Name: Wykorzystanie kapsułek do negatywnego barwienia próbek wirusa w obrębie zabezpieczeń biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę negatywnego barwienia próbek wirusowych w biologicznych poziomach zabezpieczeń BSL-2, BSL-3 i BSL-4 przy użyciu innowacyjnych kapsuł do obsługi siatek mikroskopowych. Technika ta ułatwia badanie morfologii wirusów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Johnowi Carrze i Rowenie Schokman za dostarczenie oczyszczonych nano-VLP wirusa Ebola, dr Rajini Mudhasani za dostarczenie wirusa Chikungunya oraz dr Charlesowi (Jasonowi) Shoemakerowi za dostarczenie VLP z ekspresją glikoprotein wirusa Ebola. Chcielibyśmy również podziękować MAJ Carlowi Sofflerowi za ułatwienie udziału w Programie Praktyk Letnich (SIP) oraz Programie Praktyk Naukowych i Inżynieryjnych (SEAP) oraz dr Catherine Wilhelmsen za szkolenie w zakresie bezpieczeństwa w laboratorium.

1. Przygotowanie eksperymentu w środowisku BSL-2 przed rozpoczęciem pracy z próbkami wirusa
<ol>
	<li>Przygotuj lub kup siatki miedziane TEM Formvar i powlekane węglem, zwykle 200-400 oczek.</li>
	<li>Włóż powlekane siatki TEM do kapsułek.
	<ol>
		<li>Użyj powiększonego obiektywu, aby ułatwić ten proces. Do każdej kapsułki można włożyć jedną lub dwie siatki. W razie potrzeby można kupić wstępnie załadowane kapsułki, aby wyeliminować ten krok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść kapsułki z włożonymi siatkami pokrytymi TEM, wraz z innymi materiałami eksploatacyjnymi i odczynnikami, do bezpiecznego przechowywania biologicznego, gdzie wirusy będą barwione ujemnie.</li>
</ol>
2. Metoda kapsułkowa do barwienia ujemnego w zabezpieczeniu biologicznym przy użyciu wodnego aldehydu glutarowego i 1% inaktywacji parami tetratlenku osmu
<ol>
	<li>Wewnątrz BSC zabezpieczenia biologicznego odessać 40 μl zawiesiny wirusa do kapsułki dołączonej do pipety. 
	UWAGA: Pipeta pozostaje przymocowana do kapsułki do momentu zakończenia procesu. Przygotowanie wirusa odbywa się zgodnie z naszą poprzednią publikacją14.</li>
	<li>Umieść pipetę na boku na 10 minut z kratkami ustawionymi poziomo. Ma to na celu zapewnienie równomiernego rozprowadzenia cząsteczek wirusa na powlekanych siatkach.</li>
	<li>Wirus dezaktywowany w torebce wewnątrz BSC zabezpieczenia biologicznego.
	<ol>
		<li>Podnieść pipetę i wcisnąć tłok, aby dozować roztwór wirusa do pojemnika na odpady.</li>
		<li>Odessać 40 μl 2% utrwalacza aldehydu glutarowego do kapsułek. 
		Uwaga: Aldehyd glutarowy jest niebezpieczną substancją chemiczną i wymaga odpowiedniej ochrony. Aldehyd glutarowy może być stosowany przez krótki czas w normalnym BSC, ale rozszerzony otwarty odczynnik wymaga pracy w kanałowym BSC lub okapie oparów chemicznych.</li>
		<li>Ułóż pipetę na boku na 20 minut. Ma to na celu upewnienie się, że próbki są dobrze utrwalone.</li>
		<li>Wydalić utrwalacz i odessać 40 μl wody dI do kapsułek, aby zmyć utrwalacz. Powtórz ten krok prania, w sumie przez 3 cykle płukania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać 40 μl 1% octanu uranylu (UA) lub 1% kwasu fosforomanganowego potasu (PTA) do kapsułek i pozostawić na 30 s. 
	UWAGA: Czas barwienia może wynosić od 10 s do 1 minuty w zależności od próbki wirusa. 
