuje bardzo długim czasem drukowania, co wymaga szczególnej uwagi na stabilność suwaka, temperaturę, wilgotność i parowanie próbki. Bezdotykowa drukarka atramentowa wymaga większych objętości próbek14.
W przeciwieństwie do ograniczonych dostępnych opcji metod drukowania, chemia koniugacji glikanów jest bardziej złożonym rozważaniem, z wieloma opcjami do wyboru. Wybrana chemia immobilizacji musi uwzględniać zarówno grupy aktywne glikanów, jak i reaktywność powierzchni szkiełka. Glikany, które mają być unieruchomione na określonej powierzchni mikromacierzy, syntetyzowane syntetycznie lub naturalnie izolowane, wymagają identycznej grupy reaktywnej. Ponadto glikany muszą być czyste i jednorodne. Z drugiej strony, powierzchnia unieruchomienia i skład chemiczny powinny zapewniać powtarzalność i niezawodną gęstość przyczepu. Opracowano wiele metod immobilizacji z kowalencyjnym lub niekowalencyjnym (absorpcja fizyczna) attachment10,11,12,13. Aby uzyskać bardzo szczegółowe informacje na temat technologii drukowanych mikromacierzy glikanowych dla niewtajemniczonych badaczy, zapoznaj się z tymi doskonałymi recenzjami 13,15. Co ważne, niedawna inicjatywa Minimum Informacji Wymaganych w Eksperymencie Glikomiksowym (MIRAGE) opisuje wytyczne dotyczące przygotowywania próbek16 oraz raportowania danych z analiz mikromacierzy glikanów17 w celu poprawy standardów w tej rozwijającej się dziedzinie.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół wytwarzania mikromacierzy sialoglykanów przy użyciu specjalnej nano-drukarki kontaktowej w formacie 16-dołkowym. Każdy z glikanów ma pierwszorzędową aminę, która pośredniczy w ich kowalencyjnym połączeniu ze szkiełkami aktywowanymi żywicą epoksydową. Opisujemy również opracowanie i analizę jednego preparatu przy użyciu różnych próbek surowic ludzkich, przeciwciał i lektyn roślinnych wiążących Sia. Testy mikromacierzy Sialoglycan obejmują kilka głównych etapów, które obejmują wytwarzanie, przetwarzanie, opracowywanie i analizę. Produkcja macierzy wymaga zaplanowania układu matrycy, przygotowania glikanów i płytki źródłowej, zaprogramowania nanodrukarki i wydrukowania slajdów. Następnie slajdy są przetwarzane, wywoływane i analizowane (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Pierwszorzędowe aminy zawierające sialoglikany</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Skontaktuj się z info@glycohubusa.com w sprawie zapytań dotyczących związków</td><td>Glikany drukowane</td></tr><tr><td>Fosforan sodowy jednowodny</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Drukujący składnik buforowy</td></tr><tr><td>Fosforan disodowy siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Drukujący składnik buforowy</td></tr><tr><td>Fosforan buforowana sól fizjologiczna</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>Bufor do drukowania / bufor inkubacyjny / myjący</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Odczynnik blokujący szkiełko</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>Składnik buforowy do druku</td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Odczynnik blokujący szkiełko</td></tr><tr><td>Albumina jaja kurzego (klasa V)</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Białko blokujące slajdy</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Płyn do prania szkiełek</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marker na tablicy</td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, cała cząsteczka</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Komponent drukarski</td></tr><tr><td>Biotynylowany- SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>Roślinny lektyn &ndash; wiązanie Sia-alpha2&ndash; 6-linked</td></tr><tr><td>Biotinylated-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>Lektyna roślinna &ndash; wiązanie Sia-alpha2&ndash; 3-linkowany</td></tr><tr><td>kurczak-anty Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Pierwotne wykrywanie</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Wiązanie biotyny</td></tr><tr><td>Cy3-anty Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>Wtórne wykrywanie przeciwko ludzkiej</td></tr><tr><td>IgG Cy3-anti Chicken IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>Wtórne wykrywanie przeciwko kurczakom IgY</td></tr><tr><td>Próbki surowic ludzkich</td><td>Izraelski Bank</td><td></td><td>Krwi Wykrywanie pierwotne</td></tr><tr><td>Sprężony azot (klasa 5)</td><td></td><td></td><td>Ogólne narzędzie do odkurzania/suszenia</td></tr><tr><td>Prowadnice z powłoką epoksydową</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>Slajdy</td></tr><tr><td>Prowadnice z powłoką epoksydową</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Slajdów. W tego typu szkiełkach powierzchnia jest bardziej hydrofobowa (w porównaniu do szkiełek rdzeniowych), dlatego glikany Print Buffer musiałyby być uzupełnione o 0,005% Tween-20, aby uzyskać 100 &mikro; plamki o rozmiarze m.</td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka do mikromiareczkowania</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Płyta drukarska</td></tr><tr><td>Marker laboratoryjny VWR</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Etykietowanie szkiełek</td></tr><tr><td>Rurka do barwienia</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>Narzędzie do wywoływania szkiełek</td></tr><tr><td>Kąpiel barwiąca</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>Narzędzie do wywoływania szkiełek</td></tr><tr><td>Uchwyty do szkieł VWR</td><td></td><td>631-9321</td><td>Narzędzie</td></tr> <tr><td>do wywoływania slajdówSkaner GenePix</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>4000B</td><td>Skaner slajdów</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>Drukarka</td></tr><tr><td>tablicowa Piny</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Piny drukarskie</td></tr><tr><td>Moduł ProPlate Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Moduł wywoływania slajdów</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>Wymagany do matrycy i nawilżacza</td></tr><tr><td>Elektroniczny Multi Pippete, 8-kanałowy, zakres głośności 2-125 &mu; L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Korektor Impact2 384</td><td>Wielopipet do rozsiewania próbek na płytce 384-dołkowej</td></tr></tbody></table>

