Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu
13 lipca 2017
Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.
Ogólnym celem testu mikromacierzy sialoglikanu jest ocena przeciwciał anty-Neu5Gc IgG w surowicach ludzkich w sposób wysokoprzepustowy w porównaniu z różnorodną kolekcją sialoglikanów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glikoimmunologii, takie jak to, w jaki sposób przeciwciała anty-Neu5Gc są zaangażowane w różne choroby ludzkie, w tym raka, choroby serca i ksenotransplantację. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wysokoprzepustowe profilowanie przeciwciał anty-Neu5Gc przeciwko niezliczonej ilości antygenów sialoglikanu.
Procedurę zademonstruje Sharon Yehuda, mistrzyni z mojego laboratorium. Staranne i szczegółowe planowanie produkcji i układu tablicy jest ważne dla zapewnienia sukcesu. Proces ten jest szczegółowo opisany w protokole tekstowym i informacjach uzupełniających.
Rozcieńczyć każdy glikan do 100 mikromolów w całkowitej objętości 100 mikrolitrów buforu do drukowania glikanów w probówkach do mikrowirówek. Następnie przygotuj pierwszorzędową aminę zawierającą barwnik fluorescencyjny w ilości jednego miligrama na milimetr z buforem markerowym. Następnie rozcieńczyć do jednego mikrograma na mililitr w całkowitej objętości jednego mililitra.
Przygotować rozcieńczenia ludzkiej krzywej wzorcowej IgG zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść płytkę 384 dołków na lodzie. Za pomocą elektronicznej pipety wielofunkcyjnej podaczuj siedem mikrolitrów każdego glikanu, markera i krzywej standardowej IgG zgodnie z układem płytek znajdującym się w protokole tekstowym.
Przykryj płytkę parafilmem i wiruj przez dwie minuty w temperaturze 250 razy g i 12 stopni Celsjusza. Drukowanie musi odbywać się w miejscu wolnym od kurzu o wilgotności od 60 do 70%Tutaj wszystkie kroki są wykonywane w czystym pomieszczeniu przy użyciu odpowiednich rękawic i odzieży ochronnej. Włącz drukarkę nano i nawilżacz.
Po zaprogramowaniu maszyny drukarskiej zgodnie z opisem w protokole tekstowym, umieść płytkę 384-dołkową z poddanymi próbkami w jej miejscu na pokładzie matrycy i zdejmij osłonę parafilmu. W tym momencie rozpocznij drukowanie. Ponumeruj szkiełka pisakiem odpornym na rozpuszczalniki alkoholowe i przechowuj je w zamkniętym próżniowo pudełku w ciemności.
Aby przetworzyć matryce, najpierw wyjmij szkiełko z zamkniętego próżniowo pudełka i umieść je w okapie chemicznym na pięć minut, układem skierowanym do góry, aby odparować nadmiar cieczy. Następnie nawodnij szkiełko, umieszczając je w probówce barwiącej wypełnionej wodą dejonizowaną. Przykryj probówkę folią i inkubuj przez pięć minut, powoli i delikatnie potrząsając w temperaturze pokojowej.
Aby zablokować reaktywne grupy epoksydowe na szkiełku, zanurz szkiełko w 50-mililitrowej probówce barwiącej wypełnionej wstępnie podgrzanym roztworem blokującym etanoloaminę. Przykryj probówkę folią i inkubuj przez 30 minut, powoli i delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Wyrzuć roztwór blokujący etanoloaminę do odpowiedniego pojemnika na śmieci stanowiącego zagrożenie biologiczne.
Następnie umieść szkiełko w nowej, czystej tubie barwiącej wypełnionej wodą dejonizowaną o temperaturze 50 stopni Celsjusza. Przykryj probówkę folią i inkubuj przez 10 minut, powoli i delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Wylej wodę i przenieś szkiełka do szklanego uchwytu do barwienia.
Umieścić aparat w wahadłowym uchwycie na płytkę i odwirować szkiełko do sucha. Następnie umieść szkiełko na 16-dołkowej przegrodzie. Po wstępnym zwilżeniu studzienek należy użyć pipety wielofunkcyjnej, aby wprowadzić 200 mikrolitrów PBST do studzienek szkiełkowych.