	Uwaga: UA jest emiterem alfa i toksyną kumulatywną. Obchodź się z nim z odpowiednią ochroną.</li>
	<li>Wyjąć kapsułkę z pipety i osuszyć siatki, dotykając kawałka bibuły filtracyjnej do krawędzi kratki, podczas gdy kratki pozostają w kapsułce.</li>
	<li>Procedura inaktywacji par tetratlenku osmu.
	<ol>
		<li>Umieścić kapsułkę z otwartą pokrywką w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej bibułę filtracyjną nasączoną 1% roztworem tetratlenku osmu . 
		Uwaga: Tetrtlenek osmu jest wyjątkowo toksyczny przy niskiej prężności par. Musi być używany w kanałowym BSC lub okapie oparowym chemikaliów. Obchodź się z nim z odpowiednią ochroną. Umieść informacje ostrzegawcze w obszarze roboczym.</li>
		<li>Uszczelnij probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na 1 godzinę, aby umożliwić całkowite przenikanie oparów tetratlenku osmu. Następnie należy odkazić i przenieść probówkę z zabezpieczenia biologicznego do obiektu BSL-2 EM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń siatki EM z kapsułki.
	<ol>
		<li>W urządzeniu BSL-2 EM wyjmij kapsułkę z probówki wirówkowej i umieść ją na pipecie.</li>
		<li>Zassać 40 μl wody dI do kapsułki i trzykrotnie dozować wodę do pojemnika na odpady.</li>
		<li>Wyjmij kapsułkę z pipety i osusz siatkę za pomocą bibuły filtracyjnej, aby dotknąć krawędzi kratki.</li>
		<li>Po wyschnięciu na powietrzu przechowuj siatki do późniejszego obrazowania TEM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Metoda kapsułkowa do inaktywacji w zabezpieczeniu biologicznym z 2% aldehydem glutarowym, a następnie barwienie ujemne w laboratorium BSL-2
<ol>
	<li>Procedura inaktywacji wirusa.
	<ol>
		<li>Wewnątrz zabezpieczonego biologicznie BSC dobrze wymieszać zawiesinę wirusa z tą samą objętością 4% aldehydu glutarowego, aby uzyskać końcowe stężenie 2% aldehydu glutarowego. 
		Uwaga: Aldehyd glutarowy jest niebezpieczną substancją chemiczną i wymaga odpowiedniej ochrony. Aldehyd glutarowy może być stosowany przez krótki czas w normalnym BSC, ale rozszerzony otwarty odczynnik wymaga pracy w kanałowym BSC lub okapie oparów chemicznych.</li>
		<li>Dezaktywować wirusy za pomocą utrwalacza przez co najmniej 24 godziny przed zapakowaniem, odkażeniem i przetransportować do zakładu BSL-2 EM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W urządzeniu BSL-2 EM odessać mieszaninę wirusa i utrwalacza do kapsułki zawierającej dwie siatki TEM, przymocowanej do pipety.</li>
	<li>Pipetę należy ustawić poziomo na 10 minut, z kratkami ustawionymi poziomo. 
	UWAGA: Ma to na celu zapewnienie równomiernego rozmieszczenia cząstek wirusa na siatkach TEM.</li>
	<li>Podnieść pipetę i nacisnąć tłok, aby usunąć wirusa do pojemnika na odpady. Odessać 40 μl wody dI do kapsułek i wyrzucić ją do pojemnika na odpady na 3 cykle płukania.</li>
	<li>Odessać 40 μl 1% UA lub 1% PTA do kapsułek przez 30 s. 
	UWAGA: Czas barwienia wahał się od 10 s do 1 min w zależności od próbki wirusa. 
	Uwaga: UA jest emiterem alfa i toksyną kumulatywną. Obchodź się z nim z odpowiednią ochroną.</li>
	<li>Wyjmij kapsułkę z pipety i osusz siatki, dotykając krawędzią kratki kawałka bibuły filtracyjnej. Wysuszyć siatki na powietrzu i przechowywać je do późniejszego obrazowania TEM.</li>
</ol>

