Name: Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Poznaj metodę kriokonserwacji jąder danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle. Technika ta umożliwia skuteczne przechowywanie komórek płciowych do badań biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodowe Biuro Badań, Rozwoju i Innowacji na Węgrzech (grant 116912 dla ÁH), biuro COST (Food and Agriculture COST Action FA1205: AQUAGAMETE), Program Stypendialny Stipendium Hungaricum (grant dla ZM) oraz New Hungarian National Excellence Predoctoral Fellowship (grant dla EK).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez węgierską ustawę o ochronie zwierząt.
1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Roztwory podstawowe
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 M trehalozy, dodając 0,378 g dwuwodnego trehalozy do 1 ml dH2O. Dobrze wymieszaj, aż całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Przygotuj 1 M sacharozy, dodając 0,342 g sacharozy do 1 ml dH2O. Dobrze wymieszaj, aż całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Przygotuj 1 M HEPES, dodając 0,238 g HEPES do 1 ml dH2O. Dobrze wymieszaj, aż całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Przygotować 20 mg/ml kolagenazy (290 j./mg), dodając 100 mg do 5 ml PBS. Dokładnie wymieszaj, aż się rozpuści. Sterylny filtr przez filtry 0,2 μm. Porcję 50 μl rozlać do probówek PCR o pojemności 0,2 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotuj 15 mg/ml trypsyny (~ 10000 U/mg), dodając 75 mg do 5 ml PBS. Dokładnie wymieszaj, aż się rozpuści. Sterylny filtr przez filtry 0,2 μm. Porcję 50 μl rozlać do probówek PCR o pojemności 0,2 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 1 mg/ml DNazy I (~ 3000 j./mg), dodając 5 mg do 5 ml PBS. Dokładnie wymieszaj, aż się rozpuści. Sterylny filtr przez filtry 0,2 μm. Porcję 50 μl rozlać do probówek PCR o pojemności 0,2 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 0,4% błękitu trypanowego, dodając 40 mg błękitu trypanowego do 10 ml PBS. Sterylny filtr przez filtry 0,2 μm. Podaniec 1 ml do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Przygotować 200 mg/l MS-222 (sulfonian metanu trikainy), dodając 200 mg MS-222 do 1 l dH2O. Dobrze wymieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia. Dodatkowo buforować roztwór MS-222 wodorowęglanem sodu do neutralnego pH 7,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory do witryfikacji
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór równoważący (ES): Przygotować 2 ml ES, mieszając 121,5 μl metanolu (MeOH; 1,5 M), 220 μl glikolu propylenowego (PG; 1,5 M), 200 μl FBS (10%), 200 μl roztworu podstawowego trehalozy (0,1 M), 50 μl roztworu podstawowego HEPES (25 mM) i 1208,5 μl L-15 w probówce o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Przygotować roztwór do witryfikacji (VS): Przygotować 2 ml VS przez zmieszanie 439 μl PG (3 M), 426 μl dimetylosulfotlenku (Me2SO; 3 M), 200 μl FBS (10%), 200 μl roztworu podstawowego trehalozy (0,1 M), 50 μl roztworu podstawowego HEPES (25 mM) i 685 μl L-15 w probówce o pojemności 2 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązania dla ocieplenia
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór rozgrzewający 1 (WS1): Przygotuj 1,5 ml WS1 w probówce o pojemności 2 ml, mieszając 150 μl FBS (10%), 450 μl roztworu podstawowego sacharozy (3 M) i 900 μl L-15.</li>
		<li>Przygotuj roztwór rozgrzewający 2 (WS2): Przygotuj 1,5 ml WS2 w probówce o pojemności 2 ml, mieszając 150 μl FBS (10%), 150 μl roztworu podstawowego sacharozy (1 M) i 1200 μl L-15.</li>
		<li>Przygotuj roztwór rozgrzewający 3 (WS3): Przygotuj 1,5 ml WS2 w probówce o pojemności 2 ml, mieszając 150 μl FBS (10%) i 1350 μl L-15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór wytrawiający: dla każdej próbki przygotować 500 μl roztworu wytrawiającego, mieszając 50 μl roztworu podstawowego kolagenazy (2 mg/ml), 50 μl roztworu podstawowego trypsyny (1,5 mg/ml), 10 μl DNazy I (20 μg/ml) i 390 μl L-15 w probówce o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Zaopatrz się w narzędzia do preparowania: nożyczki, mikronożyczki, pęsetę, zakrzywioną pęsetę i igły do akupunktury.</li>