Następnie umieść je w przykrytej, wilgotnej komorze i potrząsaj przez pięć minut. Wyjmij PBST, delikatnie przesuwając i stukając w czysty ręcznik papierowy. Następnie do każdej studzienki należy wprowadzić 200 mikrolitrów buforu blokującego PBS-Albuminę jaja kurzego.
Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Następnie należy przygotować detekcję pierwotną, rozcieńczoną w buforze blokującym PBS-OVA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zetrzeć bufor blokujący PBS-OVA ze szkiełka i dodać 200 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego na studzienkę.
Inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez dwie godziny. Następnie strzepnij główną detekcję ze szkiełka i umyj ją trzykrotnie za pomocą PBST. Inkubować szkiełko w PBST przez pięć minut w wilgotnej komorze przed ostatnim przemyciem PBST.
Następnie umyj raz PBS. Następnie należy przygotować przeciwciało drugorzędowe w PBS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zdjąć PBS ze szkiełka i dodać 200 mikrolitrów przeciwciała wtórnego.
Strzepnąć przeciwciało drugorzędowe ze szkiełka i przemyć je czterokrotnie PBST, jak poprzednio. Ostrożnie zdejmij ramkę, a następnie umieść szkiełka w 50-mililitrowej probówce do barwienia szkiełek wypełnionej PBS i potrząsaj przez pięć minut. Następnie napełnij dwie kąpiele barwiące szkiełka wodą dejonizowaną.
Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka i zanurz je w pierwszej kąpieli. Szybko zanurz szkiełko dziesięć razy. Następnie przenieś szkiełko do drugiej kąpieli i zanurz je jeszcze dziesięć razy.
Po zanurzeniu inkubować szkiełko przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem. Po inkubacji wylać wodę i przenieść szkiełko do szklanego uchwytu do barwienia. Umieść uchwyt do barwienia szkła w wahadłowym uchwycie talerza i odwiruj szkiełko do sucha.
Otwórz drzwiczki skanera i umieść w nich szkiełko skierowanym w dół. W tym momencie rozpocznij skanowanie. Zapisz zeskanowane slajdy jako plik TIFF.
Aby przygotować slajd do analizy, wybierz opcję Załaduj listę tablic i prześlij odpowiedni plik GAL, który odwzorowuje tablice w każdym bloku na slajdzie. Szkiełka zostały opracowane z 16 różnymi pierwotnymi elementami detekcyjnymi, po jednym w każdym bloku. Roślina Lectin SNA wiąże kwas sjalowy związany z a2-6.
Natomiast roślina Lectin MALII wiąże kwas sjalowy związany z a2-3. Poliklonalne IgY anty-Neu5Gc wiąże sialoglikany zawierające Neu5Gc, ale nie wiąże sialoglikanów zawierających Neu5Ac. Aby sprofilować IgG anty-Neu5Gc, 12 surowic od zdrowych ludzkich dawców przeanalizowano na wydrukowanej mikromacierzy sialoglikanu i opracowano przy użyciu znakowanej fluorescencyjnie anty-ludzkiej IgG w znormalizowanej do nanogramów na mikrolitr.
Wszystkie badane surowice ludzkie zawierały różne poziomy IgG anty-Neu5Gc, prawie bez rozpoznania dopasowanych par sialoglikanów zawierających Neu5Ac. Co więcej, wzorce rozpoznawania IgG anty-Neu5Gc są bardzo zróżnicowane między tymi 12 różnymi surowicami, zarówno pod względem intensywności, jak i różnorodności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak profilować przeciwciała anty-Neu5Gc w różnych próbkach ludzkich w sposób wysokoprzepustowy, przy użyciu systemu mikromacierzy glikanowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Test mikromacierzy sialoglikanowej służy do oceny poziomu przeciwciał IgG przeciwko Neu5Gc w ludzkich surowicach, umożliwiając wysokoprzepustową analizę w odniesieniu do różnych sialoglikanów. Metoda ta ma istotne znaczenie dla zrozumienia roli przeciwciał anty-Neu5Gc w takich schorzeniach jak nowotwory i przewlekłe stany zapalne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Glikounimmunologia
- Przewlekły stan zapalny
- Diagnostyka nowotworów
Wprowadzenie
- Przeciwciała anty-Neu5Gc są zaangażowane w rozwój kilku ludzkich chorób.
- Zrozumienie ich roli może pomóc w opracowaniu narzędzi diagnostycznych.
