Name: Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj protokół hodowli komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia w celu ograniczenia transmisji wirusa dengi. Metoda obejmuje utrzymanie temperatury 26°C i wilgotności 50-70% dla zdrowych kolonii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Heng Lin Yeap, Chrisowi Patonowi, Petrinie Johnson i Clare Doig za ich wkład w rozwój naszych metod utrzymania kolonii, a trzem anonimowym recenzentom za ich sugestie, które pomogły ulepszyć rękopis. Nasze badania są wspierane przez grant programowy i stypendium dla AAH od National Health and Medical Research Council oraz grant tłumaczeniowy od Wellcome Trust. PAR jest laureatem stypendium Australijskiego Rządowego Programu Szkoleń Badawczych.

Żywienie komarów krwią pobieraną od ludzi zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań z Udziałem Ludzi Uniwersytetu w Melbourne (numer zatwierdzenia: 0723847). Wszyscy ochotnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę.
1. Hodowla larw
UWAGA: Komary utrzymuje się w temperaturze 26 ± 0.5 °C oraz 50–70% wilgotności względnej, z fotoperiodem 12:12 h (światło:ciemność) w ramach niniejszego protokołu utrzymania kolonii. Warunki te są zbliżone do średnich warunków klimatycznych w Cairns w Australii i mieszczą się w optymalnym zakresie termicznym dla Ae. aegypti przeżycie i rozwój44,45,46Wysokie temperatury mogą prowadzić do utraty Wolbachia zakażenia z kolonii komarów i należy ich unikać47Utrzymujemy co najmniej 50 osobników w każdej populacji, aby zminimalizować chów wsobny; utrzymywanie kolonii o mniejszej liczebności może mieć wpływ na dostosowanie organizmów [Ross i wsp. nieopublikowane]. W tych warunkach i przy założeniu odpowiedniego odżywienia średni czas generacji wynosi 28 dni (patrz Tabela 1).
<ol>
	<li>Zanurz jaja na podłożu w kuwetach (Rysunek 1A) zawierających 3 L wody (woda z odwróconej osmozy lub odstana woda wodociągowa, przygotowana poprzez pozostawienie wody w kuwetach na 24 h przed użyciem), ~30 mg pokarmu dla ryb (jedna rozkruszona tabletka, patrz Tabela materiałów) oraz kilka ziaren aktywnych suchych drożdży, aby zaindukować wyklucie48.</li>
	<li>Jeden dzień po wykluciu, za pomocą szklanej pipety przenieś około 500 larw do kuwet zawierających 4 L wody (Rysunek 1B), przeliczając je za pomocą licznika mechanicznego. Do każdej kuwety dodaj dwie rozkruszone tabletki pokarmu dla ryb. W razie potrzeby użyj pojemników o różnych rozmiarach do hodowli larw (Rysunek 1A), ale utrzymuj gęstość larw poniżej 0,5 larwy/mL, aby uniknąć przeludnienia.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj kuwety, aby upewnić się, że larwy mają wystarczającą ilość pokarmu; co dwa dni dodawaj do kuwet około dwie tabletki pokarmowe. Podawaj pokarm ad libitum, ale upewnij się, że w tym okresie dostępne jest 0,5 mg/larwa/dzień, aby zapewnić synchronizację rozwoju i jednolitość rozmiaru ciała, w przeciwnym razie wyniki eksperymentów mogą być obarczone błędem (patrz Wyniki reprezentatywne).</li>
	<li>Należy uważać, aby nie przekarmiać larw, szczególnie w mniejszych pojemnikach hodowlanych o mniejszej powierzchni lustra wody i mniejszej objętości. Jeśli woda stanie się mętna lub wystąpi znaczna śmiertelność larw, wymień ją na świeżą wodę; przy optymalnym karmieniu śmiertelność powinna być pomijalna.</li>
</ol>
2. Wyklucie osobników dorosłych
UWAGA: Larwy zaczną przepacać od piątego dnia po wykluciu, jeśli będą odpowiednio karmione, a większość z nich powinna przepacić do siódmego dnia po wykluciu. Imago zaczną się wykluwać około dwóch dni po przepaczeniu, jeśli będą utrzymywane w optymalnej temperaturze 26 °C (patrz Reprezentatywne Wyniki). Rozwój larwalny zazwyczaj nie jest zaburzony przez infekcje Wolbachia , gdy zapewniona jest obfita ilość pokarmu23,39,49.
<ol>
	<li>Siedem dni po wykluciu przelać całą zawartość tacy przez gęste sito (rozmiar oczek 0,4 mm). Przefiltrowaną wodę z larwami zachować do późniejszego wykorzystania w naczyniach do składania jaj (patrz sekcja „Karmienie krwią i składanie jaj”). Odwrócić sito i zanurzyć je w plastikowym pojemniku z 20 mL wody, aby przenieść poczwarki. Jeśli w situ pozostały larwy, podać im dodatkowy pokarm.</li>
	<li>Przygotować klatki do wykluwania osobników dorosłych (Rycina 1C>, umieszczając w nich dwa kubki z 10% roztworem sacharozy (Rycina 1F>) oraz dwa kubki z wilgotną watą bawełnianą w celu zapobiegania wysychaniu (Rycina 1E>).</li>
	<li>Jeśli poczwarki nie wymagają segregacji według płci, umieścić zamknięte pojemniki z poczwarkami w klatce, pozostawiając pokrywki lekko uchylone, aby osobniki dorosłe mogły wykluwać się bezpośrednio do klatki. Alternatywnie, na pojemniku można umieścić odwrócony lejek, aby zminimalizować ryzyko utonięcia. Przed usunięciem pojemnika z klatki upewnić się, że wszystkie osobniki dorosłe się wykluły, aby uniknąć selekcji przeciwko osobnikom o wolniejszym tempie rozwoju.</li>
