Name: Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Poznaj elektrochemiczną platformę biosensorów mikroprzepływowych opartą na technologii suchego filmu fotorezystu. Ta metoda umożliwia szybką i czułą detekcję analitów w diagnostyce point-of-care.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) za częściowe sfinansowanie tej pracy w ramach grantów o numerach UR 70/10-01 i UR 70/12-01.

1. Produkcja biosensora mikroprzepływowego z wykorzystaniem technologii DFR
<ol>
	<li>Przygotowanie płytek PI.
	<ol>
		<li>Pokrój podłoże PI na 6-calowe okrągłe wafle. Wstaw wafel PI do piekarnika w temperaturze 120 °C na około 1 godzinę w celu wypieku odwodnionego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwszy etap fotolitografii w procesie startu.
	<ol>
		<li>Zaprogramuj maszynę do powlekania na czas wirowania 30 s przy 3 000 obr./min, z przyspieszeniem 2 000 obr./min. Umieść płytkę PI na wirówce i zamocuj ją, stosując próżnię. Dozować 2 ml rezystu, umożliwiając proces lift-off, i rozpocząć program wirowania. Wyjmij wafel z wirówki i piecz go na miękko na płycie grzejnej przez 2 minuty w temperaturze 100 °C.</li>
		<li>Dostosuj żądaną maskę do modelowania elektrod na płytce PI gołym okiem i wystaw ją na działanie światła UV 400 mJ/cm2 (365 nm). Umieść wafel w misce wypełnionej wywoływaczem dopasowującym opór na wytrząsarce orbitalnej i pozwól mu lekko wstrząsnąć przez 1 minutę.</li>
		<li>Po usunięciu nadmiaru oporu spłucz płytkę PI wodą dejonizowaną (DI-water) pod prysznicem, a następnie wysusz ją sprężonym powietrzem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie platyny w celu wytworzenia elektrod.
	<ol>
		<li>Użyj standardowego procesu fizycznego osadzania z fazy gazowej, aby nałożyć 200 nm platyny na wafel19.</li>
		<li>Umieść wafel w misce. Dodaj pasujący zmywacz do miski i usuń opór do podnoszenia, lekko potrząsając waflem na wytrząsarce orbitalnej, aż cały nadmiar platyny zostanie usunięty. Opłucz i osusz płytkę PI zgodnie z opisem w kroku 1.2.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drugi etap fotolitografii: Formowanie warstwy izolacyjnej.
	<ol>
		<li>Wstaw wafel PI do piekarnika nagrzanego do 120 °C na 5 minut, aby go odwodnił.</li>
		<li>Zaprogramuj pierwszy krok wirówki na 5 s czasu wirowania przy 500 obr./min. Zaprogramuj drugi stopień na 30 s przy 4 000 obr./min, z przyspieszeniem 700 obr./min.</li>
		<li>Umieść wafel PI na wirówce i zamocuj go, stosując próżnię. Dozować 4 ml odpowiedniego fotorezystu na bazie żywicy epoksydowej przed rozpoczęciem programu wirowania.</li>
		<li>Panierowany wafel pieczemy na miękko przez 3 minuty w temperaturze 95 °C na gorącej płycie.</li>
		<li>Dopasuj maskę do warstwy izolacyjnej na płytce za pomocą odpowiednich znaczników wyrównania i soczewki okularowej. Wystaw wafel na działanie światła UV 100 mJ/cm2 (365 nm).</li>
		<li>W przypadku pieczenia po ekspozycji umieść wafel na rozgrzanej płycie grzejnej na 2 minuty w temperaturze 95 °C.</li>
		<li>Umieścić wafel w misce i rozwinąć rezystant za pomocą odpowiedniego wywoływacza (np. octanu 1-metoksy-2-propylu przez 2 minuty, w przypadku SU-8) na wytrząsarce orbitalnej.</li>
		<li>Najpierw opłucz płytkę PI izopropanolem, a następnie spłucz ją i wysusz zgodnie z opisem w kroku 1.2.3.</li>
		<li>Fotorezystor wyprać na twardo w piekarniku przez 3 godziny w temperaturze 150 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie elektrod wspomagane plazmą.
