Name: Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę rejestracji elektrofizjologicznej z pojedynczych sensillów trichoidowych u Drosophila w odpowiedzi na niskolotne feromony. Technika umożliwia badanie aktywności neuronów receptorowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Ye Zhangowi za pomoc przy próbkach i Tin Ki Tsang za pomoc przy zdjęciach. Praca ta została wsparta przez Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award oraz grant NIH (R01DC015519) dla C.-Y.S. oraz granty NIH (R01DC009597 i R01DK092640) dla J.W.W.

1. Przygotowanie sprzętu do nagrywania at4
<ol>
	<li>Za pomocą ściągacza do pipet przygotuj elektrody z kapilarami ze szkła glinokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1.0 mm, średnica wewnętrzna 0.64 mm). Lekko stępić końcówkę elektrody referencyjnej parą cienkich kleszczy, aby ułatwić wprowadzenie do clypeusa muchy (tj. zaokrąglonej płytki z przodu głowy muchy, nad aparatem gębowym). 
	UWAGA: W badaniu wykorzystano 7-dniowe samce WT (Berlin). Użyj roztworu soli fizjologicznej AHL14 jako elektrolitu dla obu elektrod.</li>
	<li>Przygotuj 1 l AHL, mieszając 900 ml wody destylowanej z 6,312 g NaCl, 0,373 g KCl, 0,337 g NaHCO3, 0,1120 g NaH2PO4, 1,892 g trehalozy ּ2H2O, 3,423 g sacharozy, 1,192 g HEPES i 8,2 ml 1M MgCl2. Używając wody destylowanej, zwiększyć całkowitą objętość do 1 l. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 N NaOH i wysterylizować roztwór za pomocą systemu filtrów napędzanych próżnią. W przypadku długotrwałego przechowywania porcje AHL należy przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Stałe dostawy kwasu oleopalmitynowego są uzależnione od jednorodności między wkładami. Bardzo ważne jest, aby każdy wkład był zmontowany w sposób powtarzalny.</li>
	<li>Za pomocą żyletki usuń 0,9 cm z końcówki końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby utworzyć pierwszą sekcję wkładu o wymiarach 4,1 cm; zapoznaj się z wymiarami wyszczególnionymi w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. Użyj kolejnej końcówki pipety o pojemności 200 μl i usuń odpowiednio 1,7 cm i 1,5 cm z końcówki i podstawy, aby utworzyć drugą sekcję wkładu o wymiarach 1,8 cm (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 1A). Użyj linijki, aby zapewnić powtarzalność.</li>
	<li>Użyj dziurkacza 1/8", aby wyciąć krążki z bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy umieść krążek z bibuły filtracyjnej na końcu drugiej sekcji wkładu. Upewnij się wzrokowo, że w końcówce wkładu znajduje się otwór, przez który może przepływać powietrze.</li>
	<li>Połącz ze sobą pierwszą i drugą sekcję wkładu, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A. Ustaw drugą sekcję naboju pod kątem w dół, aby ułatwić prostopadłe celowanie w przygotowanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Połączyć wkład z rurką doprowadzającą zapachy, która jest zamontowana na mikromanipulatorze. 
	UWAGA: Ta konstrukcja umożliwia obracanie wkładu na zewnątrz w celu ułatwienia wymiany (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Ustaw stały przepływ nawilżonego powietrza na 2 l/min w jednym regulatorze masy, a przepływ nawaniacza na 500 ml/min w innym regulatorze masy.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania (patrz tabela materiałów), zaprogramuj procedurę podawania 500 ms zaciągnięcia się zapachem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów odorantu kwasu oleopalmitynowego do dostawy
UWAGA: Orn-y Or47b reagują zarówno na kwas cis-, jak i trans-palmitynowy. Ponieważ kwas oleopalmitynowy jest niestabilny w temperaturze pokojowej, zapasy są przechowywane w temperaturze -20 °C i zużywane w ciągu miesiąca od otwarcia. Etanol jest rozpuszczalnikiem z wyboru dla kwasu oleopalmitynowego.
<ol>
	<li>Za pomocą mieszalnika wirowego dokładnie wymieszaj 10 μl bulionów lub rozcieńczeń kwasu cis- lub trans-palmitynowego z 90 μl 100% etanolu w celu dziesięciokrotnego seryjnego rozcieńczenia w mikroprobówkach o pojemności 1,7 ml. Codziennie przed eksperymentami należy przygotowywać świeże roztwory kwasu oleopalmitynowego i zużyć w ciągu jednego dnia. 
