Izolacja i charakterystyka pierwotnych komórek śródmiąższowych zastawki szczura: nowy model do badania zwapnienia zastawki aortalnej

Ogólnym celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródmiąższowych zastawki szczura lub VIC w celu zbadania mechanizmów zwapnienia zastawki aortalnej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zwapnienia zastawek, takie jak dlaczego VIC ulegają zwapnieniu i co możemy zrobić, aby zapobiec zwapnieniu tych komórek. Głównymi zaletami tej techniki są dostępność i potencjał do przekształcenia się w linie komórkowe do dalszych badań.

Wszystkie preparacje należy przeprowadzać w wentylowanym okapie uprzednio zdezynfekowanym 70% etanolem, aby zapewnić sterylność próbek i odczynników. Wysterylizuj narzędzia do preparowania poprzez autoklawowanie, a następnie zanurz końcówki narzędzi w zlewce zawierającej 70% etanolu przed użyciem. Namocz narzędzia do preparowania w zlewkach bufora do płukania przed wejściem w kontakt ze zwierzęciem lub tkankami.

Po uboju szczurów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, umieść zwierzę na wznak na szklanej desce do sekcji i zdezynfekuj skórę, spryskując ją 70% etanolem. Aby wyciąć serce, wykonaj czterocentymetrowe nacięcie w linii środkowej szczura za pomocą nożyczek preparacyjnych, aby odsłonić jamę brzuszną, i ostrożnie usuń klatkę piersiową i płuca, aby odsłonić serce. Usuń serce ostrymi nożyczkami.

Przechowuj wypreparowane serce w lodowatym buforze do mycia, aż wszystkie poważne sekcje szczurów zostaną zakończone. Aby przeprowadzić mikrosekcję każdego serca, przenieś wypreparowane serce na szalkę Petriego pokrytą buforem do mycia. Przytnij mięsień sercowy za pomocą prostych nożyczek sprężynowych, aby był w lewo z niewielkim obszarem otaczającym aortę wstępującą i korzeń aorty.

Używając tych samych sprężynowych nożyczek prostych, ostrożnie rozetnij aortę wstępującą w kierunku lewej komory i odsłoń płatki zastawki aortalnej. Następnie przenieś otwartą aortę na świeżą sterylną szalkę Petriego wypełnioną zrównoważonym roztworem soli Hanka. Wypreparuj płatki zastawki aortalnej oznaczone ich unikalnym kształtem litery U u podstawy aorty za pomocą nożyczek Vannas.

Przechowuj wszystkie ulotki w jednym mililitrze lodowatego buforu do mycia w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki, aż wszystkie rozbiory zostaną zakończone. Po zebraniu wszystkich listków odwiruj je w sile 100 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć bufor do mycia. Aby usunąć komórki śródbłonka zastawki lub VEC, trawić ulotki w 100 mikrolitrach po 425 jednostek na mililitr kolagenazy II przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zakłócić trawienie, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów. Wirować przy 100 g przez 30 sekund, aby granulować ulotki. Po ostrożnym odrzuceniu supernatantu przemyć ulotki 500 mikrolitrami buforu do przemywania i ponownie granulować komórki przez odwirowanie przy 100 g przez 30 sekund.

Aby zebrać VIC z ulotek, trawić 100 mikrolitrami kolagenazy II przez 1,5 do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uwolnij VICs, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Rozcieńczyć kolagenazę II w 19 mililitrach pożywki hodowlanej i odwirować przy 670 g przez pięć minut, aby osadzać VIC i pozostałe resztki ulotki zaworu.

Po odrzuceniu supernatantu przenieść ulotki i VIC na płytki lub kolby hodowlane. Hoduj VIC przez pięć do siedmiu dni w pożywce hodowlanej, aż do osiągnięcia zbiegu w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% CO2, zmieniając pożywkę po 72 godzinach. Aby przygotować pierwotne VIC szczurów do eksperymentów zwapnienia in vitro, należy wysiać komórki o gęstości 150 000 komórek na studzienkę na płytkach sześciodołkowych.

Utrzymuj komórki w pożywce hodowlanej do momentu uzyskania ponad 90% zgryzu. Potraktuj VIC wapnieniem w porównaniu z pożywką kontrolną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% CO2 przez dodatkowe 72 godziny. W celu zbadania zwapnionych pierwotnych VIC szczurów do dalszych analiz należy usunąć pożywkę zwapnieniową lub kontrolną.

Przemyć monowarstwy buforem do przemywania w celu usunięcia niezwiązanych jonów wapnia i fosforanu przed wykonaniem charakterystyki VIC szczura, jak wyszczególniono w protokole tekstowym. W przypadku badań zwapnienia VIC u szczurów należy wybarwić monowarstwy komórek 5% roztworem Alizaryny Red S, delikatnie kołysząc na wytrząsarce przez 20 minut. Następnie przemyj trzy razy wodą destylowaną przez pięć minut za każdym razem.

Aby określić ilościowo depozycję wapnia, użyj zestawu do biochemicznego oznaczania wapnia. Wypijaj jony wapnia za pomocą 0,6-molowego kwasu solnego przez 24 godziny w czterech stopniach Celsjusza, delikatnie mieszając. Zebrać sklarowany osad i zmierzyć stężenie wapnia za pomocą zestawu do oznaczania wapnia zgodnie z wytycznymi producenta.

Na koniec oblicz stężenie wapnia jako frakcję całkowitego białka komórkowego, jak opisano w protokole tekstowym. Fenotyp VIC wyizolowanych komórek potwierdzono za pomocą immunofluorescencji, sondowania markerów VIC, wimentyny i aktyny alfa mięśni gładkich. Dodatkowo za pomocą analizy PCR potwierdzono ekspresję regulatora wzrostu VIC, tkankowego czynnika wzrostu beta-1 i 2.

Przeprowadzono również analizę Western blot w celu sprawdzenia, czy VIC szczurów były ujemne dla markera komórek śródbłonka CD 31, przy użyciu VEC mitralnych psów jako kontroli pozytywnej. Szczurze VIC były narażone na podwyższony poziom wapnia i fosforanów, który naśladuje patologiczne stany hiperkalcemii i hiperfosfatemii. Traktowanie VIC zwapnieniem wywołanym wapniem i fosforanami, zgodnie z oznaczeniem barwienia czerwienią alizarynową w celu osadzania wapnia i kolorymetrycznego oznaczania poziomów wapnia po wymywaniu kwasem solnym.

Leczenie VIC wapniem i fosforanem spowodowało znaczny wzrost ekspresji mRNA markerów osteogennych MSX2, ALPL i PHOSPHO1. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, z wyłączeniem trawienia przez 18 płatków zastawek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapewnić sterylność podczas sekcji i trawienia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować pierwotne VIC szczurów i używać ich do badania mechanizmów stojących za zwapnieniem VIC. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa i analiza mikroskopowa, w celu zbadania fizjologii i zachowania VIC. Po opracowaniu technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się badaniami sercowo-naczyniowymi do zbadania mechanizmów klasyfikacji zastawek aortalnych u ludzi przy użyciu modelu szczurzego.