	<ol>
		<li>Aby usunąć pozostałości fotorezystu, użyj plazmy tlenowej ze standardową jednostką plazmy. Uruchom program czyszczenia, używając mocy 200 W o niskiej częstotliwości z przepływem 100%O2, szybkością 250 sccm i łącznym czasem 3 minut.</li>
		<li>Umieść płytkę PI w komorze plazmowej, przymocuj płytkę do uziemionej płytki za pomocą szklanych pokrywek i rozpocznij proces plazmowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie srebra i chlorku srebra: Tworzenie wbudowanej elektrody referencyjnej.
	<ol>
		<li>Pasywować platynowe podkładki kontaktowe płytki wafla za pomocą taśmy samoprzylepnej wrażliwej na promieniowanie UV. Pokrój folię na paski o szerokości 5 mm i długości 11 cm i przymocuj je do wafla, chroniąc części, które nie mają być osadzone srebrem.</li>
		<li>W celu osadzenia srebra należy umieścić kąpiel soniczną (35 kHz) w dygestorium i włożyć do kąpieli pojemnik z roztworem elektrolitu srebra (100 g/L Ag, pH 12,5). Ustaw kąpiel soniczną na temperaturę pokojową, a moc na 10%. 
		Uwaga: Roztwory elektrolitu srebra są wysoce toksyczne i należy obchodzić się z nimi z najwyższą ostrożnością. Oparów nigdy nie należy wdychać.</li>
		<li>Podłącz styk masowy elektrod odniesienia do źródła prądu stałego. Podłącz przeciwelektrodę, srebrny drut, który jest zanurzony w roztworze elektrolitu srebra, do źródła prądu za pomocą standardowych połączeniowych.</li>
		<li>Ustaw źródło prądu na prąd stały i na gęstość prądu -4,5 mA/cm2, co daje szybkość osadzania srebra około 0,3 μm/min. Uruchom kąpiel soniczną i pozwól źródłu prądu pracować przez 10 minut. Opłucz wafel wodą DI</li>
		<li>W celu chlorowania elektrody referencyjnej należy włożyć do łaźni sonicznej naczynie z 0,1 M roztworem chlorku potasu (KCl). Połącz styk masowy płytki i elektrodę platynową zanurzoną w roztworze KCl ze źródłem prądu stałego.</li>
		<li>Ustaw źródło prądu na prąd stały i na gęstość prądu +0,6 mA/cm2, co daje szybkość osadzania około 0,075 μm/min. Uruchom kąpiel soniczną i pozwól źródłu prądu pracować przez 7,5 minuty.</li>
		<li>Opłucz i osusz płytkę PI, jak opisano w kroku 1.2.3.</li>
		<li>Usuń taśmę wrażliwą na promieniowanie UV po ekspozycji na promieniowanie UV (365 nm) 300 mJ/cm2, a następnie spłucz i wysusz płytkę PI, ponownie zgodnie z opisem w kroku 1.2.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzeci etap fotolitografii: Wykorzystanie DFR do tworzenia kanałów mikroprzepływowych.
	<ol>
		<li>Przytnij potrzebne warstwy DFR do rozmiaru zbliżonego do wafla (20 x 20 cm2). Zamocuj żądaną maskę na jednostce ekspozycji i wyrównaj warstwę DFR na masce gołym okiem. Oświetl rezystor światłem UV o mocy 250 mJ/cm2 (365 nm).</li>
		<li>Usunąć folię ochronną fotorezystu i rozwijać rezystor przez około 2 minuty (w zależności od struktury) w 1% roztworze węglanu sodu (Na2CO3 ) przy użyciu standardowej łaźni sonicznej (35 kHz) podgrzanej do 42 °C i mocy dźwiękowej 100%. Aby natychmiast zatrzymać reakcję, potrząsaj rezystantem przez 1 minutę w 1% kąpieli HCl na wytrząsarce orbitalnej. Spłucz i wysusz każdą warstwę DFR, jak opisano w kroku 1.2.3. 