<ol><li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li>
<li>Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helmut+Ruska+and+the+visualisation+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helmut Ruska and the visualisation of viruses.</a> Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).</li>
<li>Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+transmission+electron+microscopy+to+the+clinical+study+of+viral+and+bacterial+infections%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future.</a> Micron. 37 (2), 91-106 (2006).</li>
<li>Goldsmith, C. S., Miller, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+uses+of+electron+microscopy+for+detection+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Modern uses of electron microscopy for detection of viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).</li>
<li>Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microsc+Rev%22%5BJournal%5D)">Negative staining of proteins.</a> Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+thinly+spread+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative staining of thinly spread biological samples.</a> Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).</li>
<li>Bradley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+bacteriophage+and+bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins.</a> Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+two+negative+staining+methods+on+the+Chinese+atypical+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus.</a> Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).</li>
<li>Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-core/content/view/S1431927615004407">Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules.</a> Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721(2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/capsulebased-processing-and-handling-of-electron-microscopy-specimens-and-grids/43059411AA8B965E6EA870B9ED9DFAC5">Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids.</a> Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Kostrna, M. S. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-and-microanalysis/article/reducing-reagent-consumption-and-improving-efficiency-of-specimen-fixation-and-embedding-grid-staining-and-archiving-using-mprep-capsule-processing/BD909A4213DA1D65217A9CDDE93AB2C0">Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing.</a> Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).</li>
<li>Monninger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viral+samples+within+biocontainment+for+ultrastructural+analysis%3A+Utilization+of+an+innovative+processing+capsule+for+negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining.</a> J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).</li>
<li>Rossi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ViroCyt%28R%29+Virus+Counter+for+rapid+filovirus+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation.</a> Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).</li>
<li>Carra, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermostable%2C+chromatographically+purified+Ebola+nano-VLP+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine.</a> J Transl Med. 13, 228(2015).</li>
<li>Rein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+viruses%3A+objects+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia viruses: objects and organisms.</a> Adv Virol. , 403419(2011).</li>
<li>Barland,, Rojkind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+with+osmium+tetroxide+vapour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative staining with osmium tetroxide vapour.</a> Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).</li>
</ol>

Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia zawarte w artykule są opiniami autorów i niekoniecznie są popierane przez armię amerykańską lub Departament Obrony.

Barwienie ujemne jest cenną techniką TEM do oceny i wymiarowania wirusów, kompleksów białkowych i nanocząstek. Przygotowanie kropelkowe tych próbek poprzez ręczne przesuwanie siatek z odczynnika do barwienia ujemnego jest klasycznym protokołem od ponad pół wieku. Jest to prosty proces, ale do pomyślnego zakończenia wymaga wiedzy zdobytej podczas szkolenia. Doskonałe barwienie negatywowe jest nadal uważane za najnowocześniejszy zestaw umiejętności i bardzo pożądane w wielu laboratoriach TEM. Metoda kapsułkowa ma kilka wyr...