</ol>
3. Wyznaczanie płci poczwarek w celu krzyżowania zewnętrznego
<ol>
	<li>Jeśli poczwarki muszą zostać posortowane według płci (np. w celu krzyżowania wstecznego), przenosić poczwarki pipetą z tacek dla larw i rozdzielać płeć (Rysunek 2) do plastikowych pojemników (Rysunek 1A) zawierających 20 mL wody co 24 h, aż do uzyskania pożądanej liczby osobników każdej z płci. Zamknąć pojemniki pokrywkami i pozostawić je zamknięte.</li>
	<li>Imago wyklują się do pojemników; potwierdzić ich płeć przed przeniesieniem do klatek (Rysunek 2C). Usunąć za pomocą aspiratora wszelkie błędnie określone osobniki w ciągu 24 h od wyklucia, zanim osiągną dojrzałość płciową. Po potwierdzeniu płci przenosić imago do klatek co 24 h.</li>
	<li>Aby uzyskać kolonie zainfekowane Wolbachia o podobnym tle genetycznym do populacji naturalnej, przeprowadzić krzyżowanie wsteczne, dodając samice zainfekowane Wolbachia z kolonii laboratoryjnych do klatek z niezinfekowanymi samcami pochodzącymi z jaj zebranych w terenie za pomocą pułapek owitrapowych39, utrzymując zalecaną gęstość 50 osobników na populację.
	<ol>
		<li>Powtarzać krzyżowanie wsteczne przez co najmniej trzy kolejne pokolenia, aby uzyskać kolonie, które są w co najmniej 87,5% podobne genetycznie do populacji polowej39. Krytyczne: Należy upewnić się, że płeć została prawidłowo określona na tym etapie (patrz krok 3.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Samice Ae. aegypti są zazwyczaj oporne na ponowne zapłodnienie w ciągu kilku godzin od kopulacji50. Podczas krzyżowania kolonii pozwolić samicom i samcom dojrzeć w oddzielnych klatkach przez dwa dni, a następnie przenieść samice aspiratorem do klatki z samcami, aby zapewnić wszystkim samcom równą szansę.</li>
</ol>
4. Żywienie krwią i składanie jaj
<ol>
	<li>Przed karmieniem krwią należy odczekać co najmniej trzy dni od momentu wylochania ostatniej samicy, aby zapewnić odpowiedni czas na dojrzewanie. Karmienie krwią samic powinno odbyć się w ciągu dwóch tygodni od wylochania, aby zapobiec nadmiernej śmiertelności, szczególnie w przypadku komarów zainfekowanych Wolbachia, co negatywnie wpływa na długość życia2,24,49. Dzień przed karmieniem należy usunąć kubeczki z cukrem, aby zwiększyć efektywność żerowania.
	<ol>
		<li>Poproś wolontariusza o włożenie przedramienia do klatki, aby umożliwić samicym komarów pobranie krwi. Większość samic powinna nasycić się w ciągu 5 min, jednak aby ograniczyć selekcję przeciwko osobnikom żerującym wolniej, należy pozostawić przedramię w klatce przez 15 min lub do momentu, gdy wszystkie samice będą widocznie przepełnione; opcjonalnie, ale zaleca się użycie rękawiczki lateksowej w celu ochrony dłoni przed ukąszeniami.</li>
		<li>Dwa dni po karmieniu krwią należy umieścić w klatce dwa plastikowe kubeczki zawierające wodę do hodowli larw, wyłożone paskiem papieru ściernego (Rysunek 1G) (lub papierem filtracyjnym (Rysunek 1H)), aby samice mogły złożyć jaja. Pasek papieru ściernego należy częściowo zanurzyć w wodzie, aby utrzymać go w stanie wilgotnym. Należy usunąć inne źródła wody, aby zapobiec składaniu jaj przez samice poza kubeczkiem do ovipozycji. 
		UWAGA: W kubeczkach można stosować wodę z kranu, jednak woda do hodowli larw sprzyja ovipozycji51,52, a samice składają wtedy jaja w sposób bardziej synchroniczny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pobieranie i kondycjonowanie jaj
<ol>
	<li>Samice złożą jaja na papierze ściernym tuż nad lustrem wody; codziennie zbieraj i wymieniaj paski papieru ściernego, aż do momentu zaprzestania składania jaj. Należy pamiętać, że ovipozycja może trwać do jednego tygodnia.</li>
	<li>Wstępnie osusz paski papieru ściernego, delikatnie odciskając je ręcznikiem papierowym przez 30 s, uważając, aby nie usunąć jaj. Następnie zawiń paski w arkusz suchego ręcznika papierowego i umieść go w szczelnym plastikowym woreczku (Rysunek 1I). </li>
	<li>Sprawdź stan jaj pod mikroskopem dissectingowym (Rysunek 3). Jeśli paski papieru ściernego są zbyt wilgotne, jaja mogą wykluć się przed zanurzeniem w wodzie (Rysunek 3B), natomiast w przypadku zbyt silnego osuszenia jaja mogą ulec zapadnięciu (Rysunek 3C).</li>
	<li>Jaja można inkubować w dowolnym momencie po trzech dniach od momentu zebrania; wykluj wszystkie jaja z każdej kolonii, zebrane we wszystkich dniach, w tym samym naczyniu z wodą, aby zapewnić, że następne pokolenie zostanie pobrane z dużej, losowej puli osobników.</li>
	<li>Do długotrwałego przechowywania umieść jaja w szczelnym pojemniku przy wysokiej (&gt; 80%) wilgotności w temperaturze około 20 °C. W tych warunkach jaja pozbawione Wolbachia mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przy zachowaniu wysokiej wskaźnika wylęgu53,54.</li>