		UWAGA: W sumie należy przetworzyć cztery warstwy DFR, jak wspomniano w kroku 1.7: jedną warstwę kanału, jedną warstwę wierzchnią i dwie warstwy tylne (zapobiegające wyginaniu się biosensora na końcu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laminowanie warstw DFR na podłożu PI.
	<ol>
		<li>Umieść wafel PI na przezroczystej folii górnej i przymocuj go za pomocą standardowej taśmy klejącej. Wyreguluj warstwę kanałową DFR na płytce PI pod mikroskopem, używając odpowiednich struktur wyrównujących.</li>
		<li>Do laminowania należy użyć standardowego laminatora do gorących rolek i podgrzać górną rolkę do 100 °C, a dolną rolkę do 60 °C. Ustaw ciśnienie na 3 bary, z prędkością jazdy do przodu 0,3 m/min. Umieść wafel z utrwaloną warstwą DFR na środku laminatora i uruchom go; DFR jest przepychany przez laminator. Powtórz krok po obróceniu wafla o 180°.</li>
		<li>Aby zapobiec wyginaniu się bioczujnika, należy zalaminować dwie rozwinięte tylne warstwy na płytce, wykonując czynności 1.8.1-1.8.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowanie hydrofobowej bariery zatrzymującej i uszczelnienie chipa.
	<ol>
		<li>Usuń warstwę ochronną z przedniej strony warstwy kanału DFR, umieszczając standardową taśmę samoprzylepną na jednym końcu DFR i pociągając ją do góry. Użyj dozownika ręcznego z probówkami 0,004 cala, aby dozować małe kropelki rozpuszczonego politetrafluoroetylenu do dołków warstwy izolacyjnej. Aby uszczelnić chip mikroprzepływowy, przyłóż warstwę DFR pokrywy do warstwy kanału, jak opisano w kroku 1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pieczenie na twardo biosensora mikroprzepływowego.
	<ol>
		<li>Usuń wszystkie folie ochronne z okładki i tylnych warstw DFR. Pokrój biosensory na paski za pomocą zwykłych nożyczek. Frytki utwardzamy w piekarniku w temperaturze 160 °C przez 3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedura immobilizacji testu na chipie
<ol>
	<li>Adsorpcja awidyny w obszarze unieruchomienia kanału.
	<ol>
		<li>Przygotować 100 μg/ml roztworu awidyny w 10 mM roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4.</li>
		<li>Dozować 2 μl roztworu awidyny na wlot biosensora. 
		UWAGA: Kanał jest wypełniany siłami kapilarnymi, aż płyn dotrze do hydrofobowej bariery zatrzymującej.</li>
		<li>Aby upewnić się, że płyn zatrzymuje się na barierze przez cały czas inkubacji, należy dozować 2 μl wody DI na wylot chipa. Inkubować wióry w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę w zamkniętym pojemniku.</li>
		<li>Usuń nadmiar odczynników przez wlot chipa, stosując próżnię. Przemyć kanał 50 μl buforu płuczącego (PBS z 0,05% Tween 20), dozowanego na wylot podczas stosowania próżni. Suszyć kanał przez 30 sekund podczas stosowania próżni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie powierzchni kanału w celu zahamowania niespecyficznego wiązania.
	<ol>
		<li>Przygotować 1% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 10 mM PBS o pH 7,4.</li>
		<li>Odmierzyć pipetą 2 μl 1% roztworu BSA na wlocie i 2 μl wody DI na wylocie kanału. Inkubować wióry w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę w zamkniętym pojemniku. Usuń nadmiar odczynników i osusz kanał zgodnie z opisem w kroku 2.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja oligonukleotydów DNA znakowanych biotyną i 6-FAM.
	<ol>
		<li>Przygotować roztworu DNA o różnych stężeniach (0,001-5 μM) w 10 mM PBS przy pH 7,4.</li>
		<li>Dozować 2 μl jednego stężenia roztworu DNA na wlocie i 2 μl wody demineralizowanej na wylot. Inkubować chip w temperaturze 25 °C przez 15 minut w zamkniętym pojemniku.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.3.2 dla pozostałych stężeń DNA, używając dodatkowych chipów biosensorów.</li>
		<li>Usuń nadmiar odczynników i osusz kanał zgodnie z opisem w kroku 2.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchomienie przeciwciał 6-FAM znakowanych GOx.
