Name: Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Poznaj metodę adresowalnych mikromacierzy kropelkowych do zliczania białek w pojedynczych komórkach. Technika ta pozwala określić bezwzględną liczbę kopii białka p53 w liniach komórkowych nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ASR zaprojektował eksperymenty, opracował protokoły i przeanalizował dane. SC i PS przeprowadziły eksperymenty dotyczące wielkości komórek. ASR i OC napisali rękopis. Autorzy pragną wyrazić wdzięczność za wsparcie prof. Davida R. Kluga w udostępnieniu sprzętu. Autorzy pragną podziękować Imperial College Advanced Hackspace za dostęp do zakładów produkcyjnych i prototypowych.

<ol><li>Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single+cell+and+single+molecule+proteomics+for+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).</li>
<li>Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+tools+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis tools for drug discovery and development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+step+towards+practical+single+cell+proteomics%3A+a+microfluidic+antibody+capture+chip+with+TIRF+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection.</a> Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressable+droplet+microarrays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis.</a> Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).</li>
<li>Ramji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+kinase+signaling+assay+using+pinched+flow+coupled+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (3), 34104(2014).</li>
<li>He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+encapsulation+of+single+cells+and+subcellular+organelles+into+picoliter-+and+femtoliter-volume+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets.</a> Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).</li>
<li>Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+TIRF+microscopy+to+quantify+and+confirm+efficient+mass+transfer+at+the+substrate+surface+of+the+chemistrode%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode.</a> New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+picoliter+droplet+array+for+parallel+real-time+polymerase+chain+reaction+based+on+double-inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing.</a> Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).</li>
<li>Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floating+droplet+array%3A+An+ultrahigh-throughput+device+for+droplet+trapping%2C+real-time+analysis+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery.</a> Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).</li>
<li>Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Karthikeyan_Narayanan2/publication/257690809_Elucidating_drug_resistance_properties_in_scarce_cancer_stem_cells_using_droplet_microarray/links/554ac2700cf29752ee7c3360.pdf">Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray.</a> Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).</li>
<li>Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlelanding/2016/ra/c6ra06011k">Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings.</a> RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+nanoinjection+for+high-thoughput+chemiluminescence+immunoassay+on+multicapillary+glass+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate.</a> Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).</li>
<li>Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+protein+crystallization+and+screening+with+a+microfluidic+droplet+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot.</a> Sci. Rep. 4, 5046(2014).</li>
<li>Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-in-oil+array+for+picoliter-scale+analysis+based+on+sequential+inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing.</a> Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).</li>
<li>Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22One+cell-one+well%22%3A+A+new+approach+to+inkjet+printing+single+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">"One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays.</a> ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).</li>
<li>Yusof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-like+printing+of+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+a+Chip+-+Miniaturisation+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inkjet-like printing of single-cells.</a> Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).</li>
<li>Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+2-dimentional+droplet+array+for+single-cell+reverse+transcription+quantitative+PCR+assay+with+a+microfluidic+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot.</a> Sci. Rep. 5, 9551(2015).</li>
<li>Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23114283">Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications.</a> Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).</li>
<li>Kozak, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-volume+wall-less+immunoassays+using+patterned+planar+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates.</a> Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2072-666X/2/2/179/htm">Microvalves and Micropumps for BioMEMS.</a> Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).</li>
<li>Lai, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+use+of+laser-based+lysis+for+cell+analysis+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+advantages+and+constraints+in+miniaturized+capture+assays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis.</a> Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).</li>
<li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+single-cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Current techniques for single-cell lysis.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).</li>
<li>Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+effects+on+enzyme+activity+and+solubilization+of+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes.</a> BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).</li>
<li>Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/microfluidic-single-mammalian-cell-lysis-in-picolitre-droplets-2155-6210.S12-001.php?aid=14625">Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets.</a> J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).</li>
<li>Burgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+protein+copy+number+using+a+single-molecule-sensitive+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray.</a> Analyst. 139 (13), 3235(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Adresowalne mikromacierze kropelkowe to czuła i rozszerzalna metoda ilościowego określania bezwzględnej liczby kopii białka w pojedynczej komórce.
Ograniczenie poziomu wiązania nieswoistego (NSB) ma kluczowe znaczenie w protokole dla osiągnięcia jak najniższego limitu wykrywalności. Białka i inne związki biochemiczne mogą niespecyficznie wiązać się z wieloma interfejsami obecnymi w kropelkach - powierzchnią szkiełka nakrywkowego, plamką przeciwciała i granicą faz olej/woda. Białka mogą zostać ...