profilowanie igg anty-neu5gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

Komórki pokryte są płaszczem łańcuchów węglowodanowych (glikanów), który jest często zmieniany w raku i który zawiera zmiany w ekspresji kwasu sjalowego (Sia). Są to kwaśne cukry, które mają 9-węglowy szkielet i zamykają glikany kręgowców na powierzchni komórek. Dwie z głównych form Sia u ssaków to kwas N-acetyloneuraminowy (Neu5Ac) i jego hydroksylowana forma, kwas N-glikolyloneuraminowy (Neu5Gc). Ludzie nie mogą wytwarzać endogennego Neu5Gc z powodu inaktywacji genu kodującego hydroksylazę 5'monofosforanu cytydyny-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). Obcy Neu5Gc jest pozyskiwany przez komórki ludzkie poprzez dietetyczne spożywanie czerwonego mięsa i nabiału, a następnie pojawia się na różnych glikanach na powierzchni komórki, gromadząc się głównie na rakach. W związku z tym ludzie mają krążące przeciwciała anty-Neu5TGC, które odgrywają różne role w raku i innych przewlekłych chorobach o podłożu zapalnym i które stają się potencjalnymi celami diagnostycznymi i terapeutycznymi. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustowy test mikromacierzy sialoglikanu do oceny takich przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicy ludzkiej. Glikany zawierające Neu5Gc i ich dopasowane pary kontrolne (glikany zawierające Neu5Ac), z których każdy ma rdzeń aminy pierwszorzędowej, są kowalencyjnie połączone ze szkiełkami szklanymi pokrytymi żywicą epoksydową. Przykładem jest drukowanie 56 slajdów w formacie 16-dołkowym przy użyciu specjalnej nanodrukarki zdolnej do wygenerowania do 896 tablic na wydruk. Każdy preparat może być używany do badania przesiewowego 16 różnych próbek surowic ludzkich w celu oceny swoistości, intensywności i różnorodności przeciwciał anty-Neu5Gc. Protokół opisuje złożoność tego solidnego narzędzia i zawiera podstawowe wytyczne dla osób dążących do zbadania odpowiedzi na dietetyczny antygen węglowodanowy Neu5Gc w różnych próbkach klinicznych w formacie tablicowym.

Drukowanie, rozwój i analiza tablicy:
Drukowanie mikromacierzy sialoglikanu z wieloma próbkami glikanów i ludzkimi krzywymi IgG STD w 16 różnych blokach wymaga dokładnej kalibracji, aby zapewnić, że wszystkie próbki są drukowane tak równomiernie, jak to możliwe, we wszystkich 16 blokach na slajdzie i na wszystkich slajdach w tym samym nakładzie druku. W związku z tym przed określeniem określonych parametrów drukowania wymaganych je...