	<ol>
		<li>Sformułować stężenie 5 μg/ml przeciwciał 6-FAM w 10 mM PBS przy pH 7,4.</li>
		<li>Wprowadzić 2 μl roztworu przeciwciała do wlotu i 2 μl wody DI do wylotu kanału. Inkubować znakowane przeciwciała w temperaturze 25 °C przez 15 minut w zamkniętym pojemniku. Usunąć nadmiar odczynników, jak opisano w kroku 2.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Detekcja sygnału amperometrycznego przy użyciu techniki stop-flow
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu substratu do detekcji elektrochemicznej.
	<ol>
		<li>Sformułuj 40-mM roztwór glukozy w 0,1 M PBS przy pH 7,4 w ultraczystej wodzie.</li>
		<li>Do wstępnej obróbki należy przygotować 0,1 M roztwór PBS o pH 7,4 w ultraczystej wodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępna obróbka elektrod roboczych.
	<ol>
		<li>Użyj specjalnie wykonanego uchwytu na wióry, aby umożliwić łatwe umieszczenie chipa oraz połączenie hydrauliczne i elektryczne.</li>
		<li>Podłącz elektrycznie biosensor do potencjostatu. Zapewnić kontakt płynny kanału mikroprzepływowego z pompą strzykawkową i zbiornikiem odczynnika za pomocą specjalnie wykonanego adaptera i rurek. Uruchom laptopa, który jest podłączony do potencjostatu i uruchom sterownik pompy strzykawkowej, kontrolując przepływ płynu przez chip.</li>
		<li>Uruchomić pompę strzykawkową ręcznie z 0,1 M PBS przy natężeniu przepływu 20 μl/min. Na elektrodzie roboczej w porównaniu z wbudowaną elektrodą odniesienia przyłóż napięcie przemienne 0,8 i -0,05 V przez 5 s przez 30 cykli. Następnie utlenić elektrodę roboczą, przykładając napięcie 0,8 V przez 60 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczyt testu przy użyciu techniki stop-flow.
	<ol>
		<li>Aby rozpocząć odczyt sygnału testowego, poczekaj, aż mierzony sygnał prądu ustabilizuje się. Zatrzymać pompę strzykawkową i zmienić odczynnik z 0,1 M PBS na 40-mM roztwór glukozy i uruchomić oprogramowanie w sterowniku pompy strzykawkowej; Spowoduje to automatyczne zatrzymanie przepływu na 1, 2 lub 5 minut, a następnie ponowne uruchomienie przepływu. Obserwuj wynikowy prąd szczytowy. 
		UWAGA: Do analizy danych można wziąć pod uwagę zarówno aktualny pik, jak i ładunek piku, zgodnie z opisem w modelu odczytu sygnału elektrochemicznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Spindel, S., Sapsford, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optical+detection+platforms+for+multiplexed+detection+of+proteins+and+the+need+for+point-of-care+biosensors+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use.</a> Sensors (Basel). 14 (12), 22313-22341 (2014).</li>
<li>Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+analytical+techniques%2C+organizational+concepts+for+application+and+future+perspectives+of+point-of-care+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing.</a> Biotechnol Adv. 34 (3), 139-160 (2016).</li>
<li>Gauglitz, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25014344">Point-of-Care Platforms.</a> Annu Rev Anal Chem. 7 (1), 297-315 (2014).</li>
<li>Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931714004316">Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies.</a> Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).</li>
<li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442 (7101), 412-418 (2006).</li>
<li>Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+diagnostics+for+global+health%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Pulse%22%5BJournal%5D)">Perspective on diagnostics for global health.</a> IEEE Pulse. 2 (6), 40-50 (2011).</li>
<li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+diagnostics+for+global+health%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).</li>
<li>Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+point-of-care+testing+-+xPOCT%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed point-of-care testing - xPOCT.</a> Trends Biotechnol. 35, (2017).</li>
<li>Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400513012057">A disposable dry film photoresist-based microcapillary immunosensor chip for rapid detection of Epstein-Barr virus infection.</a> Sens Actuators B Chem. 191, 813-820 (2014).</li>