	UWAGA: W przypadku substancji zapachowych, które nie są rozpuszczalne w etanolu, zalecana jest szklana fiolka do przygotowywania rozcieńczeń zapachowych z innymi rodzajami rozpuszczalników organicznych.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety P10 nanieść 5 μl roztworów kwasu cis-palmitynowego o pożądanych rozcieńczeniach na bibułę filtracyjną w każdym odpowiednim wkładzie. 
	UWAGA: Najwyższa dawka (10-1) zawiera 450 μg związku. W przypadku roztworów kwasu trans-palmitynowego należy zamiast tego zastosować 4,5 μl, tak aby najwyższa dawka (10-1) zawierała również 450 μg związku.</li>
	<li>Aby całkowicie odparować rozpuszczalnik, należy umieścić wkłady z kwasem oleopalmitynowym w eksykatorze próżniowym na 1 godzinę przy temperaturze pokojowej i ciśnieniu 7,59 mmHg. 
	UWAGA: Wkłady mogą być używane do 4 godzin przy RT.</li>
</ol>
3. Przygotowanie Drosophila do szybkiego dostępu do at4 Sensilla do nagrań elektrofizjologicznych in vivo 
UWAGA: Muchy WT (Berlin) są hodowane na standardowym podłożu z mąki kukurydzianej w temperaturze 25°C w cyklu 12:12 jasno-ciemnym. Po eklacji muchy są dzielone według płci na grupy po dziesięć, przy czym są trzymane w grupach do 7 dnia życia. Or47b ORN zarówno u samców, jak i samic much reagują na kwas oleopalmitynowy. Dla uproszczenia w obecnym badaniu badane są tylko samce much.
<ol>
	<li>Zamontuj szkiełko do przygotowywania much: na szkiełku podstawowym umieść szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm2) na niewielkiej ilości plasteliny, tworząc ze szkiełkiem pod kątem ~3°. Umieść taśmę dwustronną na wewnętrznej krawędzi szkiełka nakrywkowego i na obszarze szkiełka bezpośrednio poniżej. Wymień na nową taśmę na każdy dzień nagrywania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Użyj aspiratora muchowego15, aby zebrać interesującą muchę w przewodach, a następnie umieść końcówkę pipety o pojemności 200 μl na końcu rurki. Jednocześnie przesuń rurkę do przodu, jednocześnie wdmuchując powietrze do rurki, aby popchnąć muchę do końca końcówki pipety. Użyj żyletki, aby ciąć tuż pod ciałem muchy i 2 długości głowy nad muchą.</li>
	<li>Ubij spód końcówki pipety plasteliną, popychając muchę w górę, aż zarówno czułki, jak i clypeus zostaną odsłonięte (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Aby uniknąć zabicia muchy, dodaj tylko tyle gliny, aby odsłonić czułki i aristae, ponieważ zapobiega to zmiażdżeniu brzucha muchy. Ponadto dodawaj glinkę powoli i delikatnie, aby zapobiec nagłemu zwężeniu. Upewnij się, że mucha żyje, sprawdzając ruch anteny lub trąbki.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby manewrować końcówką pipety, w której znajduje się mucha. Ustaw głowę tak, aby clypeus był skierowany w prawo od obserwatora. Wyreguluj przygotowanie wzdłuż szkiełka nakrywkowego za pomocą drobnych kleszków, aż boczna strona anteny będzie przylegać do przyklejonej taśmą powierzchni szkiełka nakrywkowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Umieść pręt przytrzymujący na aristę, aby przymocować antenę do taśmy dwustronnej, aby zapobiec ruchowi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Pręt przytrzymujący jest wyciągany z kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do pipet i utrzymywany w pozycji za pomocą plasteliny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Umieść preparat na stoliku zestawu (Rysunek 2C). Za pomocą mikroskopu upewnij się, że trychoidy są widoczne wzdłuż dystalno-bocznej krawędzi trzeciego segmentu anteny. 
	UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby sensilla była wyraźnie zarysowana na tle, co upraszcza ich identyfikację i ułatwia nagrywanie (Rysunek 3). W tym preparacie większość dostępnych sensilli trichoidowych jest typu at4.</li>
	<li>Utrzymuj preparat pod stałym, nawilżonym strumieniem powietrza (2 l/min) dostarczanym przez oddzielną rurkę doprowadzającą powietrze z odległości około 2 cm od przygotowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4), jak opisano wcześniej2,15.</li>
</ol>