	<li>Ponieważ niektóre infekcje Wolbachia znacznie zmniejszają żywotność jaj wraz z upływem czasu49,5, wykluj jaja z linii zainfekowanych Wolbachia w ciągu jednego tygodnia od zebrania, aby zapobiec nadmiernej śmiertelności odpowiednich szczepów. Jeśli potrzebne są więcej jaj, po tygodniu ponownie podaj samicom pokarm krwi.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dzień</td>
			<td colspan="3">Krok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="3">Wylęganie jaj</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Przenoszenie larw do tacek i ich liczenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="3">Przenieś larwy i poczwarki do klatek koloni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td colspan="3">Karmienie krwią dorosłych osobników żeńskich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td colspan="3">Rozpocząć pobieranie jaj</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td colspan="3">Zakończ zbieranie jaj</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28</td>
			<td colspan="3">Wylęganie jaj</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przegląd harmonogramu utrzymywania kolonii Ae. aegypti w temperaturze 26 °C. Termin karmienia samic krwią oraz wyklucia się jaj jest elastyczny, jednak należy unikać długiego czasu trwania tych etapów, szczególnie w przypadku komarów zainfekowanych Wolbachia, aby zminimalizować śmiertelność. Przestrzeganie tego harmonogramu minimalizuje selekcję przeciwko komarom o szybkim lub wolnym tempie rozwoju lub dojrzewania na wszystkich etapach życia, pod warunkiem optymalnego karmienia larw.
<img alt="Typy i konfiguracje pojemników do hodowli owadów; przedstawiono różne tacki plastikowe, pudełko z siatki oraz opisane pojemniki do przechowywania w celu organizacji eksperymentów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Sprzęt używany do hodowli Ae. aegypti w laboratorium. (A) Plastikowe pojemniki używane do inkubacji jaj lub hodowli larw o objętościach 500, 750 i 50 ml (od lewej do prawej). (B) Tace używane do hodowli larw przy kontrolowanej gęstości, zazwyczaj 50 larw w 4 L wody. (C) 19,7 L i (D) klatki o pojemności 3 L używane do hodowli osobników dorosłych. Należy zachować zagęszczenie nieprzekraczające 25 osobników dorosłych na litr, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń. (E) kubek o pojemności 35 ml z wilgotną watą bawełnianą, służącą jako źródło wody dla osobników dorosłych. (F) kubek 35 ml z roztworem sacharozy dostarczanym za pomocą sznurka lub knotka dentystycznego jako źródła cukru. (G-H) kubki wypełnione wodą do hodowli larw i wyłożone podłożem do składania jaj w postaci papieru ściernego lub papieru filtracyjnego (G i H, odpowiednio). (I) Woreczek strunowy używany do przechowywania pasków papieru ściernego lub papieru filtracyjnego. Czarne kropki na papierze ściernym to jaja komarów. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat cyklu życiowego komara: stadia larwalne, poczwarki i postać dorosła; porównanie wielkości; badanie entomologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Widok boczny (A) i grzbietowy (B) poczwarek oraz osobnika dorosłego *Ae. aegypti* (C) wykazujące dymorfizm płciowy. Na każdym panelu samce znajdują się po lewej stronie, a samice po prawej. W warunkach optymalnego żywienia poczwarki samców i samic różnią się rozmiarem; samice są większe od samców (A) i mają stosunkowo kulisty głowotułów w porównaniu do samców, których boki są bardziej spłaszczone (B). Dorosłe samce są łatwo odróżnialne od samic we wszystkich warunkach hodowlanych, przede wszystkim ze względu na pierzaste czułki i długie palpy. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wzorce rozsiewania nasion; diagram A-C; skala milimetrowa; badanie ekologiczne; analiza rozmieszczenia nasion." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Czterodniowy Ae. aegypti jaja w różnych warunkach. (A) Nieuszkodzone jaja na paskach papieru ściernego utrzymywane w wysokiej (&gt; 80%) wilgotności, ale bez widocznej obecności wody. Odsetek wyklucia powinien przekraczać 90% dla typu dzikiego Ae. aegypti przy prawidłowej konserwacji. (BJaja, które wyklują się przed zanurzeniem w wodzie (przedwczesne wyklucie), można rozpoznać po oddzielonej pokrywce jajowej i widocznej larwie. Świadczy to o zbyt wysokiej wilgotności paska papieru ściernego.CJaja, które zostały zbyt gwałtownie wysuszone, mogą ulec zapadnięciu, co jest wyraźnie widoczne w postaci ich wklęsłego wyglądu. Sztywność papieru ściernego również wskazuje na to, że jaja mogą być zbyt suche. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem utrzymania zakażonych Wolbachia Ae. aegypti powinien zapewnić, że zdrowe komary o stałej jakości są produkowane do eksperymentów i wypuszczania na otwartym polu. W przeciwieństwie do innych protokołów, które priorytetowo traktują produkcję masowych ilości komarów (patrz odniesienie57), metody koncentrują się na maksymalizacji ich przydatności, zarówno w obrębie pokoleń poprzez wdrożenie złagodzonych warunków chowu, jak i między pokoleniam...