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest skutecznym narzędziem do oglądania morfologii i ultrastruktury próbek biologicznych, które są zbyt małe, aby można je było zobaczyć za pomocą tradycyjnego mikroskopu świetlnego 1,2,3,4. TEM wystrzeliwują elektrony przez bardzo cienką próbkę, tworząc obraz o wyższej rozdzielczości, ponieważ elektrony mają znacznie krótszą długość fali niż światło. Obszary próbki, które zakrzywiają lub blokują elektrony, wydają się ciemne, podczas gdy obszary, które są przezroczyste dla elektronów, wydają się białe.
Brak gęstej materii elektronowej sprawia, że wirusy są trudne do zobaczenia w TEM, ponieważ nie mogą rozpraszać elektronów. Barwienie ujemne jest najczęstszą metodą stosowaną do tworzenia kontrastu i oglądania wirusów za pomocą TEM. Pierwsza procedura barwienia ujemnego została zaproponowana przez Brennera i Horne'a w 1959 roku, w oparciu o eksperyment, w którym Hall (1955) i Huxley (1957) obserwowali wygląd struktur biologicznych w odwrotnym kontraście po zanurzeniu w substancji o dużej gęstości elektronów 5. Proces barwienia negatywnego pozostał praktycznie niezmieniony w ciągu ostatniego półwiecza. Barwienie ujemne polega na krótkim nałożeniu roztworu soli metalu ciężkiego na próbkę na siatce TEM w celu otoczenia wirusa gęstym materiałem bez infiltracji wirusa 6. Tworzy to ciemną obwódkę i odsłania kształt cząstki 5. W badaniu wykorzystano dwa odczynniki do barwienia ujemnego, octan uranylu (UA) i kwas fosforofosforanu potasu (PTA). Oba te barwniki są powszechnie używane do negatywnego barwienia małych próbek biologicznych, takich jak wirusy, kompleksy białkowe i nanocząstki 7,8,9.
Konwencjonalną techniką barwienia ujemnego jest ręczna technika barwienia ujemnego kropelkami7. Metoda ta wymaga precyzyjnego obchodzenia się z małymi, delikatnymi siatkami TEM za pomocą kleszczy w celu nałożenia niewielkich ilości próbki wirusa, barwienia i płukania. Typowy protokół przygotowania polega na nałożeniu kropli zawiesiny próbki na powierzchnię pokrytej folią siatki TEM (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). Po przymocowaniu próbki do powierzchni folii, siatka jest płukana w celu usunięcia nieprzywierających wirusów i barwiona UA lub PTA przez kilka sekund do minuty, w zależności od rodzaju próbki. Nadmiar cieczy jest odprowadzany z siatki poprzez dotknięcie kawałka bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki.
Metoda ręcznego kropelowania wymaga, aby każda siatka była wykonana indywidualnie. Jeśli nie obchodzisz się z nimi ostrożnie, powlekane siatki TEM łatwo się przebijają, wyginają lub zanieczyszczają. Przetwarzanie wielu próbek może prowadzić do trudności w śledzeniu siatek i zapewnieniu spójnego barwienia dla każdej próbki. Ta ręczna procedura barwienia jest znacznie trudniejsza, gdy jest przeprowadzana w laboratoriach biologicznych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-3 i -4, ze względu na wymagane środki ochrony osobistej (PPE) wymagane w tych środowiskach. Środki ochrony osobistej są uciążliwe, a środowisko hermetyczności biologicznej jest znacznie bardziej burzliwe w porównaniu ze zwykłym laboratorium. Personel pracujący w laboratoriach bezpieczeństwa biologicznego BSL-3 jest zobowiązany do noszenia 2 par rękawic i pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Ta podwójna warstwa rękawic zmniejsza wrażliwość dotykową i ogranicza drobne ruchy motoryczne. Przepływ powietrza przez BSC, który chroni użytkownika i pomaga zapobiegać zanieczyszczeniu próbki, może powodować zbyt szybkie wysychanie próbek i plam, co wpływa na jakość plamy. Silny turbulentny przepływ powietrza w BSC może również szybko zdmuchnąć siatkę, która nie jest dobrze zabezpieczona. W laboratoriach bezpieczeństwa biologicznego BSL-4 obowiązują dodatkowe wymagania bezpieczeństwa. Personel jest zobowiązany do noszenia skafandra nadciśnieniowego, który dodatkowo ogranicza ruchy fizyczne i zdolność do wyraźnego widzenia i manipulowania siatkami. Technik pracujący w BSL-4 nosi również co najmniej 2 pary rękawic, przy czym zewnętrzna para to gruba rękawica, która znacznie zmniejsza zręczność i wrażenia dotykowe. Wreszcie, kleszcze używane do obsługi siatek TEM są ostre, co stanowi zagrożenie dla technika ze względu na ich zdolność do przebijania rękawic. W przypadku kapsułek zawierających siatki, kleszcze nie są konieczne, co stanowi bezpieczną, wolną od kleszczy alternatywę do manipulowania siatkami w zabezpieczeniu biologicznym. Wreszcie, kapsułki zapewniają również skuteczny sposób przechowywania siatek podczas przetwarzania, odkażania parami osmu oraz podczas przechowywania; dzięki temu siatki są uporządkowane i zabezpieczone przed uszkodzeniem.
W tym raporcie wprowadzamy nową metodę barwienia ujemnego siatek TEM w laboratoriach biobezpieczeństwa, która wykorzystuje kapsułki mPrep/g, urządzenie oparte na kapsułkach do obsługi i barwienia siatki 10,11,12. Kapsuła mieści dwie kratki TEM, minimalizuje bezpośrednią obsługę i zmniejsza ryzyko uszkodzenia siatki. Kapsułkę mocuje się bezpośrednio do pipety jedno- lub wielokanałowej w taki sam sposób, jak końcówka do pipety, co umożliwia nakładanie różnych płynów na znajdujące się w niej siatki. Umożliwia to jednoczesne przygotowanie wielu próbek ze zduplikowanymi siatkami (rysunek 1B). Aby uzyskać ujemne zabarwienie kapsułkami, próbkę wirusa zasysa się do kapsułki i utrzymuje przez 10 minut, aby wirusy mogły adsorbować się na powierzchni siatki. Siatki z zaadsorbowanym wirusem są następnie przemywane wodą dejonizowaną (dI) i barwione UA lub PTA przez kilka sekund do 1 minuty. W tym procesie wykorzystuje się te same kroki protokołu i odczynniki, co ręczna metoda kropelkowa; Różnica polega na tym, że cała praca odbywa się wewnątrz kapsuły, bez fizycznej obsługi siatek. (<silna klasa="xfig">Rysunki 1C, 1D).
Celem tego badania było sprawdzenie kapsułek jako nowej metody negatywnego barwienia próbek wirusa w środowiskach zabezpieczonych biologicznie. W badaniu tym zbadano również jakość obrazów TEM uzyskanych z dwóch różnych procedur inaktywacji wirusa: 1) szybkiej inaktywacji za pomocą 1% pary tetratlenku osmu oraz 2) 24-godzinnej inaktywacji 2% aldehydu glutarowego. Oba te zabiegi przeprowadzono przy użyciu kapsułek. Na koniec oceniliśmy dwie powszechnie stosowane barwniki negatywowe, UA i PTA, do stosowania w kapsułce. 13