</ol>
2. Kolekcja Testes
<ol>
	<li>Poddaj rybę eutanazji, umieszczając ją w naczyniu zawierającym 200 mg/l MS-222 (pH = 7). Przed kontynuowaniem sekcji upewnij się, że skrzela przestały się poruszać i że od tego momentu minęło co najmniej 10 minut, aby zapewnić śmierć przez niedotlenienie.</li>
	<li>Osusz rybę, poklepując ją po ręczniku papierowym i połóż na jej grzbietowej stronie na macie preparucyjnej.
	<ol>
		<li>Po pierwsze, odetnij płetwy brzuszne i piersiowe, aby ułatwić rozwarstwienie.</li>
		<li>Poziomo przeciąć skórę na brzuchu ryby między płetwami piersiowymi i przeciąć skórę i leżący pod nią mięsień wzdłuż brzucha aż do płetwy odbytowej.</li>
		<li>Otwórz jamę ciała ryby i przypnij lewą i prawą ścianę ciała do maty preparacyjnej za pomocą igieł. 
		UWAGA: Jądra znajdują się nad narządami przewodu pokarmowego po obu stronach pęcherza pływackiego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie wyjmuj narządów żołądkowo-jelitowych, ale delikatnie odepchnij je na bok i wyjmij jądro z przeciwnej strony. Jądra są połączone ze ścianą ciała, więc usuń je ostrożnie i przetnij łączącą otrzewną za pomocą mikronożyczek.</li>
	<li>Dodatkowo, aby zapobiec zanieczyszczeniu, najpierw wysterylizuj jądra, umieszczając je w 70% etanolu na 2 s, a następnie umieść je w L-15 na 96-dołkowej płytce na lodzie. 
	UWAGA: Jeśli to konieczne, oczyść jądra z tkanki tłuszczowej i dużych naczyń krwionośnych dokładnie pod mikroskopem stereoskopowym</li>
</ol>
3. Ultraszybkie chłodzenie tkanki jąder
<ol>
	<li>Oznaczyć igły odpowiednimi etykietami w zależności od rodzaju próbki i przygotować roztwory równoważące (ES) i witryfikacyjne (VS).</li>
	<li>Przenieś jądra na większą płytkę dołka lub miskę i przypnij dwa do trzech jąder (lub więcej, w zależności od wielkości igły) na sterylnej igle do akupunktury.
	<ol>
		<li>Najpierw umieść jądro na zakrzywionej pęsetze. Umieść czubek igły na środku jądra i ostrożnie pociągnij jądro do góry za pomocą pęsety.</li>
		<li>Po nakłuciu jądra delikatnie pociągnij je do góry w kierunku górnej części igły. Upewnij się, że jądra są oddzielone od siebie i że nie spadają ani nie zsuwają się w dół.</li>
		<li>Umieścić igły z przypiętymi jądrami w probówce o pojemności 2 ml wypełnionej L-15 do czasu witryfikacji (w temperaturze 25 °C; czas przechowywania nie powinien przekraczać 1 godziny). 
		UWAGA: Przypinanie jąder do igły powinno odbywać się szybko, aby zapobiec wysychaniu jąder.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść igłę z jądrami do roztworu równoważącego i inkubować przez 5 minut w temperaturze 25°C.</li>
	<li>Przenieść igłę do roztworu witryfikacyjnego i inkubować przez 30 s w temperaturze 25°C.</li>
	<li>Wyjmij igłę z roztworu do witryfikacji, szybko i delikatnie wchłonij pozostały roztwór z tkanki sterylnym ręcznikiem papierowym. Zachowaj ostrożność, aby jądra nie przykleiły się do ręcznika papierowego lub nie spadły.</li>
	<li>Szybko umieść igłę w ciekłym azocie umieszczonym w styropianowym pudełku. 
	UWAGA: Wykonaj ten krok szybko, aby uniknąć narażenia tkanek na działanie oparów ciekłego azotu. Używaj małych ilości ciekłego azotu, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu próbek.</li>
	<li>Trzymaj igłę w ciekłym azocie w zamkniętym pudełku styropianowym przez 5 - 10 minut.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić otwartą krioprobówkę o pojemności 4,5 ml i jej nakrętkę w tym samym pudełku.</li>
	<li>Po 5 - 10 minutach przenieś każdą igłę do osobnej krioprobówki pod powierzchnią ciekłego azotu i zamknij krioprobówkę. 
	Ostrzeżenie: Podczas pracy z ciekłym azotem należy zawsze używać odzieży ochronnej (takiej jak rękawice ocieplane), ponieważ narażenie może prowadzić do poważnych odmrożeń.</li>
