Name: Stworzenie cennego naśladownictwa choroby Alzheimera w szczurzym modelu zwierzęcym poprzez wstrzyknięcie do komory mózgowej złożonego białka beta amyloidu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modelu choroby Alzheimera u szczurów poprzez wstrzyknięcie do komory mózgowej Aβ25-35 z chlorkiem glinu i TGF-β1. Technika umożliwia ocenę upośledzenia pamięci przestrzennej i zmian patologicznych neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt był wspierany przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Hebei (nr C2009001007, H2014406048), Administrację Tradycyjnej Medycyny Chińskiej prowincji Hebei (nr 05027) oraz Projekt Budowy Kluczowego Przedmiotu Kolegium Prowincjonalnego Hebei, Chiny.

Procedura ta była zgodna z Regulacjami w zakresie obsługi zwierząt doświadczalnych wydanymi przez Państwową Komisję Nauki i Technologii Chin 31 października 1988 r.1. Naukowcy powinni przestrzegać wytycznych ustanowionych i zatwierdzonych przez swoje instytucjonalne i krajowe organy regulacyjne ds. zwierząt.
UWAGA: Zwierzęta i odczynniki: Do eksperymentu dostarczono czteromiesięczne samce szczurów Sprague-Dawley (30-350 g). Wszystkie szczury przebywały w grupach (po cztery lub pięć w klatce) w temperaturze 23 ± 1 °C przy 12-godzinnym cyklu światła i ciemności. Pożywienie i woda były dostępne ad libitum. Przed przeprowadzeniem procedury szczury poddano aklimatyzacji do warunków bytowych przez 7 dni. Aβ25-35 rozpuszczono w 1% DMSO w soli fizjologicznej do stężenia 1 mg/mL, a następnie poddano sonikacji przez 5 min w oscylatorze ultradźwiękowym aż do całkowitego rozpuszczenia. AlCl3 oraz RHTGF-β1 rozpuszczono w soli fizjologicznej w stężeniach odpowiednio 1% i 0,1 mg/mL. Czerwień Kongo, azotan srebra oraz pozostałe odczynniki chemiczne były stopnia analitycznego i zostały zakupione z powszechnych źródeł komercyjnych.
1. Procedura chirurgiczna
Uwaga: 20 samców szczurów Sprague-Dawley otrzymało mikroiniekcje z kompozytowego Aβ do komory bocznej oraz przednio-grzbietowego jądra wzgórza i zostało przypisanych do grupy traktowanej kompozytowym Aβ. Kolejne 20 szczurów poddano tej samej procedurze, jednak otrzymały one mikroiniekcję z 0,1% DMSO w soli fizjologicznej i zostały przypisane do grupy pozorowanej.
<ol>
	<li>Zanestezuj szczury 10% izofluranem drogą wziewną, a następnie unieruchom je w aparacie stereotaktycznym do mózgu szczura.</li>
	<li>Wygoń futro na szczycie głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych i zdezynfekuj jodoborem. Następnie przykryj głowę jednorazowym ręcznikiem chirurgicznym.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry głowy wzdłuż pośrodkowej linii podłużnej sklepienia czaszki za pomocą skalpeli chirurgicznych i nożyczek.</li>
	<li>Oddziel tkankę podskórną i powięź, przemyj sklepienie czaszki sterylną suchą watą w celu zatamowania krwawienia i zaznacz bregma za pomocą pisaka.</li>
	<li>Skorzystaj z mapy stereotaktycznej mózgu szczura12; przyjmując bregma jako punkt zero, wyznacz trzy punkty: jądro przedgrzbietowe wzgórza (ad) (tylny (P): 2,0 mm od bregma; boczny (L): 1,4 mm od linii środkowej) do wstrzyknięcia RHTGF-β1 i zamocowania jednej śruby, obszar komory bocznej (LV) (tylny (P): 0,8 mm od bregma; boczny (L): 2,0 mm od linii środkowej) do wstrzyknięcia Aβ25-35 i AlCl3 oraz miejsce mocowania drugiej śruby (przedni (F): 2,0 mm od bregma; boczny (L): 1,5 mm od linii środkowej).</li>