Celem tej metody jest określenie zmienności obfitości docelowego białka w populacji komórek z rozdzielczością pojedynczej komórki. Analiza pojedynczych komórek zapewnia szereg korzyści, które nie są dostępne w przypadku tradycyjnych metod biochemicznych opartych na zespołach. 1,2,3,4,5 Po pierwsze, praca na poziomie pojedynczej komórki może uchwycić bogatą heterogeniczność populacji komórek, która w przeciwnym razie zostałaby utracona przez uśrednianie, które ma miejsce przy użyciu tradycyjnych technik biochemicznych. Większość metod biochemicznych typu "koń roboczy" działa z masą, wymagając, jak to często bywa, milionów komórek do wytworzenia wyniku. Oczywiście, konsekwencje oceny całych populacji komórek zależą od wielu czynników, na przykład niejednorodności ekspresji białek, gdzie niektóre ważne cechy rozkładu obfitości białek mogą zostać pominięte. Z praktycznego punktu widzenia czułość wymagana od technik jednokomórkowych sprawia, że są one zdolne do pracy z ilością materiału biologicznego, która jest niewystarczająca do działania nawet bardziej czułych technik masowych. Kluczowym tego przykładem jest badanie rzadkich typów komórek, takich jak krążące komórki nowotworowe (CTC), gdzie nawet u pacjentów ze złymi rokowaniami może być mniej niż 10 CTC w jednym pobraniu krwi o objętości 7,5 ml. 6 Tutaj prezentujemy metodologię wymaganą do wykonania pomiarów białek jednokomórkowych za pomocą testu opartego na przeciwciałach o zmniejszonej objętości, wykorzystującego kropelki pokryte olejem wydrukowane na mikromatrycy przeciwciał.
Platformy kropelkowe mikroprzepływowe są o wysokiej przepustowości, są w stanie generować tysiące kropel na sekundę i są zdolne do izolowania, a nawet hodowli, pojedynczych komórek w pojedynczych kropelkach w celu przeprowadzenia szerokiej gamy testów biochemicznych. Techniki oparte na kropelkach dobrze nadają się do analizy pojedynczych komórek,7,8,9 z godnymi uwagi niedawnymi przykładami, takimi jak DropSeq10 i inDrop11, które zostały znacznie wspomagane przez moc technik amplifikacji. Ograniczona ilość materiału i brak metod amplifikacji białek sprawiają, że proteomika pojedynczych komórek jest szczególnie trudna.
Kropelki mogą być analizowane wieloma metodami, a mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana. Techniki jednocząsteczkowe, takie jak mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), umożliwiają wizualizację cząsteczek fluorescencyjnych z niezrównanym stosunkiem sygnału do szumu. 12 Ze względu na wykładniczy rozpad pola ulotnego, tylko fluorofory znajdujące się w dużej odległości od powierzchni (rzędu 100nm) są wzbudzane, co sprawia, że TIRF jest dobrą strategią w wykrywaniu małych ilości cząsteczki docelowej w złożonej mieszaninie. Naturalna wytrzymałość przekroju optycznego TIRF pomaga również uniknąć etapów mycia oraz ogranicza czas i złożoność testu. Jednak TIRF wymaga płaskich powierzchni, a przykłady mikroskopii TIRF zastosowanej do kropel w przepływie obejmują tworzenie płaskiej powierzchni, którą należy zobrazować. 13 W tym celu, techniki proteomiczne pojedynczych komórek często projektują mikroprzepływowe chipy wokół unieruchomionych powierzchniowo agentów wychwytujących w formacie mikromacierzy. 4,14
Kropelki same w sobie mogą być formowane w tablice na płaskich powierzchniach, tak zwane mikrotablice kropelkowe. 15,16,17 Przestrzenne organizowanie kropel w tablice pozwala na ich wygodne indeksowanie, łatwe monitorowanie w czasie, indywidualne adresowanie i, w razie potrzeby, pobieranie. Mikromacierze kropelkowe mogą osiągnąć wysoką gęstość mikroreaktorów z tysiącami elementów na chip, które są albo wolnostojące, albo wsparte na strukturach mikrostudzienkowych. 18,19,20 Mogą być tworzone przez sekwencyjne osadzanie przez roboty obsługujące ciecze, skanery atramentowe, mikromacierze kontaktowe21,22,23,24,25,26 Mogą też samoorganizować się na powierzchniach, takich jak superhydrofilowe plamy wzorowane na powierzchni superhydrofobowej. 27,28,29
Mając na uwadze te rozważania, zaprojektowano Adresowalne Mikromacierze Kropelkowe (ADM), aby połączyć wszechstronność, adresowalność przestrzenną i zmniejszone objętości mikromacierzy kropel z czułością mikroskopii TIRF pojedynczej cząsteczki do ilościowego pomiaru obfitości białek. 5 ADM-ów umożliwia analizę pojedynczych komórek, tworząc mikromatrycę kropelkową zawierającą pojedyncze komórki nad mikromatrycą przeciwciał, która jest następnie pokrywana olejem, aby zapobiec parowaniu. Objętości kropel są dyskretne, aby zapobiec utracie próbki, która w przeciwnym razie zostałaby osiągnięta przez zawory wbudowane w mikroprzepływy w przepływie ciągłym. 30 Bezwzględna ilość docelowego białka z pojedynczej komórki jest bardzo mała; Jednak zmniejszona objętość kropelek pozwala na stosunkowo wysokie stężenie miejscowe, aby można je było wykryć za pomocą testu przeciwciał typu sandwich - przeciwciało jest unieruchomione w odrębnym regionie lub miejscu na powierzchni, która wychwytuje białko, które z kolei wiąże się z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem detekcyjnym obecnym w objętości kropli. Jako podejście bezznacznikowe (tj. cele białkowe nie muszą być znakowane bezpośrednio), ADM są ogólnie stosowane do analizy komórek ze źródeł pierwotnych, takich jak przetworzona krew, aspiraty drobnoziarniste i zdysocjowane biopsje guza, a także komórki z hodowli i ich lizaty.
Pomiar zmienności obfitości białek w populacji komórek jest ważny w określaniu niejednorodności w odpowiedzi, na przykład, na lek i pomoże w dostarczeniu wglądu w funkcje i szlaki komórkowe, ocenie subpopulacji i ich zachowania, a także w identyfikacji rzadkich zdarzeń, które w przeciwnym razie zostałyby zamaskowane metodami masowymi. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wytwarzać i wykorzystywać adresowalne mikromacierze kropelkowe do ilościowego określania obfitości czynnika transkrypcyjnego p53 w ludzkich komórkach nowotworowych i może być wykorzystany do zbadania roli p53 w odpowiedzi na leki chemioterapeutyczne. Białko docelowe jest określane przez wybór przeciwciał wychwytujących i wykrywających i może być modyfikowane tak, aby zawierało więcej lub różne cele. Podano instrukcję, jak zbudować proste urządzenie zawierające koncentryczną dyszę z ogólnych materiałów eksploatacyjnych laboratoryjnych do ręcznego układania kropelek o pojemności 10 nl zakrytych olejem. Opisano pełny proces eksperymentalny, w którym każda kropla jest następnie ładowana pojedynczą komórką, która jest następnie poddawana lizie, a ekspresja białka określana z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii TIRF.