	<li>Umieść krioprobówkę na metalowej trzcinie i umieść ją w kanistrze kriobanku tak szybko, jak to możliwe. Przechowuj próbki w kanistrze do przechowywania dewara do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
4. Procedura ocieplenia
<ol>
	<li>Ogrzej każdą igłę osobno. Wszystkie roztwory rozgrzewające powinny mieć temperaturę 25 °C.</li>
	<li>Odłącz kriorurkę od metalowej trzciny i zanurz ją w ciekłym azocie przechowywanym w styropianowym pudełku.</li>
	<li>Otwórz krioprobówkę w oparach ciekłego azotu (za pomocą kleszczy) i uwolnij igłę do ciekłego azotu.</li>
	<li>Przenieść igłę bardzo szybko do pierwszego roztworu rozgrzewającego i inkubować przez 1 minutę (w temperaturze 25 °C). Upewnij się, że igła została szybko przeniesiona, aby zapobiec jej nagrzewaniu się w powietrzu podczas przenoszenia.</li>
	<li>Przenieść igłę do drugiego roztworu rozgrzewającego i inkubować przez 3 minuty (w temperaturze 25 °C).</li>
	<li>Przenieść igłę do trzeciego roztworu rozgrzewającego i inkubować przez 5 minut (w temperaturze 25 °C).</li>
	<li>Uwolnij jądra z igły, przesuwając je w dół za pomocą zakrzywionej pęsety. Umieść każde podgrzane jądro indywidualnie w osobnym dołku (płytka 96-dołkowa) wypełnionym 250 μl L-15 uzupełnionym 10% FBS. Upewnij się, że studzienki są oznaczone zgodnie z próbką. Utrzymuj płytkę studzienki na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną ogrzane i do dalszej pracy.</li>
</ol>
5. Trawienie tkanek
<ol>
	<li>Przygotować 500 μl roztworu dysocjacyjnego dla każdej próbki w oddzielnych probówkach o pojemności 2 ml. Oznacz probówki zgodnie z kodem próbki. Przygotowany roztwór dysocjacyjny inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj podgrzaną tkankę do roztworu trawiącego i pokrój ją na małe kawałki, wykonując co najmniej 30 ruchów małymi nożyczkami.</li>
	<li>Inkubować pociętą tkankę na płytce do wytrząsania przez 90 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Zatrzymaj proces trawienia, dodając 400 μL L-15 i 100 μL FBS (10% FBS v/v). Krótko wstrząsnąć roztworem i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Otrzymany roztwór przefiltrować przez filtry 50 μm do probówki o pojemności 1,5 ml. Odpowiednio oznacz probówki.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowany roztwór o stężeniu 200 ×g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl L15 uzupełnionym 10% FBS. Ręcznie potrząsaj probówką, aż granulka całkowicie się rozpuści. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
6. Ocena żywotności i liczenie komórek
<ol>
	<li>Wymieszaj 5 μl zawiesiny komórek i 5 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego w odpowiednio oznakowanej probówce PCR o pojemności 0,2 ml. Jeśli używane są różne objętości, upewnij się, że stosunek rozcieńczenia 1:1 pozostaje.</li>
	<li>Inkubować tę zawiesinę przez 1-3 minuty w temperaturze pokojowej (25 °C).</li>
	<li>Sprawdź żywotność każdej próbki w hemocytometrze pod mikroskopem.</li>
	<li>Policz liczbę żywych komórek (niezabarwionych błękitem trypanowym) w 15 polach. Obliczyć całkowitą liczbę komórek w 20 μm zawiesiny komórek. Zawieszenie jest teraz gotowe do każdego dalszego zastosowania. 
	UWAGA: Optymalizując procedurę dla innych gatunków o większych rozmiarach ciała, należy użyć fragmentów jąder o równej wadze. Używaj testów od jednej osoby dla wszystkich grup eksperymentalnych, aby uniknąć indywidualnej zmienności wyników. W przypadku danio pręgowanego wykorzystaliśmy fakt, że lewe i prawe jądro powinno zawierać równą (lub bardzo podobną) liczbę komórek rozrodczych13 (patrz Reprezentatywne wyniki). Lewe jądro było trzymane jako kontrola, podczas gdy prawe jądro było witryfikowane/ogrzewane. Obliczono procent żywotności liczbę komórek wyizolowanych z zeszklonego/ogrzanego jądra w porównaniu z liczbą komórek wyizolowanych ze świeżego jądra.</li>
</ol>