<table><tbody><tr><td>Siatki TEM powlekane formvarem/węglem</td><td>SPI</td><td>3420C-MB</td><td>200 mesh Cu Pk/100</td></tr><tr><td>mPrep/g kapsułki</td><td>EMS</td><td>85010-01</td><td>pudełko</td></tr><tr><td>mPrep/f łączniki</td><td>EMS</td><td>85010-11</td><td>standard 16/Pk</td></tr><tr><td>glutaraldehdyde</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>50% roztwór, klasa EM</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>4% roztwór wodny</td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>w proszku</td></tr><tr><td>Kwas potasowo-fosforungrowy</td><td></td><td>Bibuła</td> filtracyjna w proszku EMS <td>19500</td></tr><tr><td></td><td>Whatman</td><td>1450-090</td><td>rozmiar 50</td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy transmisyjny</td><td>JEOL</td><td>JEM-1011</td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie kapsułek do negatywnego barwienia próbek wirusa w obrębie zabezpieczeń biologicznych

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) służy do obserwacji ultrastruktury wirusów i innych patogenów mikrobiologicznych z rozdzielczością nanometrów. Większość materiałów biologicznych nie zawiera gęstych pierwiastków zdolnych do rozpraszania elektronów w celu stworzenia obrazu; Dlatego wymagane jest barwienie ujemne, które umieszcza gęste sole metali ciężkich wokół próbki. Aby uwidocznić wirusy w zawiesinie pod TEM, należy je nanieść na małe siatki pokryte przezroczystą powierzchnią o grubości zaledwie nanometrów. Ze względu na niewielkie rozmiary i kruchość siatki te są trudne w obsłudze i łatwo przenoszone przez prądy powietrza. Cienka powierzchnia łatwo ulega uszkodzeniu, co sprawia, że próbka jest trudna lub niemożliwa do zobrazowania. Zakaźne wirusy muszą być przenoszone w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC), a niektóre wymagają środowiska laboratoryjnego z zabezpieczeniem biologicznym. Barwienie wirusów na poziomach bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-3 i -4 jest szczególnie trudne, ponieważ środowiska te są bardziej burzliwe, a technicy są zobowiązani do noszenia środków ochrony osobistej (PPE), co zmniejsza zręczność. 
W tym badaniu oceniliśmy nowe urządzenie, które pomaga w negatywnym zabarwieniu wirusów w zabezpieczeniu biologicznym. Urządzenie jest kapsułką, która pełni funkcję specjalistycznej końcówki do pipet. Po załadowaniu siatek do kapsułki, użytkownik po prostu zasysa odczynniki do kapsułki, aby dostarczyć wirusa i barwniki do zamkniętej siatki, eliminując w ten sposób obsługę siatek przez użytkownika. Chociaż technika ta została zaprojektowana specjalnie do stosowania w zabezpieczeniu biologicznym BSL-3 lub -4, może ułatwić przygotowanie próbki w dowolnym środowisku laboratoryjnym, umożliwiając łatwe barwienie ujemne wirusa. Ta sama metoda może być również zastosowana do przygotowania ujemnych próbek TEM nanocząstek, makrocząsteczek i podobnych próbek.