<li>Method for the fabrication of a &#34;lab on chip&#34; from photoresist material for medical diagnostic applications. US patent. , 7,691,623 (2010).</li>
<li>Kling, A., Dincer, C., Armbrecht, L., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1877705815024571">Electrochemical microfluidic platform for simultaneous multi-analyte detection.</a> Procedia Eng. 120, 916-919 (2015).</li>
<li>Armbrecht, L., Dincer, C., Kling, A., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+magnetic+bead+chains+for+sensitivity+enhancement+of+microfluidic+electrochemical+biosensor+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Self-assembled magnetic bead chains for sensitivity enhancement of microfluidic electrochemical biosensor platforms.</a> Lab Chip. 15, 4314-4321 (2015).</li>
<li>Dincer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designed+miniaturization+of+microfluidic+biosensor+platforms+using+the+stop-flow+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique.</a> Analyst. 141, 6073-6079 (2016).</li>
<li>Weltin, A., Kieninger, J., Enderle, B., Gellner, A. K., Fritsch, B., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based%2C+flexible+glutamate+and+lactate+microsensors+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications.</a> Biosens Bioelectron. 61, 192-199 (2014).</li>
<li>Kling, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multianalyte+Antibiotic+Detection+on+an+Electrochemical+Microfluidic+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multianalyte Antibiotic Detection on an Electrochemical Microfluidic Platform.</a> Anal Chem. 88 (20), 10036-10043 (2016).</li>
<li>Bruch, R., et al. Clinical on-site monitoring of ß-lactam antibiotics for a personalized antibiotherapy. Sci Rep. , (2017).</li>
<li>Horak, J., Dincer, C., Qelibari, E., Bakirci, H., Urban, G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400514015482">Polymer-modified microfluidic immunochip for enhanced electrochemical detection of troponin i.</a> Sens Actuators B Chem. 209, 478-485 (2015).</li>
<li>Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive%2C+rapid+and+quantitative+detection+of+substance+P+in+serum+samples+using+an+integrated+microfluidic+immunochip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Sensitive, rapid and quantitative detection of substance P in serum samples using an integrated microfluidic immunochip.</a> Biosens Bioelectron. 58, 186-192 (2014).</li>
<li>Mattox, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattox%2C+DM+%22Handbook+of+Physical+Vapor+Deposition+%28PVD%29+Processing%22">Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing</a>. , Elsevier Inc. (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół wytwarzania mikroprzepływowego bioczujnika elektrochemicznego umożliwia opracowanie taniej, kompaktowej i łatwej w użyciu platformy do wykrywania biomolekuł. W zależności od testu zastosowanego później w bioczujniku, można wykryć kilka różnych biomarkerów. To sprawia, że platforma jest bardzo uniwersalna i zapewnia szeroki dostęp do różnych obszarów zastosowań, od standardowych testów diagnostycznych (np. określających obecność określonych chorób w gabinecie lekarskim) po aplikacje p...

W ciągu ostatnich dwóch dekad aplikacje diagnostyczne stały się podstawą do dogłębnych badań nad rozwojem globalnego zdrowia publicznego. Tradycyjnie do wykrywania chorób stosuje się laboratoryjne narzędzia diagnostyczne. Mimo że nadal odgrywają kluczową rolę w diagnostyce chorób, badania przyłóżkowe (POCT) wykonywane w pobliżu pacjenta lub przez samego pacjenta stają się w ostatnich latach coraz bardziej powszechne. Szczególnie w przypadkach wymagających natychmiastowego leczenia, takich jak ostry zawał mięśnia sercowego lub monitorowanie cukrzycy, niezbędne jest szybkie potwierdzenie objawów klinicznych. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na urządzenia POCT, które mogą być obsługiwane przez osoby niebędące ekspertami i które są jednocześnie zdolne do wykonywania precyzyjnych testów diagnostycznych in vitro w krótkim czasie1,2,3,4.
