Wykorzystanie kapsułek do negatywnego barwienia próbek wirusa w obrębie zabezpieczeń biologicznych

Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie prostej i skutecznej procedury barwienia ujemnego TEM dla próbek wirusa w obrębie izolacji biologicznej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania wirusologiczne dotyczące morfologii i struktur badanych wirusów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia łatwą i efektywną obsługę siatek mikroskopii elektronowej w środowiskach biohermetycznych .

Technika ta jest stosowana w ramach diagnostyki TEM nieznanego wirusa, ponieważ można ją łatwo zastosować do próbek wirusów we wszystkich środowiskach. Chociaż wykorzystaliśmy tę metodę przede wszystkim do pomocy w badaniach nad TEM wirusa, ma ona znacznie szersze zastosowanie i może być stosowana w badaniach EM większości nanocząstek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ wymaga to pewnej praktyki, aby zapewnić, że siatki TEM nie zostaną uszkodzone podczas ładowania i rozładowywania z kapsuł.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy mieliśmy problemy z obsługą małych siatek EM w zabezpieczeniach biologicznych. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj lub kup z wirusowych i powlekanych węglem siatki miedziane TEM. Włóż powlekane siatki TEM do kapsułek.

Następnie przenieś załadowane kapsułki wraz z innymi zapasami i odczynnikami do zabezpieczenia biologicznego. Aby rozpocząć, podłącz kapsułkę do pipety. Odessać 40 mikrolitrów ekspansji wirusa do kapsułki.

Umieść pipetę na boku, z kratkami ustawionymi poziomo na 10 minut. Następnie podnieś pipetę i wlej roztwór wirusa do pojemnika na odpady. Odessać 40 mikrolitrów 2% utrwalacza aldehydu glutarowego do kapsułek.

Umieść pipetę na boku na 20 minut. Następnie wyrzuć utrwalacz i odessaj 40 mikrolitrów zdejonizowanej wody do kapsułki, aby zmyć utrwalacz. Powtórz to pranie trzy razy.

Następnie odessać 40 mikrolitrów 1% octanu uranylu lub 1% kwasu fosforofosforanowego potasu do kapsułki. Pozostaw kapsułkę na 30 sekund. Następnie wyjmij kapsułkę z pipety.

Przyłóż kawałek bibuły filtracyjnej do krawędzi kratek, aby wysuszyć. Przenieś bibułę filtracyjną do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie namocz bibułę filtracyjną w 1% roztworze tetratlenku osmu.

Umieść kapsułkę z otwartą pokrywką w tubce. Uszczelnij rurkę na jedną godzinę, aby umożliwić całkowite przenikanie oparów tetratlenku osmu. Następnie należy odkazić probówkę i przenieść ją z zabezpieczenia biologicznego do obiektu BSL-2 EM.

Wyjąć kapsułkę z probówki wirówkowej, a następnie umieścić ją na pipecie. Zassać 40 mikrolitrów wody dejonizowanej do kapsułki, a następnie dozować wodę do pojemnika na odpady. Powtórz to mycie wodą trzy razy.

Następnie wyjmij kapsułkę z pipety. Za pomocą bibuły filtracyjnej osusz kratki. Pozostaw siatki do wyschnięcia na powietrzu, a następnie przechowuj je w pudełku z siatką, aż będą gotowe do wykonania obrazowania TEM.

Na początek należy wymieszać zawiesinę wirusa z równą objętością 4% aldehydu glutarowego, aby uzyskać końcowe stężenie 2% aldehydu glutarowego. Za pomocą utrwalacza dezaktywuj wirusa na co najmniej 24 godziny. Odkaż rurkę i przenieś ją do obiektu BLS-2 EM.

Następnie przymocuj do pipety chwytak załadowany siatką. Zassać mieszaninę do kapsułki. Umieść pipetę na boku z kratkami ustawionymi poziomo na 10 minut.

Następnie należy podnieść pipetę i wyrzucić mieszaninę wirusów do pojemnika na odpady. Zassać 40 mikrolitrów wody dejonizowanej do kapsułki, a następnie wyrzucić wodę do pojemnika na odpady. Powtórz to pranie trzy razy.

Następnie zassać 40 mikrolitrów 1%QA lub 1%PTA do kapsułki na 30 sekund. Wyjąć kapsułkę z pipety. Za pomocą bibuły filtracyjnej osusz kratki.

Następnie pozostaw kratki do wyschnięcia na powietrzu. W tym badaniu próbki wirusa Ebola w Zairze są poddawane barwieniu ujemnemu, zarówno przy użyciu ręcznej metody kropelkowej, jak i metody kapsułkowej. Obrazy TEM wygenerowane tymi metodami pokazują wyraźnie zdefiniowane szczegóły, ze strukturami nukleokapsydu w środku warionu i widocznymi glikoproteinami na powierzchni.

W ten sposób metoda kapsułowa jest w stanie wytworzyć obrazy TEM o jakości podobnej do tych wytwarzanych ręczną metodą kropelkową. Następnie porównuje się różne metody inaktywacji próbek przy użyciu wirusa Chikungunya. Inaktywację próbki uzyskuje się albo szybko, stosując 2% aldehydu glutarowego przez 20 minut, a następnie wystawiając na działanie 1% tetratlenku osmu przez jedną godzinę, albo przez noc, używając 2% aldehydu glutarowego przez 24 godziny.

Jak widać, dłuższy proces inaktywacji bez tetratlenku osmu pozwala na dostrzeżenie większej liczby szczegółów ultrastrukturalnych. Następnie, wykorzystując metodę kapsułkową, porównano dwie plamy przy użyciu cząstek wirusopodobnych utrwalonych przez aldehyd. Zarówno octan uranylu, jak i kwas fosfowolframowy wykazują wysoką jakość wyników, z wyraźnie zaznaczonymi granicami i widocznymi glikoproteinami.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około półtorej godziny, w zależności od liczby próbek. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o doborze odpowiednich odczynników utrwalających i barwiących do celów eksperymentalnych. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak liczenie cząstek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania poprzez obliczenie stężeń wirusa.

Technika ta poprawia sposób, w jaki wirusolodzy mogą z większą łatwością badać morfologię i strukturę wirusów, zwłaszcza w przypadku wirusów na poziomie BLS-3 i 4. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo radzić sobie z siatkami TEM w przypadku negatywnego barwienia w obrębie hermetyzacji biologicznej. Nie zapominaj, że praca z aldehydem, tetratlenkiem osmu i octanem uranylu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki ochrony osobistej i wyciąg chemiczny.