Komary Aedes aegypti są odpowiedzialne za przenoszenie niektórych z najważniejszych arbowirusów na świecie, w tym dengi, Zika i chikungunya1. Wirusy te stają się coraz większym zagrożeniem dla zdrowia na całym świecie, ponieważ powszechne rozprzestrzenianie się Ae. aegypti w tropikach nadal się rozwija2,3,4. Samice Ae. aegypti preferencyjnie żywią się ludzką krwią5 i dlatego mają tendencję do życia w bliskim sąsiedztwie ludzi, szczególnie na obszarach miejskich, gdzie populacje są najgęściej. Dzięki temu ścisłemu powiązaniu z ludźmi przystosowały się również do rozmnażania w sztucznych siedliskach, w tym w oponach, doniczkach, rynnach i zbiornikach na wodę6,7. Ae. aegypti łatwo przystosowują się również do środowisk laboratoryjnych, w których mogą być utrzymywane bez żadnych specjalnych wymagań po zebraniu bezpośrednio z pola, w przeciwieństwie do niektórych innych gatunków z rodzaju Aedes8,9,10. Łatwość ich konserwacji sprawiła, że były szeroko badane w laboratoriach w szerokim zakresie dziedzin, ostatecznie mając na celu kontrolowanie chorób przenoszonych przez komary.
Tradycyjnie, kontrola arbowirusów opiera się głównie na użyciu środków owadobójczych w celu zmniejszenia populacji komarów. Rośnie jednak zainteresowanie podejściami, w których zmodyfikowane komary są hodowane w laboratorium, a następnie wypuszczane do naturalnych populacji. Wypuszczone komary mogą być modyfikowane genetycznie11,12,13, biologicznie14,15, poprzez napromieniowanie16, obróbka chemiczna17,18, lub za pomocą technik kombinowanych19 Albo stłumić populacje komarów, albo zastąpić je komarami, które są odporne na przenoszenie arbowirusów20.
Wolbachia to bakterie, które są obecnie używane jako środek kontroli biologicznej dla arbowirusów. Kilka szczepów Wolbachia zostało niedawno wprowadzonych do Ae. aegypti eksperymentalnie przy użyciu mikroiniekcji embrionalnej21,22,23,24. Szczepy te zmniejszają zdolność arbowirusów do rozprzestrzeniania się i replikacji w komarach, zmniejszając ich potencjał transmisyjny23,25,26,27,28. Zakażenia Wolbachia są przenoszone z matki na potomstwo, jednak niektóre szczepy wywołują bezpłodność, gdy zakażone samce kojarzą się z niezakażonymi samicami22. Samce zakażone Wolbachią mogą być zatem uwalniane w dużych ilościach w celu stłumienia naturalnych populacji komarów, jak ostatnio wykazano u innych gatunków Aedes15,29. Ponieważ jednak Wolbachia hamuje również przenoszenie arbowirusów u Ae. aegypti, komary mogą być również uwalniane w celu zastąpienia rodzimych populacji uboższymi wektorami. Ae. aegypti zakażone eksperymentalnie Wolbachia są obecnie uwalniane do terenu w kilku krajach przy użyciu tego ostatniego podejścia14,30,31.
Oparte na Wolbachii podejścia do kontroli arbowirusów opierają się na solidnym zrozumieniu interakcji między Wolbachią, komarem i środowiskiem. Wolbachia występuje naturalnie u szerokiej gamy owadów, a szczepy wprowadzone do komarów są zróżnicowane pod względem działania32. W związku z tym, że do Ae. aegypti24 wprowadzane są nowe typy infekcji Wolbachia, konieczne jest scharakteryzowanie każdego szczepu pod kątem ich wpływu na kondycję, reprodukcję i interferencję arbowirusową komarów w różnych warunkach. W związku z tym konieczne są rygorystyczne eksperymenty w laboratorium, aby ocenić potencjał szczepów Wolbachia do odniesienia sukcesu w terenie.
Uwolnienia Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia na otwartym polu często mogą wymagać od tysięcy do dziesiątek tysięcy komarów na strefę wypuszczenia do hodowli każdego tygodnia14,30,31. Sukces pierwszych wydań można poprawić, wypuszczając komary o dużych rozmiarach, aby zmaksymalizować ich płodność33 i sukces krycia34,35. Komary powinny być również przystosowane do warunków, z jakimi będą miały do czynienia w terenie, jednak długotrwała hodowla laboratoryjna może powodować zmiany w zachowaniu i fizjologii, które mogą mieć wpływ na wydajność w terenie36,37,38.
Opisujemy prosty protokół hodowli Ae. aegypti w laboratorium przy użyciu podstawowego sprzętu. Protokół ten jest odpowiedni zarówno dla komarów typu dzikiego, jak i zakażonych Wolbachią, przy czym te ostatnie mogą wymagać szczególnej uwagi, ponieważ niektóre szczepy Wolbachia mają znaczący wpływ na cechy historii życia komarów39,40. Warunki chowu pozwalają uniknąć przeludnienia i konkurencji o pożywienie w celu wytworzenia komarów o stałej wielkości, co ma kluczowe znaczenie dla eksperymentów z kompetencjami wektorów i sprawnością oraz zapewnia, że komary są zdrowe do wypuszczenia w terenie41. Podejmujemy również środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji laboratoryjnej i chowu wsobnego, zmniejszając presję selekcyjną i zapewniając, że następne pokolenie jest pobierane z dużej, losowej puli. Jednak środowiska laboratoryjne wyraźnie różnią się od warunków polowych, a długotrwała konserwacja w zrelaksowanych warunkach może zmniejszyć kondycję komarów po wypuszczeniu na pole37,42,43. W związku z tym okresowo krzyżujemy samice z linii laboratoryjnych do samców zebranych w terenie, w wyniku czego powstają kolonie, które są genetycznie podobne do porównań eksperymentalnych i które są dostosowane do docelowej populacji terenowej39. Metody te nie wymagają specjalistycznego sprzętu i mogą być skalowane do hodowli dziesiątek tysięcy osobników tygodniowo w celu wypuszczenia na pole. Protokół nadaje również priorytet przydatności komarów w obrębie pokoleń i między pokoleniami, co jest ważnym czynnikiem w przypadku owadów przeznaczonych do osiedlenia się w naturalnych populacjach. Protokół jest odpowiedni dla większości laboratoriów, które wymagają utrzymania Ae. aegypti, szczególnie w przypadku porównań eksperymentalnych, w których ważna jest stała jakość komarów i odniesienie do terenu.