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

Ogólnym celem testu mikromacierzy sialoglikanu jest ocena przeciwciał anty-Neu5Gc IgG w surowicach ludzkich w sposób wysokoprzepustowy w porównaniu z różnorodną kolekcją sialoglikanów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glikoimmunologii, takie jak to, w jaki sposób przeciwciała anty-Neu5Gc są zaangażowane w różne choroby ludzkie, w tym raka, choroby serca i ksenotransplantację. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wysokoprzepustowe profilowanie przeciwciał anty-Neu5Gc przeciwko niezliczonej ilości antygenów sialoglikanu.Procedurę zademonstruje Sharon Yehuda, mistrzyni z mojego laboratorium. Staranne i szczegółowe planowanie produkcji i układu tablicy jest ważne dla zapewnienia sukcesu. Proces ten jest szczegółowo opisany w protokole tekstowym i informacjach uzupełniających.Rozcieńczyć każdy glikan do 100 mikromolów w całkowitej objętości 100 mikrolitrów buforu do drukowania glikanów w probówkach do mikrowirówek. Następnie przygotuj pierwszorzędową aminę zawierającą barwnik fluorescencyjny w ilości jednego miligrama na milimetr z buforem markerowym. Następnie rozcieńczyć do jednego mikrograma na mililitr w całkowitej objętości jednego mililitra.Przygotować rozcieńczenia ludzkiej krzywej wzorcowej IgG zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść płytkę 384 dołków na lodzie. Za pomocą elektronicznej pipety wielofunkcyjnej podaczuj siedem mikrolitrów każdego glikanu, markera i krzywej standardowej IgG zgodnie z układem płytek znajdującym się w protokole tekstowym.Przykryj płytkę parafilmem i wiruj przez dwie minuty w temperaturze 250 razy g i 12 stopni Celsjusza. Drukowanie musi odbywać się w miejscu wolnym od kurzu o wilgotności od 60 do 70%Tutaj wszystkie kroki są wykonywane w czystym pomieszczeniu przy użyciu odpowiednich rękawic i odzieży ochronnej. Włącz drukarkę nano i nawilżacz.Po zaprogramowaniu maszyny drukarskiej zgodnie z opisem w protokole tekstowym, umieść płytkę 384-dołkową z poddanymi próbkami w jej miejscu na pokładzie matrycy i zdejmij osłonę parafilmu. W tym momencie rozpocznij drukowanie. Ponumeruj szkiełka pisakiem odpornym na rozpuszczalniki alkoholowe i przechowuj je w zamkniętym próżniowo pudełku w ciemności.Aby przetworzyć matryce, najpierw wyjmij szkiełko z zamkniętego próżniowo pudełka i umieść je w okapie chemicznym na pięć minut, układem skierowanym do góry, aby odparować nadmiar cieczy. Następnie nawodnij szkiełko, umieszczając je w probówce barwiącej wypełnionej wodą dejonizowaną. Przykryj probówkę folią i inkubuj przez pięć minut, powoli i delikatnie potrząsając w temperaturze pokojowej.Aby zablokować reaktywne grupy epoksydowe na szkiełku, zanurz szkiełko w 50-mililitrowej probówce barwiącej wypełnionej wstępnie podgrzanym roztworem blokującym etanoloaminę. Przykryj probówkę folią i inkubuj przez 30 minut, powoli i delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Wyrzuć roztwór blokujący etanoloaminę do odpowiedniego pojemnika na śmieci stanowiącego zagrożenie biologiczne.Następnie umieść szkiełko w nowej, czystej tubie barwiącej wypełnionej wodą dejonizowaną o temperaturze 50 stopni Celsjusza. Przykryj probówkę folią i inkubuj przez 10 minut, powoli i delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Wylej wodę i przenieś szkiełka do szklanego uchwytu do barwienia.Umieścić aparat w wahadłowym uchwycie na płytkę i odwirować szkiełko do sucha. Następnie umieść szkiełko na 16-dołkowej przegrodzie. Po wstępnym zwilżeniu studzienek należy użyć pipety wielofunkcyjnej, aby wprowadzić 200 mikrolitrów PBST do studzienek szkiełkowych.Następnie umieść je w przykrytej, wilgotnej komorze i potrząsaj przez pięć minut. Wyjmij PBST, delikatnie przesuwając i stukając w czysty ręcznik papierowy. Następnie do każdej studzienki należy wprowadzić 200 mikrolitrów buforu blokującego PBS-Albuminę jaja kurzego.Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Następnie należy przygotować detekcję pierwotną, rozcieńczoną w buforze blokującym PBS-OVA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zetrzeć bufor blokujący PBS-OVA ze szkiełka i dodać 200 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego na studzienkę.Inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez dwie godziny. Następnie strzepnij główną detekcję ze szkiełka i umyj ją trzykrotnie za pomocą PBST. Inkubować szkiełko w PBST przez pięć minut w wilgotnej komorze przed ostatnim przemyciem PBST.Następnie umyj raz PBS. Następnie należy przygotować przeciwciało drugorzędowe w PBS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zdjąć PBS ze szkiełka i dodać 200 mikrolitrów przeciwciała wtórnego.Strzepnąć przeciwciało drugorzędowe ze szkiełka i przemyć je czterokrotnie PBST, jak poprzednio. Ostrożnie zdejmij ramkę, a następnie umieść szkiełka w 50-mililitrowej probówce do barwienia szkiełek wypełnionej PBS i potrząsaj przez pięć minut. Następnie napełnij dwie kąpiele barwiące szkiełka wodą dejonizowaną.Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka i zanurz je w pierwszej kąpieli. Szybko zanurz szkiełko dziesięć razy. Następnie przenieś szkiełko do drugiej kąpieli i zanurz je jeszcze dziesięć razy.Po zanurzeniu inkubować szkiełko przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem. Po inkubacji wylać wodę i przenieść szkiełko do szklanego uchwytu do barwienia. Umieść uchwyt do barwienia szkła w wahadłowym uchwycie talerza i odwiruj szkiełko do sucha.Otwórz drzwiczki skanera i umieść w nich szkiełko skierowanym w dół. W tym momencie rozpocznij skanowanie. Zapisz zeskanowane slajdy jako plik TIFF.Aby przygotować slajd do analizy, wybierz opcję Załaduj listę tablic i prześlij odpowiedni plik GAL, który odwzorowuje tablice w każdym bloku na slajdzie. Szkiełka zostały opracowane z 16 różnymi pierwotnymi elementami detekcyjnymi, po jednym w każdym bloku. Roślina Lectin SNA wiąże kwas sjalowy związany z a2-6.Natomiast roślina Lectin MALII wiąże kwas sjalowy związany z a2-3. Poliklonalne IgY anty-Neu5Gc wiąże sialoglikany zawierające Neu5Gc, ale nie wiąże sialoglikanów zawierających Neu5Ac. Aby sprofilować IgG anty-Neu5Gc, 12 surowic od zdrowych ludzkich dawców przeanalizowano na wydrukowanej mikromacierzy sialoglikanu i opracowano przy użyciu znakowanej fluorescencyjnie anty-ludzkiej IgG w znormalizowanej do nanogramów na mikrolitr.Wszystkie badane surowice ludzkie zawierały różne poziomy IgG anty-Neu5Gc, prawie bez rozpoznania dopasowanych par sialoglikanów zawierających Neu5Ac. Co więcej, wzorce rozpoznawania IgG anty-Neu5Gc są bardzo zróżnicowane między tymi 12 różnymi surowicami, zarówno pod względem intensywności, jak i różnorodności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak profilować przeciwciała anty-Neu5Gc w różnych próbkach ludzkich w sposób wysokoprzepustowy, przy użyciu systemu mikromacierzy glikanowej.