<ol><li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research%3A+Importance%2C+impact%2C+status%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li>
<li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li>
<li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li>
<li>Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N%2CN-dimethylacetamide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li>
<li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogonial+transplantation+in+fish%3A+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+Part+D%3A+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li>
<li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li>
<li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li>
<li>Kása, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+%28Eurasian+perch%2C+Perca+fluviatilis%29+and+marine+fish+%28European+eel%2C+Anguilla+anguilla%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li>
<li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle+immersed+vitrification%3A+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124(2013).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology%2C+viability%2C+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li>
<li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+%28Brachymystax+lenok%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li>
<li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li>
<li>Lujić, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li>
<li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CryoLetters%22%5BJournal%5D)">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li>
<li>Marinović, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li>
<li>Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells%2C+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li>
<li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym celem tego badania było dostosowanie opracowanej dla gatunków ptaków i ssakówprocedury ultraszybkiego chłodzenia zanurzonej w igłach 10,11,12 do kriokonserwacji jąder ryb (danio pręgowanego jako organizmu modelowego). Większość dotychczasowych badań dotyczących kriokonserwacji zasobów genetycznych danio pręgowanego koncentrowała się przede wszystkim na kriokonserwacji plemników danio pręgowanego <...

Nowatorskie trendy w nauce i biotechnologii doprowadziły do stworzenia tysięcy nowych linii mutantów myszy, Drosophila, danio pręgowanego i innych gatunków wykorzystywanych jako organizmy modelowe w naukach biomedycznych i innych1. Co więcej, wraz z rozwojem i dostępnością nowych technologii, liczba zmutowanych linii stale rośnie2. Prowadzi to do konieczności bezpiecznego przechowywania zasobów genetycznych wykraczającego poza powszechne praktyki utrzymywania rodzin rozrodczych. Jako metoda, która umożliwia bezpieczne przechowywanie zasobów genetycznych przez czas nieokreślony, kriokonserwacja oferuje wiele korzyści, takich jak wydłużenie sezonu rozrodczego, omija potrzebę ciągłego utrzymywania stada lęgowego oraz jest bardziej opłacalna i pracochłonna2.
Protokoły kriokonserwacji nasienia opracowane w ciągu ostatnich kilku lat2,3,4 oferują możliwość skutecznego przechowywania materiału genetycznego samców danio pręgowanego. Jednak kriokonserwacja jaj lub zarodków u ryb nie jest jeszcze możliwa ze względu na ich złożoną strukturę i duże ilości materiału żółtkowego. Ostatnio praktyka przeszczepiania pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) lub spermatogonialnych komórek macierzystych (SSC) oferuje obejście tej bariery, przekształcając się w funkcjonalne plemniki i komórki jajowe po przeszczepie5. W związku z tym kriokonserwacja SSC otwiera nowe możliwości w ochronie rzadkich i cennych zasobów genetycznych.
Mimo że kriokonserwacja oferuje wiele korzyści, proces zamrażania o niskiej prędkości generuje kilka warunków, które mogą prowadzić do uszkodzenia komórek2. Należą do nich wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe tworzenie się lodu, odwodnienie, toksyczność krioprotektantów i inne. Lód wewnątrzkomórkowy uszkadza komórki, lód zewnątrzkomórkowy może prowadzić do mechanicznego zgniatania komórek, natomiast dyfuzja wody z komórek podczas powolnego zamrażania może prowadzić do odwodnienia6. Ostatnio witryfikacja jako technika zapobiegająca negatywnym skutkom tworzenia się lodu została zastosowana w kriokonserwacji gamet ryb7,8,9. Przedstawia technikę ultraszybkiego chłodzenia, dzięki której media wewnętrzne i zewnętrzne przechodzą w stan amorficzny/szklisty bez krystalizacji w lód7,10. Skuteczna witryfikacja tkanki jąder i jajników została udowodniona u gatunków ptaków i ssaków10,11,12, otwierając w ten sposób możliwości jej zastosowania również u ryb.
W tym badaniu prezentujemy procedurę witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do kriokonserwacji całych jąder danio pręgowanego. Pokazujemy wiarygodną metodę izolacji komórek rozrodczych danio pręgowanego we wczesnym stadium bez zanieczyszczenia oraz proces kriokonserwacji, który daje stosunkowo duże ilości komórek rozrodczych we wczesnym stadium przy niskiej obecności innych komórek, zwłaszcza plemników. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwsze badanie, które demonstruje szczegółowy, zobrazowany protokół ultraszybkiego chłodzenia tkanki gonadalnej ryb i komórek rozrodczych zebry danio pręgowanego. Dodatkowo wykazano powtarzalność metody w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego: AB typu dzikiego, kacper (roy-/-; masa perłowa-/-), lampart (leot1/t1), vasa [Tg(vas::eGFP)] i guz Wilmsa [Tg(wt1b::eGFP 1)] linia transgeniczna.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Uzupełniony L-glutaminą</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehaloza</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrat</td></tr><tr><td>metanolu</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Glikol propylenowy</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Sulftlenek dimetylu</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tabletki do przygotowania 200 ml roztworu PBS</td></tr></tbody></table>

kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Obecne trendy w nauce i biotechnologii prowadzą do tworzenia tysięcy nowych linii w organizmach modelowych, co prowadzi do konieczności nowych metod bezpiecznego przechowywania zasobów genetycznych, wykraczających poza powszechne praktyki utrzymywania kolonii hodowlanych. Głównym celem tego badania było dostosowanie procedury witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do krioprezerwacji całych jąder danio pręgowanego. Kriokonserwacja komórek rozrodczych we wczesnym stadium przez całe jądra NIV stwarza możliwości przechowywania zasobów genetycznych danio pręgowanego, zwłaszcza że po przeszczepie mogą one dojrzeć zarówno do gamet męskich, jak i żeńskich. Jądra wycięto, przygwożdżono do igły do akupunktury, zrównoważono w dwóch pożywkach krioprotekcyjnych (roztwór równoważący zawierający 1,5 M metanolu i 1,5 M glikolu propylenowego; oraz roztwór do witryfikacji zawierający 3 M dimetylosulfotlenek i 3 M glikol propylenowy) i zanurzono w ciekłym azocie. Próbki podgrzano w serii trzech następujących po sobie roztworów ocieplających. Główne zalety tej techniki to: (1) brak plemników po strawieniu rozgrzanych jąder, co ułatwia dalsze manipulacje; (2) ultraszybkie chłodzenie umożliwiające optymalną ekspozycję tkanek na ciekły azot, a tym samym maksymalizujące chłodzenie i zmniejszające wymagane stężenie krioprotektantów, zmniejszając w ten sposób ich toksyczność; (3) synchroniczne narażenie kilku jąder na działanie krioprotektantów i ciekłego azotu; oraz (4) powtarzalność wykazana poprzez uzyskanie żywotności powyżej 50% w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego.