	<li>Delikatnie wywierć trzy otwory o średnicy 1 mm za pomocą elastycznego wiertła do kości, wyznaczone w powyższych trzech punktach czaszki (krok 1.5). Nie wkręcaj śrub głębiej niż to konieczne, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.</li>
	<li>Zatamuj krwawienie i wielokrotnie oczyść powierzchnię czaszki sterylną suchą watą.</li>
	<li>Wprowadź igłę połączoną z pompką do mikroiniekcji do mózgu na głębokość 4,6 mm i delikatnie wstrzyknij 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) do obszaru ad. Pozostaw igłę przez 2 min po wstrzyknięciu, a następnie powoli ją wyjmij (Supplemental File 1).</li>
	<li>Wkręć dwie śruby w czaszkę w punktach wyznaczonych dla ad oraz w miejscu mocowania drugiej śruby (wyznaczonych w kroku 1.5) za pomocą małego śrubokręta. Nie wkręcaj śrub głębiej niż to konieczne, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.</li>
	<li>Zmontuj system implantacji kaniuli (Supplemental File 2). Włóż kaniulę atrapy do kaniuli prowadzącej po dezynfekcji pod wysokim ciśnieniem.</li>
	<li>Wprowadź prowadzącą kaniulę z rurki ze stali nierdzewnej do mózgu na głębokość 4,6 mm do obszaru LV przez otwór w czaszce (Supplemental File 3), korzystając z uchwytu kaniuli w aparacie stereotaktycznym dla szczurów.</li>
	<li>Wymieszaj materiał do podstawy protezy z wodą do podstawy protezy w stosunku 1,5 g na 1 mL. Nałóż pastę, aby pokryć plastikowy cokół kaniuli prowadzącej oraz dwie śruby unieruchamiające kaniulę, a także całe nacięcie skóry, aby zapobiec infekcji skóry.</li>
	<li>W 2. dniu po operacji zanieść szczury izofluranem drogą wziewną, używając urządzenia do znieczulania małych zwierząt. Wyjmij kaniulę atrapy, wprowadź kaniulę wewnętrzną do kaniuli prowadzącej i dokręć śrubę mocującą, aby unieruchomić kaniulę wewnętrzną.</li>
	<li>Podłącz rurkę polietylenową łączącą pompkę do mikroiniekcji z kaniulą wewnętrzną i ustaw prędkość wtrysku na 1 μL/min. Wykonaj mikroiniekcję Aβ25-35 lub AlCl3 do LV.</li>
	<li>Wykonuj mikroiniekcje 4 μg (1 μL) Aβ25-35 codziennie rano przez 14 dni oraz 3 μL AlCl3 (1%) codziennie po południu przez 5 dni w znieczuleniu izofluranem.</li>
	<li>Odczekaj 5 min po zakończeniu wstrzykiwania, delikatnie wyjmij kaniulę wewnętrzną i ponownie włóż kaniulę atrapy do kaniuli prowadzącej.</li>
	<li>W 15. dniu po operacji (co odpowiada ostatniemu dniu iniekcji Aβ25-35) zdemontuj system implantacji kaniuli. Delikatnie usuń utwardzony materiał do podstawy protezy za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety, wykręć dwie śruby, wyjmij kaniulę prowadzącą i zdezynfekuj ranę betadyną. Wypełnij otwór w czaszce cementem kostnym i zszyj skórę prostym szwem przerywanym.</li>
	<li>Przeprowadź analogiczną operację w grupie pozorowanej (sham) i wykonaj mikroiniekcję 0,1% roztworu DMSO w soli fizjologicznej.</li>
	<li>Opieka pooperacyjna
	<ol>
		<li>Po operacji umieść 2 szczury w jednej klatce i zapewnij dostęp do pożywienia przez 30 dni. 
		Uwaga: W grupie pozorowanej przeżyło 18 szczurów (skuteczność operacji 90%), a w grupie Aβ leczonej złożenie przeżyło 19 szczurów (skuteczność operacji 95%).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przesiewanie szczurów w celu wyłonienia udanych modeli oraz ocena pamięci przestrzennej w wodnym labiryncie Morrisa
<ol>
	<li>Labirynt wodny Morrisa 
	Uwaga: Do oceny pamięci przestrzennej szczurów wykorzystano wodny labirynt Morrisa13Labirynt wodny Morrisa to okrągły zbiornik ze stali nierdzewnej o średnicy 120 cm i głębokości 50 cm. Test w labiryncie wodnym przeprowadzono w oparciu o paradygmat „złotego standardu” opisany w publikacji Behavioral Neuroscience autorstwa J. Nuneza.14.