<table><tbody><tr><td>Dziki typ Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Zebrany z lokalizacji terenowych w Queensland w Australii, zobacz Yeap i inni39 aby uzyskać szczegółowe informacje</td></tr><tr><td>w Mel-infected Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Monash University. Zapoznaj się z Walker and others23 aby uzyskać informacje na temat szczepu</td></tr><tr><td>w Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Monash University. Zapoznaj się z Xi i innymi21 aby uzyskać informacje na temat szczepu</td></tr><tr><td>w zakażonego MelPop Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Monash University. Zapoznaj się z McMeniman i innymi22 aby uzyskać informacje na temat szczepu</td></tr><tr><td>Instant suszone drożdże</td><td>Lowan</td><td></td><td>Stymuluje wylęganie się jaj. Znalezione w ogólnych sklepach spożywczych. Inne marki mogą być używane</td></tr><tr><td>5 L plastikowa wanna</td><td>Kwadrant</td><td>Q110950</td><td>Służy do wylęgu i hodowli larw. Można stosować inne produkty</td></tr><tr><td>Pokarm dla ryb (Tetramin Tropical Tablets)</td><td>Tetra</td><td>16152</td><td>Dostarczany larwom jako źródło pożywienia. Adres internetowy: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE</td></tr><tr><td>Pojemniki plastikowe</td><td></td><td></td><td>Służy do hodowli larw. Każdy plastikowy pojemnik o pojemności powyżej 500 ml powinien być odpowiedni</td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td></td><td></td><td>Służy do przenoszenia larw i poczwarek między pojemnikami. Adres internetowy: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez</td></tr><tr><td>Licznik klikający</td><td>RS Pro</td><td>710-5212</td><td>Służy do pomocy w liczeniu larw, poczwarek i jaj. Adres internetowy: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y</td></tr><tr><td>Tacki hodowlane</td><td>Gratnells</td><td></td><td>Służy do hodowli larw. Adres internetowy: http://www.gratnells.com</td></tr><tr><td>Siatka</td><td></td><td></td> nylonowa <td>Służy do przenoszenia larw i poczwarek do pojemników ze słodką wodą. Mogą być używane inne marki. Adres internetowy: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white</td></tr><tr><td>Klatki</td><td>BugDorm</td><td>DP1000</td><td>Domy dla dorosłych komarów. Można stosować produkty alternatywne. Adres internetowy: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html</td></tr><tr><td>35 ml plastikowy kubek</td><td>Huhtamaki</td><td>AA272225</td><td>Służy do dostarczania wody lub sacharozy dorosłym komarom. Inne marki mogą być używane</td></tr><tr><td>35 ml plastikowa pokrywka do kubka</td><td>Huhtamaki</td><td>GB030005</td><td>Służy do dostarczania sacharozy dorosłym komarom. Można stosować inne marki</td></tr><tr><td>Wata</td><td>Cutisoft</td><td>71841-13</td><td>Wilgotna wata służy jako źródło wody dla dorosłych. Inne marki mogą być używane</td></tr><tr><td>Biały cukier</td><td></td><td></td><td>Dostarczony jako źródło cukru dla dorosłych komarów. Znalezione w ogólnych sklepach spożywczych</td></tr><tr><td>Lina</td><td>M Recht Akcesoria</td><td>C323C/W</td><td>Służy do dostarczania roztworu sacharozy osobom dorosłym. Mogą być używane inne marki. Adres internetowy: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/</td></tr> <tr><td>Plastikowy kubek (duży)</td><td></td><td></td><td>Używany jako pojemnik do składania jaj. Każdy plastikowy kubek, który mieści 100 ml wody, powinien być odpowiedni</td></tr><tr><td>Papier ścierny</td><td>Norton Master Painters</td><td>CE015962</td><td>Dostarczone jako podłoże do składania jaj. Można stosować alternatywne produkty, ale używamy tej marki, ponieważ jest stosunkowo bezwonna. Jaśniejsze kolory są używane dla kontrastu z jajkami. Adres internetowy: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td>Stosowana jako alternatywne podłoże do składania jaj. Inne marki mogą być używane</td></tr><tr><td>: Rękawiczki lateksowe</td><td>SemperGuard</td><td>Z560979</td><td>Zapobiega ukąszeniom komarów na rękach podczas karmienia krwią. Mogą być używane inne marki. Adres internetowy: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/</td></tr></tbody></table>