Niezwykła poprawa została już osiągnięta w dziedzinie POCT. Jednak wciąż jest wiele wyzwań do pokonania5,6,7,8. Aby platforma POCT została z powodzeniem wprowadzona na rynek i była konkurencyjna w stosunku do diagnostyki laboratoryjnej, urządzenie musi ściśle spełniać następujące wymagania: (i) dostarczać precyzyjne i ilościowe wyniki testów, które są zgodne z wynikami badań laboratoryjnych; (ii) mają krótki czas od pobrania próbki do uzyskania wyniku, co umożliwia natychmiastowe leczenie pacjenta; (iii) charakteryzują się nieskomplikowaną i łatwą obsługą, nawet gdy są obsługiwane przez nieprzeszkolone osoby, i wymagają zminimalizowanej interwencji użytkownika; oraz (iv) składają się z niedrogiego modułu czujnika przeznaczonego do zastosowań jednorazowych. Co więcej, diagnostyka bez użycia sprzętu jest korzystna, głównie w środowiskach o ograniczonych zasobach3,4,6.
Ze względu na te surowe wymagania, do tej pory udało się wprowadzić na rynek tylko dwa systemy POCT oparte na detekcji elektrochemicznej (np. paski testowe do pomiaru stężenia glukozy we krwi) i testach immunologicznych z przepływem bocznym (np. domowe testy ciążowe). Jednak oba systemy mają wady, takie jak słaba wydajność (tj. monitorowanie stężenia glukozy we krwi ma niedokładne wyniki testów, a testy przepływu bocznego dostarczają tylko jakościowych (pozytywnych lub negatywnych) wyników pomiarów)4,6. Te wady konwencjonalnych systemów POCT doprowadziły do rosnącego zapotrzebowania na odkrywanie nowych technologii, które oferują szybkie, tanie i ilościowe wykrywanie w miejscu opieki4,5.
Aby sprostać tym wyzwaniom stojącym przed urządzeniami POCT, technologia DFR została ostatnio wykorzystana do produkcji jednorazowych i tanich biosensorów9,10,11,12,13,14. W porównaniu z miękkimi i płynnymi materiałami litograficznymi, takimi jak PDMS czy SU-8, DFR mają wiele zalet: (i) są dostępne w różnych składach i grubościach (od kilku mikronów do kilku milimetrów); (ii) mają bardzo chropowatą powierzchnię, co ułatwia przyleganie do różnych materiałów; (iii) charakteryzują się doskonałą jednorodnością grubości; (iv) oferować tanią, łatwą i wysokowydajną produkcję do masowej produkcji; (v) są łatwe do cięcia za pomocą różnych tanich narzędzi, takich jak zwykła para nożyczek; oraz (vi) umożliwiają tworzenie trójwymiarowych struktur, takich jak kanały mikroprzepływowe, poprzez układanie wielu warstw DFR jedna na drugiej.
Z drugiej strony, DFR-y mają stosunkowo słabą rozdzielczość w porównaniu do płynnych fotorezystorów, co jest głównie spowodowane grubością warstwy i zwiększoną odległością między maską a DFR ze względu na folię ochronną, która dodatkowo umożliwia rozpraszanie światła. Mimo to, do produkcji zintegrowanych bioczujników mikroprzepływowych, DFR doskonale nadają się do taniej produkcji masowej.