4. Rejestracja aktywności at4 Sensillum z Ornów Orn Orn w at4 Trichoids w odpowiedzi na kwas palmitynowy
<ol>
	<li>Włóż elektrodę referencyjną do clypeusa (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A). Aby uniknąć uszkodzenia tkanki, upewnij się, że elektroda jest umieszczona tuż pod powierzchnią, gdzie może stykać się z hemolimfą pod naskórkiem, szybkim i płynnym ruchem.</li>
	<li>Powoli opuszczaj elektrodę rejestrującą, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie view, co czujnik docelowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Nagrywaj pod obiektywem 50x. 
	UWAGA: Twardy naskórek trychoidalny wymaga włożenia elektrody rejestrującej do podstawy czujnika, której szerszy obszar zapewnia większy cel, co zmniejsza prawdopodobieństwo odchylenia elektrody (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B, wstawka).</li>
	<li>Przed zastosowaniem bodźców zapachowych do czułki należy przestrzegać następujących kryteriów wyboru; każdy trichoid, który nie spełnia tych norm, powinien zostać odrzucony, a zamiast niego powinien zostać wybrany inny sensilum.
	<ol>
		<li>Zwróć uwagę na wysoki stosunek sygnału do szumu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3C dla przykładu).</li>
		<li>Obserwuj możliwe do zidentyfikowania kolce z neuronów at4A i at4C (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). 
		UWAGA: Warto zauważyć, że amplituda skoku at4B wydaje się bardzo podobna do at4A10 i nie można jej łatwo zidentyfikować bez stymulacji zapachem.</li>
		<li>Zauważ, że podstawowa szybkość wypalania neuronów at4A wynosi około lub mniej niż 20 Hz. 
		UWAGA: To kryterium jest specyficzne dla at4A, ponieważ podstawowa szybkość wypalania neuronu jest wyższa niż w przypadku bazikonicznego ORNs2. Znacznie wyższe wypalanie podstawowe wskazuje, że neurony mogły zostać uszkodzone podczas wprowadzania elektrod.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz wkład do rurki doprowadzającej nawaniacz. Zacznij od kontroli rozpuszczalnika, a następnie środków zapachowych, od niskich do wysokich stężeń. Użyj mikromanipulatora, aby manewrować wkładem w kierunku preparatu, jednocześnie kierując wkład prosto w głowicę preparatu. Wizualnie potwierdź, że wkład jest skierowany bezpośrednio na antenę (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) z odległości kilku milimetrów. 
	UWAGA: Celem jest zorientowanie otworu wkładu bezpośrednio na antenę i umieszczenie go w bliskiej odległości od tkanki docelowej.</li>
	<li>Upewnij się, że wkład nawaniający jest oddzielony od elektrody rejestrującej po jej prawej stronie na 1 - 2 mm, a od szkiełka przygotowawczego poniżej na około 1 mm. 
	UWAGA: W opisanej tutaj konfiguracji wkład nawaniający jest ściśle otoczony elektrodą rejestrującą, elektrodą odniesienia i szkiełkiem do przygotowania lotu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4). 
	UWAGA: Zwróć uwagę na odległość między wkładką a elektrodami nagrywającymi/referencyjnymi. Zalecana jest odległość około 4 mm1. Niezamierzony kontakt może przerwać sygnał i złamać końcówkę elektrody rejestrującej, uszkadzając neuron prądu i komplikując dalsze nagrania. 
	UWAGA: Weź pod uwagę odległość między wkładem a szkiełkiem do przygotowania muchy. Dotknięcie szkiełka nakrywkowego może również spowodować przemieszczenie elektrody nagrywającej, aby zakłócić nagranie.</li>
	<li>Naciśnij "Nagraj" w oprogramowaniu do akwizycji danych, aby rozpocząć nagrywanie. 
	UWAGA: Na każde nagranie trwające 10 sekund pojedynczy impuls zapachowy o długości 500 ms jest dostarczany bezpośrednio do anteny, jak opisano w kroku 1.9.</li>
	<li>Po nałożeniu środka zapachowego należy ostrożnie wycofać wkład przed zastąpieniem go wkładem o kolejnym najwyższym stężeniu. Kontynuuj, aż do uzyskania całego zakresu dawkowania. 
	UWAGA: Zaleca się, aby z każdej muchy rejestrować tylko jeden Or47b ORN, aby uniknąć ewentualnych skutków adaptacji.</li>
	<li>Dokładnie wypłucz elektrodę nagrywającą wodą destylowaną po zakończeniu nagrywania na cały dzień.</li>
	<li>Analizuj i wykreślaj dane za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do analizy offline.</li>
</ol>