utrzymywanie komarów aedes aegypti zakażonych wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Komary Aedes aegypti eksperymentalnie zainfekowane Wolbachia są wykorzystywane w programach do kontroli rozprzestrzeniania się arbowirusów, takich jak denga, chikungunya i Zika. Komary zakażone Wolbachią mogą zostać wypuszczone na pole w celu zmniejszenia liczebności populacji poprzez niekompatybilne krzyżowanie lub przekształcenia populacji z komarami, które są odporne na przenoszenie wirusa. Aby te strategie odniosły sukces, komary wypuszczone na pole z laboratorium muszą być konkurencyjne w stosunku do komarów rodzimych. Jednak utrzymywanie komarów w laboratorium może skutkować chowem wsobnym, dryfem genetycznym i adaptacją laboratoryjną, co może zmniejszyć ich przydatność w terenie i może zakłócić wyniki eksperymentów. Aby przetestować przydatność różnych infekcji Wolbachia do zastosowania w terenie, konieczne jest utrzymanie komarów w kontrolowanym środowisku laboratoryjnym przez wiele pokoleń. Opisujemy prosty protokół utrzymywania komarów Ae. aegypti w laboratorium, który jest odpowiedni zarówno dla komarów zakażonych Wolbachią, jak i komarów typu dzikiego. Metody minimalizują adaptację laboratoryjną i wdrażają krzyżowanie w celu zwiększenia znaczenia eksperymentów z komarami terenowymi. Dodatkowo kolonie są utrzymywane w optymalnych warunkach, aby zmaksymalizować ich przydatność do wypuszczania na otwartym polu.