Dlatego prezentujemy w tej pracy produkcję i zastosowanie elektrochemicznego biosensora mikroprzepływowego opartego na DFR. Szczegółowy protokół opisuje każdy etap produkcji platformy biosensorów, immobilizację na chipie testu modelowego opartego na DNA oraz jego odczyt elektrochemiczny przy użyciu techniki stop-flow. Ta uniwersalna platforma umożliwia wykrywanie wielu rodzajów biomolekuł przy użyciu różnych technologii oznaczania (np. genomiki, celomiki i proteomiki) lub formatów testów (np. konkurencyjnych, kanapkowych lub bezpośrednich). Opierając się na takiej platformie DFR, nasza grupa wcześniej z powodzeniem zademonstrowała szybką i czułą kwantyfikację różnych analitów, w tym antybiotyków13,15,16 (antybiotyki tetracyklinowe, prystynamycynowe i ß-laktamowe), troponina I17 i substancja P18.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiał</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>AP8525R</td><td>Używany jako podłoże poliimidowe</td></tr><tr><td>MA-N 1420</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MA-N1420</td><td>Lift-off reit w celu zdefiniowania osadzenia platyny</td></tr><tr><td>MA-D 533s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaD533S</td><td>Wywoływacz dla MA-N1420</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>-</td><td>-</td><td>Materiał elektrody i podkładki kontaktowej</td></tr><tr><td>Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>Remover dla MA-N1420</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>Fotorezystor do określenia obszaru elektrody i jako izolacja</td></tr><tr><td>Octan 1-metoksy-2-propanolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>Wywoływacz dla SU-8 3005</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>Usunięcie wywoływacza SU-8</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td>Taśma samoprzylepna <td>1020R</td><td>wrażliwa na promieniowanie UV do ochrony podkładek kontaktowych</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>Do osadzania srebra na elektrodzie referencyjnej</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>Do chlorowania srebrnej elektrody referencyjnej</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>Fotorezystuł z suchą powłoką</td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Wywoływacz dla Pyralux PC1025</td></tr><tr><td>Chlorowodór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>Na szczycie rozwoju DFR</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>Do stosowania bariery zatrzymującej</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega Electronics-Bubble</td><td></td> <td>wytrawiacz</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Spoiwo</td><td>9010-0018</td><td>Piekarnik</td></tr><tr><td>SPIN150</td><td></td> APT-Powlekarka <td></td><td></td></tr><tr><td>Pr&auml; zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>Płyta grzejna</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>Jednostka naświetlania</td></tr><tr><td>Tetra30-LF-PC</td><td>Diener-Plazma</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Univex 500</td><td>Leybold-Urządzenie</td><td></td> do <td>fizycznego osadzania z fazy gazowej</td></tr><tr><td>Wytrząsarka S4</td><td>ELMI-Wytrząsarka</td><td></td> <td>orbitalna</td></tr><tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>Kąpiel soniczna</td></tr><tr><td>6221 DC i AC</td><td>Keithley-Źródło</td><td></td> <td>prądu</td></tr><tr><td>HRL 350</td><td>Ozatec-Jednostka</td><td></td> <td>laminatora</td></tr><tr><td>Pióro próżniowe</td><td>EFD-Pióro</td><td></td> <td>próżniowe</td></tr></tbody></table>

elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

W ostatnich latach diagnostyka biomarkerów stała się nieodzownym narzędziem do diagnozowania chorób ludzkich, zwłaszcza do diagnostyki przyłóżkowej. Łatwa w użyciu i tania platforma czujników jest bardzo pożądana do ilościowego i szczegółowego pomiaru różnych rodzajów analitów (np. biomarkerów, hormonów i leków). Z tego powodu do produkcji prezentowanego tutaj biosensora mikroprzepływowego wykorzystano technologię fotorezystu z suchą warstwą - umożliwiającą tanią, łatwą i wysokowydajną produkcję. W zależności od zastosowanego później testu biologicznego, wszechstronna platforma jest w stanie wykrywać różne rodzaje biomolekuł. W celu wytworzenia urządzenia, elektrody platynowe są zbudowane na elastycznej folii poliimidowej (PI) w jedynym etapie procesu w pomieszczeniu czystym. Folia PI służy jako podłoże dla elektrod, które są izolowane fotorezystem na bazie żywicy epoksydowej. Kanał mikroprzepływowy jest następnie generowany przez wywoływanie i laminowanie folii fotorezystu z suchą folią (DFR) na płytce PI. Dzięki zastosowaniu hydrofobowej bariery zatrzymującej w kanale, kanał jest podzielony na dwa określone obszary: sekcję unieruchamiającą do testu enzymatycznego i elektrochemiczną komórkę pomiarową do odczytu sygnału amperometrycznego.