<ol><li>Lin, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li>
<li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li>
<li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li>
<li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li>
<li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li>
<li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li>
<li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546(2013).</li>
<li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+USA%22%5BJournal%5D)">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li>
<li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+A%22%5BJournal%5D)">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li>
<li>Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+back+or+front%3A+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy procedurę, za pomocą której można silnie indukować i rejestrować odpowiedzi Or47b ORN na kwas oleopalmitynowy. Zmodyfikowaliśmy konwencjonalną metodę dostarczania zapachów na duże odległości 2,7,10, aby rozwiązać problem niewystarczającego dostarczania feromonów. Rozwiązaliśmy problem niskiej lotności nawaniacza, dostarczając związek za pośrednictwem wkładów zapachowych, których otwory znajdują się w odl...

Drosophila ORN reagują na ogromną liczbę substancji zapachowych, o bardzo różnych długościach łańcuchów węglowych i różnych grupach funkcyjnych, w tym estry, alkohole, ketony, laktony, aldehydy, terpeny, kwasy organiczne, aminy, związki siarki, heterocykliczne i aromatyczne2,3. Substancje zapachowe różniące się cechami fizykochemicznymi mogą mieć wyraźnie różną lotność, na co wskazuje prężność pary związku. Warto zauważyć, że biologicznie istotne substancje zapachowe dla Drosophila melanogaster różnią się znacznie pod względem lotności. Na przykład ORN Ir92a reagują na amoniak4, który jest bardzo lotny, z prężnością pary 6 432 mmHg w temperaturze 20 °C. Natomiast Or67d ORN reagują na męski feromon, octan cis-vaccenylu (cVA)5,6, którego prężność pary wynosi 43 mmHg w temperaturze 20 °C.
Badanie reakcji węchowej na zapachy o niskiej lotności jest szczególnie trudne przy konwencjonalnych metodach dostarczania zapachów, w których zapachy są dostarczane za pośrednictwem strumienia powietrza nośnego na stosunkowo dużą odległość (tj. kilka centymetrów). W związku z tym zgłaszane reakcje węchowe na dany zapach o niskiej lotności mogą się znacznie różnić, w zależności od konstrukcji systemu dostarczania zapachu. Na przykład, zgłoszona odpowiedź Or67d ORN na wysoką dawkę cVA waha się od ~407 - >200 spikes/s6. Co więcej, nieskuteczne dostarczanie cVA konwencjonalnymi metodami dostarczania jest prawdopodobnie przypisywane fałszywie ujemnym wynikom, co prowadzi do interpretacji, że cVA samo w sobie nie jest wystarczające do aktywacji Or67d ORNs8. Interpretacja ta została później zakwestionowana w innym badaniu wykorzystującym metodę dostarczania zapachów z bliskiej odległości9. W związku z tym konieczne jest opracowanie solidnego systemu dostarczania zapachów w celu skutecznej prezentacji substancji zapachowych o niskiej lotności.
Ostatnio zidentyfikowaliśmy kilka długołańcuchowych kwasów tłuszczowych jako ligandy dla Ornów Or47b. Są one umieszczone w typie 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Wśród długołańcuchowych substancji zapachowych kwasów tłuszczowych odkryliśmy, że kwas oleopalmitynowy działa jako feromon afrodyzjakalny, który sprzyja męskim zalotom poprzez aktywację Or47b ORNs1. Jednak w innym badaniu wykorzystującym konwencjonalną metodę dostarczania zapachu wykazano, że laurynian metylu wywołuje odpowiedzi z Or47b ORN, podczas gdy kwas palmitynowy nie wywołuje żadnej odpowiedzi, gdy jest prezentowany z tej samej odległości10. W porównaniu z cVA, długołańcuchowe kwasy tłuszczowe są jeszcze mniej lotne, a prężność par jest mniejsza niż 0,001 mmHg przy 25 °C11. Z natury niska lotność długołańcuchowych substancji zapachowych kwasów tłuszczowych, która uniemożliwia skuteczne dostarczanie zapachów do anteny za pomocą konwencjonalnych systemów dostarczania zapachów, prawdopodobnie odpowiadała za fałszywie ujemne wyniki10. Ta niespójność uwypukla nieadekwatność konwencjonalnych systemów dostarczania zapachów do prezentowania substancji zapachowych o niskiej lotności. Wcześniej wykazano, że skuteczne dostarczanie zapachów kutykularnych muchy wymaga bliskiej odległości między źródłem zapachu a tkanką docelową 6. W związku z tym, aby w pełni scharakteryzować działanie biologicznie aktywnych feromonów, jednocześnie naśladując odległość, z której prawdopodobnie napotykają je muszki owocowe w naturze12,13, zgodziliśmy się, że minimalna odległość musi mieć wysoki priorytet w naszej procedurze.
Nasza metoda ma dalsze zalety, w tym kompatybilność ze standardowymi urządzeniami i technikami elektrofizjologicznymi. Istniejące konfiguracje platform wymagają minimalnej modyfikacji w celu dostosowania do tego protokołu, a większość kroków SSR wymaga tylko niewielkich korekt. To sprawia, że nasza technika jest łatwo dostępna dla badaczy mających doświadczenie w SSR. Co więcej, nasza technika pozwala na prezentację zapachów o niskiej lotności z ostrym początkiem i przesunięciem, korelując dostarczanie bodźców z reakcją neuronalną. Wreszcie, układ sprzętowy ułatwia szybką wymianę między wkładami nawaniającymi, przyspieszając gromadzenie danych w żądanym zakresie dawkowania.
Zaczynamy od przeglądu przygotowania elektrod referencyjnych i rejestrujących, roztworu podobnego do hemolimfy dla dorosłych (AHL), wkładów doprowadzających nawaniacz i odpowiedniego olfaktometru. Następnie omawiamy przygotowanie roztworów odorantu kwasu oleopalmitynowego, a następnie przygotowanie muchy do nagrywania. Przystępujemy do rozważenia kryteriów wyboru czujnika trychoidalnego do rejestracji i dokładniejszego zbadania położenia wkładu nawaniającego przed przedstawieniem reprezentatywnych danych uzyskanych tą metodą. Na koniec zapoznajemy się z przydatnymi zastosowaniami tej techniki, niektórymi napotkanymi problemami i ich rozwiązaniami.