Średnia liczba komórek zarodkowych wczesnego stadium wyizolowanych z jednego świeżego jądra danio pręgowanego wahała się od 40 000 do 200 000 komórek, w zależności od wielkości ryby. Podczas trawienia świeżych jąder danio pręgowanego we wszystkich 5 szczepach, komórki zarodkowe wczesnego stadium nie były jedynymi komórkami obecnymi w zawiesinach komórkowych (Rycina 2). Obok komórek zarodkowych wczesnego stadium stwierdzono obecność licznych spermatozoów. Z dr...

Głównym celem tego badania było dostosowanie procedury witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do kriokonserwacji całych jąder danio pręgowanego. Dodatkowo przetestowano powtarzalność metody w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego.

Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Kriokonserwacja umożliwia utrzymanie żywych komórek i tkanek w niskich temperaturach przez nieokreślony czas, przynajmniej w ludzkim pojęciu. Witryfikacja jest formą kriokonserwacji polegającą na ultraszybkim chłodzeniu do szklistego stanu amorficznego, bez tworzenia się kryształków lodu i bez związanych z tym uszkodzeń. W tym filmie przedstawiamy protokół witryfikacji całych jąder danio przebrueca, który pozwala na ich bezpieczne przechowywanie do późniejszego wykorzystania jako źródła komórek zarodkowych do transplantacji odpowiednim biorcom.Obecny protokół witryfikacji ma jedną znaczącą przewagę nad protokołami zamrażania o wolnej szybkości w odniesieniu do manipulacji komórkami macierzystymi linii zarodkowej. Polega ona na tym, że po witryfikacji i rozmrażaniu plemniki obumierają i są usuwane, przez co nie występują w zawiesinie komórkowej. W związku z tym po rozmrażaniu nie ma potrzeby izolacji komórek zarodkowych.Ułatwia to dalsze manipulacje. Uśmierć rybę, umieszczając ją w naczyniu zawierającym 200 mg/L MS-222 przy pH 7. Przed przystąpieniem do sekcji upewnij się, że skrzela przestały się poruszać i że od tego momentu minęło co najmniej 10 minut, aby zapewnić śmierć w wynik

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jest to protokół wysokoprzepustowej krio konserwacji plemników rybek zebrafish. Plemniki krio konserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% podczas późniejszego zapłodnienia in vitro i pozostają stabilne przez wiele lat.

Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Jest to metoda generowania gynogenetycznych diploidalnych embrionów danio przeżębnika (embrionów, których jedynym wkładem genetycznym jest materiał macierzysty), poprzez blokowanie drugiego podziału mejozy bezpośrednio po zapłodnieniu plemnikami inaktywowanymi światłem ultrafioletowym. Embriony EP nie są w pełni homozygotyczne ze względu na rekombinację podczas pierwszego podziału mejozy, są jednak homozygotyczne we wszystkich loci, które nie zostały oddzielone od centromeru w wyniku...

Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

W tym filmie demonstrujemy ultraszybką metodę kriowitryfikacji do konserwacji próbek biologicznych. Metoda polega na zastosowaniu kombinacji krioprotektantów w celu ochrony tkanki biologicznej przed uszkodzeniem przez zamarzanie poprzez zapobieganie tworzeniu się wewnątrzkomórkowych kryształków lodu.

Kriokonserwacja oparta na witryfikacji: ultraszybka technika chłodzenia służąca do przechowywania próbek biologicznych w bardzo niskich temperaturach w celu długotrwałego przechowywania

W tym filmie opisujemy procedurę witryfikacji pobranych zarodków królika na pożądanym etapie rozwoju przy użyciu glikolu etylenowego i dimetylosulfotlenku jako krioprotektantów oraz słomy kriogenicznej jako systemu nośnego. Zarodki zeszklone mają wysoki wskaźnik przeżywalności i mogą być przechowywane przez dłuższy czas do momentu wykorzystania.

Witryfikacja zarodków królików za pomocą słomki kriogenicznej: ultraszybka technika chłodzenia w celu zachowania zarodków królika do długotrwałego przechowywania

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Wykorzystanie danio pręgowanego do badań sercowo-naczyniowych rozszerza się w kierunku badań nad dorosłymi sercami. W przypadku tych zastosowań szybka i prosta izolacja tkanek serca ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zmian pośmiertnych i uzyskania odpowiedniej liczby próbek. Tutaj opisujemy szybką i powtarzalną metodę preparowania serc dorosłych danio pręgowanego.

Odzyskiwanie serc dorosłych ryb danio pręgowanego do zastosowań o wysokiej przepustowości

Wielokrotne pobieranie próbek krwi jest konieczne i ważne w badaniach na zwierzętach. Opracowaliśmy nową, nieśmiertelną i niezawodną metodę wielokrotnego pobierania krwi od dorosłych ryb danio pręgowanego i zastosowaliśmy tę metodę do badania biochemii krwi, w tym metabolizmu glukozy.

Wielokrotne pobieranie krwi do badań krwi u dorosłych danio pręgowanego

Zmodyfikowany protokół manipulacji ploidalnością wykorzystuje szok cieplny do wywołania jednocyklowego zatrzymania cytokinezy we wczesnym zarodku. Protokół ten został zademonstrowany w przypadku danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych gatunków.

Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy prostą metodę rozdzielania komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajników danio pręgowanego, która ułatwi badania rozwoju jajników u danio pręgowanego.

Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Poznaj metodę kriokonserwacji jąder danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle. Technika ta umożliwia skuteczne przechowywanie komórek płciowych do badań biologii rozrodu.

Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Przeglądaj więcej filmów