- Test ten pozwala na profilowanie w odniesieniu do zróżnicowanej kolekcji sialoglikanów.
- Metody wysokoprzepustowe są niezbędne do prowadzenia badań na dużą skalę.
Cel badania
- Ocena poziomu przeciwciał przeciwko Neu5Gc w surowicach ludzkich.
- Zbadanie ich roli w przebiegu różnych chorób.
- Opracowanie wysokoprzepustowego testu diagnostycznego.
Zastosowane metody
- Analiza za pomocą mikrotablicy sialoglikanów
- Profilowanie wysokoprzepustowe
- Wytwarzanie mikrotablic i planowanie układu
- Szczegółowy protokół i informacje uzupełniające
Główne wyniki
- Pomyślna ocena poziomu przeciwciał Anti-Neu5Gc IgG w ludzkich surowicach.
- Wykazanie skuteczności testu w profilowaniu przeciwciał.
- Wnioski dotyczące zależności między przeciwciałami a chorobami.
- Potencjał zastosowania w diagnostyce nowotworów i badaniach nad przewlekłymi stanami zapalnymi.
Wnioski
- Test mikrotablic sialoglikanowych jest obiecującym narzędziem diagnostycznym.
- Ułatwia on zrozumienie glikoimmunologii w kontekście chorób.
- Przyszłe zastosowania mogą usprawnić diagnostykę pacjentów oraz strategie leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Profilowanie przeciwciał IgG przeciwko Neu5Gc w ludzkich surowicach umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku celów glikoimmunologicznych w nowotworach i stanach zapalnych o charakterze przewlekłym. Wysokoprzepustowy test z wykorzystaniem mikromacierzy sialoglikanów dostarcza ilościowych i powtarzalnych danych wspierających walidację celów oraz procesy opracowywania testów. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w wiązaniu ekspozycji na antygeny pokarmowe z odpowiedziami immunologicznymi istotnymi dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących roli przeciwciał anty-Neu5Gc w nowotworach i stanach zapalnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez pomiar swoistości przeciwciał wobec glikanów zawierających Neu5Gc.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną dzięki profilowaniu zróżnicowanych próbek surowicy od zdrowych dawców.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych układów biologicznych do dalszych etapów analizy z wykorzystaniem kowalencyjnie związanych sialoglikanów na szkiełkach powlekanych epoksydem.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów poprzez kontrolowany druk na 56 szkiełkach w formacie 16 dołków.
- Wartość naukowa: Umożliwienie wiarygodnej oceny związków poprzez przesiewanie 16 różnych ludzkich surowic na jednym szkiełku pod kątem intensywności i różnorodności przeciwciał.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówienie znaczenia w kontekście chorób poprzez powiązanie przeciwciał anty-Neu5Gc z nowotworami i chorobami zapalnymi o charakterze przewlekłym.
- Wartość operacyjna: Opis ciągłości procesu od odkrycia po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem próbek surowic ludzkich.
- Wartość naukowa: Koncentracja na wartości w zakresie predykcyjnego ograniczania ryzyka poprzez identyfikację zróżnicowanych wzorców rozpoznawania między surowicami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wspiera biologię odkrywczą poprzez testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w glikoimmunologii.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda wspiera testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych lub ograniczanie ryzyka biologicznego.
- Screening: Opisuje gotowość testu, powtarzalność lub wyniki ilościowe, jeśli są one zawarte w artykule.
- Analityka: Wskazuje pomiary, odczyty lub wyniki statystyczne, które pomagają zespołom w porównywaniu warunków.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną lub dopasowaniem biomarkerów, wyłącznie w przypadku, gdy wynika to z treści źródłowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako powtarzalną zdolność analityczną, a nie technikę jednorazowego użytku.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna w zakresie glikoimmunologii oraz obsługi mikromacierzy.
- Konieczność zapewnienia instrumentarium i infrastruktury analitycznej, w tym nanodrukarki i skanera.
- Wymogi standaryzacji międzyzespołowej w zakresie wytwarzania i układu macierzy.
- Kwestie adaptacyjne w różnych systemach modelowych, np. przy zastosowaniu zróżnicowanych próbek surowic ludzkich.
- Praktyczne ograniczenia wynikające z rodzaju materiału źródłowego, w tym potrzeba zapewnienia środowiska wolnego od kurzu i o kontrolowanej wilgotności.