<table><tbody><tr><td>Hodowla komórkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej sile glukozy</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Kolby</td> do hodowli komórkowych Biochrom <td>S0115</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, Wielka Brytania</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Microcontact pin</td><td>ArrayIt, USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (Nexterion)</td><td>Schott, Europa</td><td>1098523</td><td>Rozmiar (mm): 65.0 x 25.0; Grubość (mm) 0,17</td></tr><tr><td>przeciwciało wychwytujące p53</td><td>Przeciwciało wykrywające Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53, Alexa Fluor 488 oznaczone</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>stężenie zapasowe 200&mu; g/ml</td></tr><tr><td>Bufor solno-cytrynianu sodu</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>384 dołek (mała objętość)</td><td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>Butla gazowa z azotem</td><td>BOC</td><td>Klasa przemysłowa, beztlenowa</td><td></td></tr><tr><td><silna>Nazwa</mocny></td><td>Firma<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Kropelki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny mikrowtryskiwacz</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Origio, Dania</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Strzykawka L</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>Gazoszczelna, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>Gazoszczelna, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Izolator silikonowy</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0,5</td><td>6x4 well izolator silikonowy z klejem</td></tr><tr><td>Wycinarka laserowa</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td><td>do laserowego cięcia niestandardowych izolatorów</td></tr><tr><td>Arkusz</td> <td>akrylowy o grubości 1mmWeatherall-UK</td><td>Clarex Precision Sheet 001</td><td>do cięcia laserowego niestandardowych izolatorów</td></tr><tr><td>Arkusz samoprzylepny</td><td>3M</td><td></td><td>służy do przyklejania niestandardowych izolatorów do mikromacierzowanych szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Super klej</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; m ID/360 &mu; m Rurka z topionej krzemionki o średnicy zewnętrznej</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16" Rurki OD PFA</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0,014" Identyfikator/0,062" Rurka PTFE OD</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/2,0 mm OD FEP rurka</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Białko surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda</td><td>Millipore, Niemcy</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td> Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Mikroskopia i Optyka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop TIRF z kodowanym stolikiem XY</td><td>Nikon, Japonia</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, Irlandia</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>Źródło wzbudzenia laserowego</td><td>Vortran, USA</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Optyczne źródło lasera do lizy</td><td>Continuum, USA</td><td>Mikroskop Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td> kostka filtra do TIRF</td><td>Chroma, USA</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtra mikroskopowego do optycznego lasera lizycznego</td><td>2000, Wielka Brytania</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>Open Source</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazów</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>w wersji 7.14 lub nowszej</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr></tbody></table>

zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Często zachowanie komórek i odpowiedzi komórkowe są analizowane na poziomie populacji, gdzie odpowiedzi wielu komórek są sumowane razem jako średni wynik, maskujący bogate zachowanie pojedynczej komórki w złożonej populacji. Technologie wykrywania i kwantyfikacji białek jednokomórkowych wywarły w ostatnich latach niezwykły wpływ. W tym artykule opisujemy praktyczną i elastyczną platformę do analizy pojedynczych komórek opartą na adresowalnych mikromacierzach kropelkowych. Badanie to opisuje, w jaki sposób można zmierzyć bezwzględną liczbę kopii docelowych białek z rozdzielczością pojedynczej komórki. Supresor guza p53 jest najczęściej zmutowanym genem w ludzkim raku, przy czym ponad 50% wszystkich przypadków raka wykazuje niezdrowy wzorzec ekspresji p53. Protokół opisuje kroki tworzenia kropelek o długości 10 nL, w których izoluje się pojedyncze ludzkie komórki rakowe, a liczba kopii białka p53 jest mierzona z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki w celu precyzyjnego określenia zmienności ekspresji. Metodę tę można zastosować do dowolnego typu komórki, w tym materiału pierwotnego, w celu określenia bezwzględnej liczby kopii wszelkich białek docelowych będących przedmiotem zainteresowania.

Bezwzględną liczbę kopii białka podstawowego p53 określono z rozdzielczością pojedynczej komórki w linii komórkowej raka jelita grubego u człowieka, komórkach BE. Pokazano, jak ekspresja p53 może się różnić o kilka rzędów wielkości oraz wykazano słabo pozytywną korelację między rozmiarem komórki a liczbą kopii białka w spoczywającej populacji komórek BE.
Adresowalne mikromacierze kroplowe powstają, gdy krople wodne są dozowane w...

Tutaj prezentujemy adresowalne mikromacierze kropelkowe (ADM), metodę opartą na tablicy kropelkowej, która jest w stanie określić bezwzględną obfitość białek w pojedynczych komórkach. Wykazujemy zdolność ADM do charakteryzowania niejednorodności ekspresji białka supresorowego p53 w ludzkiej linii komórek nowotworowych.

Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest określenie absolutnej liczby kopii białka docelowego z rozdzielczością pojedynczej komórki. Techniki analizy pojedynczych komórek umożliwią lepsze zrozumienie zachowania białka w kontekście dogmatu centralnego oraz pomogą w dokładnej kwantyfikacji kontrolowanej ekspresji genów. Praca na poziomie pojedynczej komórki pozwala uchwycić bogatą heterogenność populacji komórkowej, która w przeciwnym razie zostałaby utracona w wyniku uśredniania występującego w tradycyjnych technikach biochemicznych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na czułość analiz pojedynczych komórek lub ograniczoną ilość białka w każdej komórce. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy przeprowadzić analizę białek w pojedynczych komórkach w sposób umożliwiający łatwe pobieranie próbek do dalszych analiz. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania płytek i naniesienia mikrotablic przeciwciał zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby przygotować aparat, wprowadź odcinek rurki z topionego krzemienia o długości 100 mm, średnicy wewnętrznej 150 µm i średnicy zewnętrznej 360 µm do odcinka rurki PFA o długości 40 mm, średnicy wew

counting-proteins-in-single-cells-with-addressable-droplet-microarrays

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Ogólnym celem protokołu jest przygotowanie ponad miliona uporządkowanych, jednolitych, stabilnych i biokompatybilnych kropel femtolitru na płaskim podłożu o powierzchni 1cm2, który może być użyty do syntezy białek bez komórek.

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Ta metoda określa ilościowo obfitość mikroorganizmów za pomocą formatu 96-dołkowej płytki do płytek tworzących kolonie (CFU) i jest stosowana do mikrobiomu Drosophila w próbkach homogenatu całych much. Jednostki CFU są zliczane za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu, które jest dostępne tutaj.

Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Poznaj metodę adresowalnych mikromacierzy kropelkowych do zliczania białek w pojedynczych komórkach. Technika ta pozwala określić bezwzględną liczbę kopii białka p53 w liniach komórkowych nowotworowych.

Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych

Przeglądaj więcej filmów