<table><tbody><tr><td>Przygotowanie i konfiguracja Różne materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przyrząd do ściągania pipet&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Ściągacz do pipet</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>do produkcji prętów mocujących</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła glinokrzemianowego&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>do produkcji elektrod</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost</td><td>Fisher Scientific Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>do stacji przygotowania do lotu</td></tr><tr><td>Stała taśma dwustronna</td><td>Scotch St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>do stacji przygotowania do lotu</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus Shinjuku, Tokio, Japonia</td><td>BX51</td><td>do montażu na stanowisku</td></tr><tr><td>nagraniowym Plastalina modelina</td><td>Van Aken North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>do stacji przygotowawczej i do stabilizacji pręta mocującego</td></tr><tr><td>Szybkoprzepływowa sterylna jednorazowa jednostka filtrująca z membraną SFCA, 0,45 mm</td><td>Nalgene Rochester NY USA#</td><td>156-4045</td><td>do sterylizacji roztworu AHL</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały nabojowe</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </mocny></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 i mikro; L końcówka do pipet&nbsp;</td><td>VWR Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>do produkcji wkładów zapachowych i przygotowania do muchy</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>do produkcji wkładów zapachowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Suszarka próżniowa&nbsp;</td><td>Cole-Parmer Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>do odparowania rozpuszczalnika etanolowego</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Materiały zapachowe</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </silny></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas cis-palmitynowy</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI</td> <td>USA#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b nawaniacz</td></tr><tr><td>kwasu transpalmitynowego</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI, USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b nawaniacz</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&nbsp; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>do rozcieńczenia kwasu palmitynowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Rig Materiały montażowe</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inwoonate Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>do pozycjonowania oprogramowania olfaktometru</td></tr><tr><td>Flow Vision&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Alicat Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>do sterowania natężeniem przepływu</td></tr><tr><td>Regulator masy</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>do sterowania natężeniem przepływu nawilżanego powietrza</td></tr><tr><td>Regulator masy</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>do sterowania natężeniem przepływu w celu stymulacji zapachu</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td></tr><tr><td>Rura doprowadzająca powietrze</td><td>Ace Glass Vineland NJ USA</td><td>8802-936&nbsp;</td><td>do dostarczania nawilżonego powietrza</td></tr><tr><td>Soczewka obiektywowa 50x&nbsp;</td><td>Olympus Shinjuku, Tokio, Japonia</td><td>LMPLFL50X</td><td>platforma rejestracyjna</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy impulsów&nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>oprogramowanie do analizy danych&nbsp;</td></tr><tr><td>Monitor audio</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Słuchowo zgłasza indywidualne skoki</td></tr><tr><td>Wzmacniacz zewnątrzkomórkowy</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>w celu zwiększenia amplitudy sygnałów elektrycznych</td></tr><tr><td>Sterownik zaworu</td><td>Warner Instruments&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>VC-8</td><td>do sterowania otwarciem zaworu w celu stymulacji zapachu</td></tr><tr><td>Elektroda rejestrująca Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>do pozycjonowania elektrody nagrywającej</td></tr><tr><td>Wzmacniacz czołowy</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>do zwiększania amplitudy sygnałów elektrycznych</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Tektronix Beaverton OR USA</td><td>TDS2000C</td><td>Wizualny raport poszczególnych skoków</td></tr></tbody></table>