Rycina 4 przedstawia wpływ suboptimalnego odżywienia na rozwój larw Ae. aegypti. W przypadku zapewnienia w pojemnikach 0,25 mg pokarmu na larwę na dobę lub mniej, czas rozwoju wydłuża się zarówno u samców, jak i u samic, a proces ten jest mniej synchroniczny niż w pojemnikach, w których dostarczano 0,5 mg pokarmu. Brak odpowiedniej ilości pokarmu przez cały okres rozwoju larwalnego może negatywnie wpłynąć na harmonogram utrzymania hodowli. Osobniki r...

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opis utrzymania komarów Aedes aegypti zainfekowanych bakterią Wolbachia. Komary te są uwalniane na całym świecie w celu zahamowania transmisji dengi oraz innych wirusów. Nasz protokół hodowli komarów Aedes aegypti może być wykorzystany przez wszystkich badaczy zainteresowanych użyciem komarów w eksperymentach lub programach kontroli chorób.Niniejszą metodę można również wykorzystać do hodowli genetycznie zmodyfikowanych komarów w ramach programów kontroli populacji komarów, w tym tych opartych na uwalnianiu sterylnych owadów. Zasady zastosowane w tym podejściu można odnieść również do hodowli innych gatunków wektorów chorób. W ramach niniejszego protokołu komary należy utrzymywać w temperaturze około 26 °C i wilgotności względnej od 50 do 70% przy równikowym fotoperiodzie.W przypadku hodowli w wyższych temperaturach może dojść do utraty infekcji Wolbachia, dlatego nie należy przegrzewać kolonii. Należy utrzymywać około 500 komarów na populację, aby zminimalizować chów wsobny. Stosowanie niniejszego protokołu przy zapewnieniu odpowiedniego odżywiania pozwoli na uzyskanie generacji 28-dniowych.Zacznij od jaj na podłożu. Zanurz je w kuwetach za