Immobilizacja testu biologicznego na chipie jest wykonywana przez adsorpcję biomolekuł na powierzchni kanału. Enzym oksydaza glukozowa jest używany jako przetwornik do generowania sygnału elektrochemicznego. W obecności substratu wytwarzana jest glukoza, nadtlenek wodoru, który jest wykrywany na platynowej elektrodzie roboczej. Technika stop-flow jest stosowana w celu uzyskania wzmocnienia sygnału wraz z szybką detekcją. Za pomocą wprowadzonego systemu mikroprzepływowego można mierzyć ilościowo różne biomolekuły, co wskazuje na różne rodzaje chorób lub, w odniesieniu do monitorowania terapeutycznego leków, ułatwia spersonalizowaną terapię.

Projektowanie i wykonanie platformy mikroprzepływowego biosensora:
Wytwarzanie mikrofluidycznych chipów biosensorowych odbywa się na poziomie wafla za pomocą standardowych technik fotolitograficznych z wykorzystaniem wielu warstw DFR. Ta strategia produkcji opiera się na laminowaniu wywołanych warstw DFR na podłożu PI z naniesionym wzorem z platyny, co prowadzi do utworzenia kanałów mikrofluidycznych. Krótkie podsumowanie przedstaw...

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie wszechstronnej platformy elektrochemicznego biosensora mikroprzepływowego, opartej na niskokosztowej technologii suchego fotorezystu w formie filmu, która umożliwia pomiar różnych rodzajów analitów w zależności od zastosowanego następnie immobilizowanego testu enzymatycznego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki przy łóżku pacjenta (point-of-care testing), takich jak oznaczanie ilościowe różnych leków, np. antybiotyków, czy diagnostyka różnych chorób, w tym nowotworów. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że przedstawiony tutaj biosensor opiera się głównie na niskokosztowych materiałach, jest łatwy w użyciu i wysoce wszechstronny pod względem zastosowań.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki związane z suchymi fotorezistami są trudne do opanowania, a ich obsługa wymaga znacznej ilości treningu i praktyki. Demonstrację unieruchomienia i pomiaru analizy na chipie przeprowadzi Eva Grether, asystentka studencka z mojej grupy. Na początek należy wyciąć podłoże z poliimidu (PI) w formie sześciocalowych okrągłych wafli.Następnie umieść podłoże PI w piekarnik

dry-film-photoresist-based-electrochemical-microfluidic-biosensor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Ten artykuł przedstawia oparte na impedancji urządzenie do wykrywania szybkości parowania roztworów. Oferuje wyraźne zalety w porównaniu z konwencjonalnym podejściem do odchudzania: szybka reakcja, wykrywanie o wysokiej czułości, wymóg małej próbki, wielokrotne pomiary próbek i łatwy demontaż w celu czyszczenia i ponownego użycia.

Wysokowydajna platforma oparta na impedancji do wykrywania szybkości parowania

Szczegółowo opisujemy metodę wytwarzania trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych opartych na papierze do wykorzystania w rozwoju testów immunologicznych. Nasze podejście do montażu urządzeń to rodzaj wielowarstwowej, addytywnej produkcji. Demonstrujemy test immunologiczny typu sandwich, aby zapewnić reprezentatywne wyniki dla tego typu urządzeń opartych na papierze.

Wytwarzanie trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Ta publikacja opisuje produkcję urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego oznaczania oporu elektrycznego przezśródbłonka (TEER). W celu walidacji bariera krew-mózg została naśladowana wewnątrz tego urządzenia mikroprzepływowego i monitorowano jego funkcję bariery. Przedstawione metody integracji elektrod i bezpośredniego oznaczania ilościowego TEER mają ogólne zastosowanie.

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Poznaj elektrochemiczną platformę biosensorów mikroprzepływowych opartą na technologii suchego filmu fotorezystu. Ta metoda umożliwia szybką i czułą detekcję analitów w diagnostyce point-of-care.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu (Wideo) | JoVE Journal

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Przeglądaj więcej filmów