Wykorzystanie kapsułek do negatywnego barwienia próbek wirusa w obrębie zabezpieczeń biologicznych

Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie prostej i skutecznej procedury barwienia negatywnego w TEM dla próbek wirusowych w warunkach biocontainment. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wirusologii dotyczące morfologii i struktur badanych wirusów. Główną zaletą tej techniki jest łatwa i efektywna obsługa siatek do mikroskopii elektronowej w środowiskach biocontainment. Technika ta jest użyteczna jako element diagnostyki TEM nieznanego wirusa, ponieważ można ją łatwo zastosować do próbek wirusowych w dowolnym środowisku. Choć metoda ta była przez nas wykorzystywana głównie jako wsparcie w badaniach wirusów za pomocą TEM, ma ona znacznie szersze zastosowanie i może być używana w badaniach EM większości nanocząsteczek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wymagana jest pewna praktyka, aby mieć pewność, że siatki TEM nie zostaną uszkodzone podczas ładowania i wyjmowania z kapsułek.

Pomysł na tę metodę pojawił się u nas w momencie, gdy mieliśmy problemy z manipulowaniem małymi siatkami do EM w warunkach biocontainment.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować lub zakupić miedziane siatki do TEM powlekane Formvarem i węglem. Umieść powlekane siatki TEM w kapsułkach. Następnie przenieś załadowane kapsułki wraz z innymi materiałami i odczynnikami do strefy biocontainment. Na początek przymocuj kapsułkę do pipety. Pobierz 40 µL zawiesiny wirusa do kapsułki. Połóż pipetę na boku, tak aby siatki były zorientowane poziomo, na 10 minut. Następnie podnieś pipetę i odprowadź roztwór wirusa do pojemnika na odpady. Pobierz 40 µL 2% utrwalacza z glutaraldehydu do kapsułek. Połóż pipetę na boku na 20 minut. Po tym czasie usuń utrwalacz i pobierz 40 µL wody dejonizowanej do kapsułki, aby wypłukać utrwalacz. Powtórz to płukanie trzy razy.

Następnie aspiruj 40 µL 1% octanu uranylu lub 1% kwasu fosfotungstowego do kapsułki. Pozostaw kapsułkę na 30 sekund. Następnie wyjmij kapsułkę z pipety.

Dotknąć krawędzi siatek kawałkiem papieru filtracyjnego, aby osuszyć próbki. Przenieść papier filtracyjny do probówki wirówkowej o pojemności 15 milliliters. Następnie namoczyć papier filtracyjny w 1% roztworze czterotlenku osmu.

Umieść kapsułkę z otwartą pokrywką w probówce. Zamknij szczelnie probówkę na jedną godzinę, aby umożliwić pełną permeację par tetrotlenku osmu. Następnie zdekontaminuj probówkę i przenieś ją z obszaru biocontainment do laboratorium EM poziomu BSL-2.

Wyjmij kapsułkę z probówki do wirówki, a następnie nałóż ją na pipetę. Odciągnij 40 µL wody dejonizowanej do kapsułki, a następnie odprowadź wodę do pojemnika na odpady. Powtórz to płukanie wodą trzy razy.

Następnie wyjmij kapsułę z pipety. Za pomocą papieru filtracyjnego osusz siatki. Pozostaw siatki do wyschnięcia na powietrzu, a następnie przechowuj je w pudełku na siatki do momentu rozpoczęcia obrazowania TEM.

W celu rozpoczęcia procesu zmieszaj zawiesinę wirusa z równą objętością 4% glutaraldehydu, aby uzyskać końcowe stężenie 2% glutaraldehydu. Przy użyciu utrwalacza inaktywuj wirusa przez co najmniej 24 godziny. Zdekontaminuj probówkę i przenieś ją do laboratorium EM poziomu BSL-2. Następnie przymocuj do pipety uchwyt z załadowaną siatką. Wciągnij mieszaninę do kapsuły. Odłóż pipetę na bok, tak aby siatki były zorientowane poziomo, na 10 minut.

Następnie należy wziąć pipetę i wydmuchać mieszaninę wirusów do pojemnika na odpady. Należy pobrać 40 µL wody dejonizowanej do kapsuły, a następnie usunąć wodę do pojemnika na odpady. Ten etap płukania należy powtórzyć trzykrotnie.

Następnie naciągnij 40 µL 1% UA lub 1% PTA do kapsuły i utrzymuj przez 30 sekund. Wyjmij kapsułę z pipety. Za pomocą papieru filtracyjnego osusz siatki.

Następnie pozostaw siatki do wyschnięcia na powietrzu.

W niniejszym badaniu próbki wirusa Ebola z Zairu poddano barwieniu negatywowemu, stosując zarówno ręczną metodę kroplową, jak i metodę kapsułkową. Obrazy TEM uzyskane obiema tymi metodami wykazują wyraźnie zdefiniowane szczegóły, z widocznymi strukturami nukleokapsydu w centrum wirionu oraz glikoproteinami na powierzchni. Zatem metoda kapsułkowa pozwala na uzyskanie obrazów TEM o jakości zbliżonej do obrazów otrzymanych metodą kroplową. Następnie, przy użyciu wirusa Chikungunya, porównano różne metody inaktywacji próbek. Inaktywację próbek przeprowadzano albo szybko, stosując 2% glutaraldehyd przez 20 minut z późniejszą ekspozycją na 1% tetraoksyd osmu przez jedną godzinę, albo przez noc, stosując 2% glutaraldehyd przez 24 godziny. Jak widać, dłuższy proces inaktywacji bez zastosowania tetraoksyd osmu pozwala na zaobserwowanie większej liczby szczegółów ultrastrukturalnych.

Następnie, z wykorzystaniem metody kapsułkowej, porównano dwa barwniki, stosując cząsteczki przypominające wirusy utrwalone aldehydem. Zarówno octan uranylu, jak i kwas fosfotungstowy dają wyniki wysokiej jakości, z wyraźnie zarysowanymi granicami i widocznymi glikoproteinami.

Po opanowaniu, technikę tę można przeprowadzić w około półtorej godziny, w zależności od liczby próbek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o doborze odpowiedniego utrwalacza i odczynników barwiących, dostosowanych do celów eksperymentalnych. Po zakończeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak liczenie cząstek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania poprzez obliczenie stężeń wirusa.

Technika ta ułatwia wirusologom badanie morfologii i struktury wirusów, szczególnie w przypadku wirusów poziomu BSL-3 i 4. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat łatwego obchodzenia się z siatkami TEM do barwienia negatywnego w warunkach biocontainment. Należy pamiętać, że praca z aldehydem, osmiem tetratlenkiem oraz octanem uranylu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki ochrony indywidualnej oraz dygestorium chemiczne.