maintaining-aedes-aegypti-mosquitoes-infected-with-wolbachia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy film opisuje metodę oczyszczania Wolbachia pipientis z linii komórkowej Anopheles gambiae, a następnie hodowli tego endosymbionta w medium bezkomórkowym. Przedstawiono również test żywotności bakterii.

Utrzymywanie Wolbachia w medium bezkomórkowym

Aby osiągnąć supresję populacji Aedes aegypti przy użyciu systemu RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal), konieczne jest uwolnienie dużych liczb samców komarów. Wymaga to zastosowania technik i technologii masowej hodowli w celu zapewnienia niezawodnych systemów pozwalających na uzyskanie maksymalnej liczby wysokiej jakości samców komarów.

Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti do wypuszczeń w terenie w Brazylii

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Protokół hodowli pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis. Pasożyt przechodzi z jednego pokolenia komarów Aedes aegypti do następnego poprzez przenoszenie poziome w stadium larwalnym, a następnie przenoszenie pionowe w stadium dorosłym. Żywe sporoplazmy przeżywają długotrwale w zakażonych jajach.

Rozmnażanie pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti

Technika sterylnych owadów (SIT) jest używana do kontrolowania określonych, ważnych z medycznego punktu widzenia populacji komarów, które mogą być odporne na chemiczne kontrole. W tym miejscu opisujemy metodę masowego chowu i przygotowania bezpłodnych samców komarów do wypuszczenia na wolność w operacyjnym programie SIT ukierunkowanym na komara Aedes aegypti.

Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Do wykrywania wewnątrzkomórkowej Wolbachii użyto czterech metod, które wzajemnie się uzupełniały i poprawiały dokładność wykrywania infekcji Wolbachia Aa23 pochodzącej z Aedes albopictus i Aa23-T wyleczonej z rodzimej infekcji Wolbachia za pomocą antybiotyków.

Wykrywanie szczepu Wolbachia wAlbB w liniach komórkowych Aedes albopictus

Obecny protokół opisuje, jak mierzyć dane dotyczące typowych parametrów życia komarów Aedes aegypti, w tym płodności, rozmiaru skrzydeł, płodności, stosunku płci, żywotności, czasu rozwoju, wkładu samców i długowieczności dorosłych. Pomiary te można wykorzystać do oceny przydatności komarów transgenicznych.

Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti

Linie komórkowe są przydatne w badaniach nad organizmami wewnątrzkomórkowymi, które nie mogą być hodowane poza komórkami gospodarza. Chociaż linie zakażone Wolbachią umożliwiły wiele odkryć, niejednorodność w obrębie tych linii może prowadzić do zmiennych wyników eksperymentalnych. Przedstawiamy protokół generowania klonów jednokomórkowych i ciągłych hodowli z komórek JW18 zakażonych Wolbachią.

Generacja kultur monoklonalnych z linii komórkowej Drosophila melanogaster JW18 zakażonej Wolbachią

Poznaj protokół hodowli komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia w celu ograniczenia transmisji wirusa dengi. Metoda obejmuje utrzymanie temperatury 26°C i wilgotności 50-70% dla zdrowych kolonii.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Przeglądaj więcej filmów