Metoda kapsułkowa pozwala na uzyskanie wysokiej jakości barwienia negatywowego do obrazowania TEM:
W pierwszej kolejności oceniono jakość obrazów uzyskanych przy zastosowaniu zarówno manualnej metody kroplowej, jak i metody kapsułkowej do barwienia negatywnego Zaire ebolavirus. Ebolawirusy, wraz z wirusem Marburg, należą do rodziny Filoviridae. Ebolawirus ma zazwyczaj średnicę od 80 do 100 nm i może osiągać długość ponad 1...

Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące próbek wirusa o negatywnym zabarwieniu, które mogą być łatwo wykorzystane w laboratoriach BSL-2, -3 lub -4. Obejmuje on zastosowanie innowacyjnej kapsuły procesowej, która chroni siatkę transmisyjnej mikroskopii elektronowej i zapewnia użytkownikowi łatwiejszą obsługę w bardziej burzliwych środowiskach w obrębie hermetyzacji biologicznej.

Wykorzystanie kapsułek do negatywnego barwienia próbek wirusa w obrębie zabezpieczeń biologicznych

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie prostej i skutecznej procedury barwienia negatywnego w TEM dla próbek wirusowych w warunkach biocontainment. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wirusologii dotyczące morfologii i struktur badanych wirusów. Główną zaletą tej techniki jest łatwa i efektywna obsługa siatek do mikroskopii elektronowej w środowiskach biocontainment. Technika ta jest użyteczna jako element diagnostyki TEM nieznanego wirusa, ponieważ można ją łatwo zastosować do próbek wirusowych w dowolnym środowisku. Choć metoda ta była przez nas wykorzystywana głównie jako wsparcie w badaniach wirusów za pomocą TEM, ma ona znacznie szersze zastosowanie i może być używana w badaniach EM większości nanocząsteczek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wymagana jest pewna praktyka, aby mieć pewność, że siatki TEM nie zostaną uszkodzone podczas ładowania i wyjmowania z kapsułek.Pomysł na tę metodę pojawił się u nas w momencie, gdy mieliśmy problemy z manipulowaniem małymi siatkami do EM w warunkach biocontainment.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować lub zakupić miedziane siatki do TEM powlekane Formvarem i węglem. Umieść powlekane siatki TEM w kapsułkach. Następnie przenieś załadowane kapsułki wraz z innymi materiałami i odczynnikami do strefy biocontainment. Na początek przymocuj kapsułkę do pipety. Pobierz 40 µL zawiesiny wirusa do kapsułki. Połóż pipetę na boku, tak aby siatki były zorientowane poziomo, na 10 minut. Następnie podnieś pipetę i odprowadź roztwór wirusa do pojemnika na odpady. Pobierz 40 µL 2% utrwalacza z glutaraldehydu do kapsułek. Połóż pipetę na boku na 20 minut. Po tym czasie usuń utrwalacz i pobierz 40 µL wody dejonizowanej do kapsułki, aby wypłukać utrwalacz. Powtórz to płukanie trzy razy.Następnie aspiruj 40 µL 1% octanu uranylu lub 1% kwasu fosfotungstowego do kapsułki. Pozostaw kapsułkę na 30 sekund. Następnie wyjmij kapsułkę z pipety.Dotknąć krawędzi siatek kawałkiem papieru filtracyjnego, aby osuszyć próbki. Przenieść papier filtracyjny do probówki wirówkowej o pojemności 15 milliliters. Następnie namoczyć papier filtracyjny w 1% roztworze czterotlenku osmu.Umieść kapsułkę z otwartą pokrywką w probówce. Zamknij szczelnie probówkę na jedną godzinę, aby umożliwić pełną permeację par tetrotlenku osmu. Następnie zdekontaminuj probówkę i przenieś ją z obszaru biocontainment do laboratorium EM poziomu