profiling-anti-neu5gc-igg-human-sera-with-sialoglycan-microarray

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Ten film demonstruje technologię drukowanej macierzy glikanowej do analizy krążących przeciwciał anty-glikanowych w surowicy myszy. Przeciwciała w surowicy oddziałują ze specyficznymi glikanami na chipie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie skanowania fluorescencyjnego.

Wykrywanie krążących przeciwciał anty-glikanowych za pomocą drukowanej matrycy glikanów

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Opisujemy tutaj metodę generowania konfigurowalnych mikromacierzy antygenowych, które mogą być używane do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM w surowicy od ludzi i myszy. Macierze te pozwalają na wysokoprzepustowe i ilościowe wykrywanie przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenom lub epitopom.

Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.

Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

Immunoglobulina G (IgG) N-glikan jest scharakteryzowany za pomocą hydrofilowej chromatografii oddziaływań UPLC. Ponadto struktura N-glikanu IgG jest wyraźnie oddzielona. Przedstawiono tutaj wprowadzenie do tej metody eksperymentalnej, tak aby mogła być szeroko stosowana w warunkach badawczych.

Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Poznaj metodę profilowania przeciwciał IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu. Technika ta umożliwia wysokoprzepustową analizę w kontekście badań nad rakiem i przewlekłymi stanami zapalnymi.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Przeglądaj więcej filmów