zapis elektrofizjologiczny z drosophila trichoid sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Owady polegają na swoim węchu, aby kierować szerokim zakresem zachowań, które są kluczowe dla ich przetrwania, takich jak poszukiwanie pożywienia, unikanie drapieżników, składanie jaj i krycie. Niezliczone substancje chemiczne o różnej lotności zostały zidentyfikowane jako naturalne substancje zapachowe, które aktywują neurony receptorów węchowych owadów (ORN). Jednak badanie reakcji węchowych na zapachy o niskiej lotności było utrudnione ze względu na niezdolność do skutecznego prezentowania takich bodźców przy użyciu konwencjonalnych metod dostarczania zapachów. W tym miejscu opisujemy procedurę, która pozwala na skuteczną prezentację substancji zapachowych o niskiej lotności do zapisu in vivo Single-Sensillum (SSR). Minimalizując odległość między źródłem zapachu a tkanką docelową, metoda ta pozwala na zastosowanie biologicznie istotnych, ale dotychczas niedostępnych substancji zapachowych, w tym kwasu oleopalmitynowego, feromonu stymulującego o udowodnionym wpływie na ORN zaangażowane w zaloty i zachowania godowe1. Nasza procedura otwiera zatem nową drogę do oznaczania wielu substancji zapachowych o niskiej lotności do badania węchu owadów i komunikacji feromonów.