BSL-2.Wyjmij kapsułkę z probówki do wirówki, a następnie nałóż ją na pipetę. Odciągnij 40 µL wody dejonizowanej do kapsułki, a następnie odprowadź wodę do pojemnika na odpady. Powtórz to płukanie wodą trzy razy.Następnie wyjmij kapsułę z pipety. Za pomocą papieru filtracyjnego osusz siatki. Pozostaw siatki do wyschnięcia na powietrzu, a następnie przechowuj je w pudełku na siatki do momentu rozpoczęcia obrazowania TEM.W celu rozpoczęcia procesu zmieszaj zawiesinę wirusa z równą objętością 4% glutaraldehydu, aby uzyskać końcowe stężenie 2% glutaraldehydu. Przy użyciu utrwalacza inaktywuj wirusa przez co najmniej 24 godziny. Zdekontaminuj probówkę i przenieś ją do laboratorium EM poziomu BSL-2. Następnie przymocuj do pipety uchwyt z załadowaną siatką. Wciągnij mieszaninę do kapsuły. Odłóż pipetę na bok, tak aby siatki były zorientowane poziomo, na 10 minut.Następnie należy wziąć pipetę i wydmuchać mieszaninę wirusów do pojemnika na odpady. Należy pobrać 40 µL wody dejonizowanej do kapsuły, a następnie usunąć wodę do pojemnika na odpady. Ten etap płukania należy powtórzyć trzykrotnie.Następnie naciągnij 40 µL 1% UA lub 1% PTA do kapsuły i utrzymuj przez 30 sekund. Wyjmij kapsułę z pipety. Za pomocą papieru filtracyjnego osusz siatki.Następnie pozostaw siatki do wyschnięcia na powietrzu.W niniejszym badaniu próbki wirusa Ebola z Zairu poddano barwieniu negatywowemu, stosując zarówno ręczną metodę kroplową, jak i metodę kapsułkową. Obrazy TEM uzyskane obiema tymi metodami wykazują wyraźnie zdefiniowane szczegóły, z widocznymi strukturami nukleokapsydu w centrum wirionu oraz glikoproteinami na powierzchni. Zatem metoda kapsułkowa pozwala na uzyskanie obrazów TEM o jakości zbliżonej do obrazów otrzymanych metodą kroplową. Następnie, przy użyciu wirusa Chikungunya, porównano różne metody inaktywacji próbek. Inaktywację próbek przeprowadzano albo szybko, stosując 2% glutaraldehyd przez 20 minut z późniejszą ekspozycją na 1% tetraoksyd osmu przez jedną godzinę, albo przez noc, stosując 2% glutaraldehyd przez 24 godziny. Jak widać, dłuższy proces inaktywacji bez zastosowania tetraoksyd osmu pozwala na zaobserwowanie większej liczby szczegółów ultrastrukturalnych.Następnie, z wykorzystaniem metody kapsułkowej, porównano dwa barwniki, stosując cząsteczki przypominające wirusy utrwalone aldehydem. Zarówno octan uranylu, jak i kwas fosfotungstowy dają wyniki wysokiej jakości, z wyraźnie zarysowanymi granicami i widocznymi glikoproteinami.Po opanowaniu, technikę tę można przeprowadzić w około półtorej godziny, w zależności od liczby próbek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o doborze odpowiedniego utrwalacza i odczynników barwiących, dostosowanych do celów eksperymentalnych. Po zakończeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak liczenie cząstek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania poprzez obliczenie stężeń wirusa.Technika ta ułatwia wirusologom badanie morfologii i struktury wirusów, szczególnie w przypadku wirusów poziomu BSL-3 i 4. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat łatwego obchodzenia się z siatkami TEM do barwienia negatywnego w warunkach biocontainment. Należy pamiętać, że praca z aldehydem, osmiem tetratlenkiem oraz octanem uranylu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki ochrony indywidualnej oraz dygestorium chemiczne.

utilization-capsules-for-negative-staining-viral-samples-within

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie kapsułek do negatywnego barwienia próbek wirusowych w obrębie bioizolacji

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Źródło: Feltwell, T., et.al. Oddzielanie bakterii według ilości kapsułki za pomocą nieciągłego gradientu gęstości. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia przygotowanie i charakterystykę szczepów bakteryjnych o różnej produkcji kapsułek. Szczepy chorobotwórcze niosące różne mutacje w genach związanych z kapsułkami są hodowane, hodowane w płynnych pożywkach i poddawane wirowaniu w celu rozróżnienia fenotypów kapsułek na podstawie gęstości osadów. Leczenie buforowe stosuje się w celu...

Hodowla i izolacja chorobotwórczych szczepów bakterii tworzących kapsułki

W tym filmie demonstrujemy negatywne barwienie próbek wirusa w otoczce za pomocą kapsułki do przetwarzania w środowisku zabezpieczenia biologicznego. Ujemnie zabarwione wirusy można wizualizować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu zbadania struktury i morfologii wirusa z rozdzielczością nanometrów.

Barwienie ujemne próbek wirusów na siatkach TEM za pomocą kapsułek: technika barwienia metalami ciężkimi w celu wizualizacji ultrastruktury wirusów otoczkowych

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Ta technika opisuje zautomatyzowany procesor obrazu wsadowego przeznaczony do pomiaru promieni kapsułki polisacharydowej i ciała. Chociaż początkowo został zaprojektowany do pomiarów kapsułek Cryptococcus neoformans, zautomatyzowany procesor obrazu może być również stosowany do innych opartych na kontraście detekcji okrągłych obiektów.

Zautomatyzowany pomiar kapsułki polisacharydowej i korpusu komórki gatunków kryptokoków

Kapsułka polisacharydowa jest głównym czynnikiem wirulencji u Cryptococcus neoformans, a jej rozmiar koreluje ze zjadliwością szczepu. Pomiary średnicy kapsułki są wykorzystywane w testach fenotypowych i do oceny skuteczności terapeutycznej. Przedstawiono tutaj standardową metodę indukcji kapsułek, a także porównano dwie metody barwienia i pomiaru średnicy.

Rozmiar ma znaczenie: pomiar średnicy kapsułki u Cryptococcus neoformans

Negatywna plama EM to potężna technika wizualizacji struktury makromolekularnej, ale różne techniki barwienia mogą dawać różne wyniki w zależności od próbki. W tym miejscu szczegółowo opisano kilka podejść do barwienia negatywnego, aby zapewnić wstępny przepływ pracy w celu rozwiązania problemu wizualizacji trudnych systemów.

Wariacje na temat metod mikroskopii elektronowej w barwieniu ujemnym: narzędzia do radzenia sobie z trudnymi systemami

Pokazujemy użycie nieciągłych gradientów gęstości do rozdzielania populacji bakterii na podstawie produkcji kapsułek. Metoda ta służy do porównywania ilości kapsułek między kulturami, izolowania mutantów o określonym fenotypie kapsułki lub do identyfikacji regulatorów kapsułki. Opisano tutaj optymalizację i przebieg testu.

Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości

Tutaj opisujemy metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do separacji zainfekowanych ameb. W celu oddzielenia subpopulacji wirusów w Vermamoeba vermiformis zakażonych faustowirusami i nieznanymi gigantycznymi wirusami, opracowaliśmy protokół opisany poniżej i wykazaliśmy jego zdolność do oddzielania dwóch nowych wirusów gigantycznych o niskiej liczebności.

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N0) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Poznaj metodę negatywnego barwienia próbek wirusowych w biologicznych poziomach zabezpieczeń BSL-2, BSL-3 i BSL-4 przy użyciu innowacyjnych kapsuł do obsługi siatek mikroskopowych. Technika ta ułatwia badanie morfologii wirusów.

Wykorzystanie kapsułek do negatywnego barwienia próbek wirusa w obrębie zabezpieczeń biologicznych

Przeglądaj więcej filmów