Naszą technikę z powodzeniem zastosowano do określenia względnej skuteczności izomerów trans (Rysunek 5A) oraz cis (Rysunek 5B) kwasu palmitolowego. Reprezentatywne dane wykazują, że kwas trans-palmitolowy jest skuteczniejszym ligandem dla neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) Or47b w porównaniu z izoformą cis (Rysunek 5C). Z każdej muchy rejestrowano sygnał z ...

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Ogólnym celem tej techniki jest skuteczne przedstawienie neuronom receptorów węchowych i muszki substancji zapachowych o niskiej lotności w celu rejestracji elektrofizjologicznej. Neurony te znajdują się w czubku trychoidalnym i reagują na feromony kutykularne o długich łańcuchach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komunikacji feromonów owadów, zapewniając lepszą technikę dostarczania zapachu.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na skuteczne zaprezentowanie substancji zapachowych, które wcześniej były niedostępne ze względu na ich niską lotność, podczas rejestracji in vivo. W szczególności feromony są prezentowane z bliskiej odległości, które symulują zasięg między zalecającymi się samcami a samicami. Przygotowanie wkładu doprowadzającego zapach do nagrań AT4 rozpoczyna się od usunięcia 0,9 centymetra z wąskiego końca końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Następnie z drugiej końcówki pipety usuń 1,7 centymetra od wąskiego końca i 1,5 centymetra od szerokiego końca, aby uzyskać długość 1,8 centymetra. Następnie za pomocą kleszczy umieść krążek bibuły filtracyjnej o średnicy 1/8 cala na końcu odcinka 1.8 centymetra. Pozostaw mały

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule wideo opisujemy nową metodę umożliwiającą tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnych i kontrolowalnych geometriach. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do wykrywania wad węchu (całkowitej i częściowej anosmii) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowań chemotaktycznych.

Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

W tym filmie żywa mucha Drosophila jest zamontowana w tubie do badań elektrofizjologicznych. Elektrody są umieszczone u podstawy czułki, aby rejestrować specyficzne odpowiedzi neuronalne na feromony za pomocą neuronów receptorów węchowych muchy.

Zapisy elektrofizjologiczne z Drosophila sensilla w odpowiedzi na lotne substancje zapachowe

Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Automatyczny system śledzenia Flywalk jest używany do wysokorozdzielczego oznaczania ilościowego zachowania kierowanego zapachem u Drosophila melanogaster.

Kwantyfikacja zachowania kierowanego zapachem w wysokiej rozdzielczości u Drosophila melanogaster przy użyciu paradygmatu Flywalk

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół dla pojedynczych nagrań sensillum z sensilla basiconica na palpach aparatów gębowych owadów.

Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica

Rzadko stosowana metoda zapisu elektrofizjologicznego, zapis podstawowy, pozwala na analizę cech kodowania smaku, które nie mogą być zbadane konwencjonalnymi metodami zapisu. Zapis bazowy pozwala również na analizę reakcji smakowych na bodźce hydrofobowe, których nie można zbadać tradycyjnymi metodami elektrofizjologicznymi.

Zapis podstawowy: technika analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila

Poznaj metodę rejestracji elektrofizjologicznej z pojedynczych sensillów trichoidowych u Drosophila w odpowiedzi na niskolotne feromony. Technika umożliwia badanie aktywności neuronów receptorowych w czasie rzeczywistym.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Przeglądaj więcej filmów