	<ol>
		<li>Zabarw wodę w basenie na czarno, dodając kilka kropel barwnika spożywczego.</li>
		<li>Utrzymuj głębokość wody na poziomie 31,5 cm, a temperaturę na poziomie 23 ± 1 °C.</li>
		<li>Umieść okrągłą, przezroczystą platformę z pleksiglasu o średnicy 1,5 cm poniżej powierzchni wody.</li>
		<li>Należy zadbać o to, aby wszystkie sygnały przestrzenne wokół labiryntu wodnego pozostawały niezmienne podczas testów w labiryncie wodnym.</li>
		<li>Podziel basen na 4 równe kwadranty za pomocą liniiy wyimaginowanych w celu przeprowadzenia opisowego gromadzenia danych.</li>
		<li>Umieść ukrytą platformę w pierwszej ćwiartce (Q1) labiryntu wodnego.</li>
		<li>Rejestruj zachowania pływackie szczurów (mierzone za pomocą czasu latencji, trajektorii lub liczby przejść) za pomocą kamery wideo umieszczonej nad labiryntem wodnym, połączonej z komputerowym oprogramowaniem do analizy graficznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesiewanie w celu wyłonienia odpowiednich szczurów modelowych do grupy złożonej poddanej działaniu Aβ
	<ol>
		<li>W 45. dniu po operacji należy przeprowadzić trening w wodnym labiryncie Morrisa przez 4 kolejne dni, aby wyłonić szczury z pomyślnie wywołanym zaburzeniem pamięci i zebrać dane dotyczące współczynnika selekcji (SR). 
		Uwaga: SR definiuje się jako średnią latencję każdego zsumowanego szczura leczonego Aβ oraz grupy szczurów poddanych operacji pozorowanej w odnalezieniu ukrytej platformy pod powierzchnią wody w 4. dniu treningu w labiryncie wodnym. W poniższym równaniu „A” oznacza średnią latencję każdego zsumowanego szczura leczonego Aβ w odnalezieniu ukrytej platformy, a „B” średnią latencję grupy szczurów poddanych operacji pozorowanej w odnalezieniu ukrytej platformy w 4. dniu treningu w labiryncie wodnym: 
		<img alt="Równanie równowagi statycznej SR=(A-B)/B; wzór matematyczny do obliczania stosunku." src="/files/ftp_upload/56157/56157eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		W przypadku, gdy wartość SR dla szczura poddanego działaniu złożonego Aβ była większa niż 0,2, uznawano go za pomyślnie stworzony model szczura z upośledzoną pamięcią po podaniu złożonego Aβ.15Wydajność pamięci w obrębie jednego dnia obliczono na podstawie danych z dwóch prób, wyciągając średnią wartość czasu potrzebnego szczurom na odnalezienie ukrytej platformy. Procedura testu wodrowego labiryntu Morrisa została zaprojektowana w taki sposób, aby szczury mogły pływać w zbiorniku z labiryntem i szukać ukrytej platformy w czasie do 60 s. Jeśli szczur nie odnalazł ukrytej platformy w ciągu 60 s, był na nią umieszczany ręką eksperymentatora. Po dotarciu szczura na ukrytą platformę (samodzielnie lub przy pomocy), pozwalano mu pozostać na niej przez 20 s. Następnie szczura usuwano ze zbiornika i zapewniano mu 10 s regeneracji fizycznej pomiędzy dwiema próbami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Badanie neuronów
<ol>
	<li>W 86. dniu po operacji, w znieczuleniu izofluranem, uśmierć szczury poprzez dekapitację (Rycina 1).</li>
	<li>Umieść mózg w lodzie i delikatnie rozdziel obie półkule w obrębie szwu. Pobierz lewą półkulę z poziomu skrzyżowania wzrokowego i utrwal w 4% formaldehydzie do obserwacji mikroskopowej w świetle po barwieniu neuronów hematoksyliną i eozyną (HE), czerwienią Kongo lub azotanem srebra (patrz sekcje 4-6). Prawą półkulę w obszarze CA1 hipokampa utrwal w 2,5% glutaraldehydzie do obserwacji w mikroskopie elektronowym (sekcja 7).</li>
	<li>Przygotuj próbki mózgu do mikroskopii świetlnej/elektronowej zgodnie z wcześniej opisaną procedurą16,17.</li>
</ol>
4. Barwienie neuronów metodą HE
<ol>
	<li>Każdy preparat poddać deparafinizacji (po 20 min na każdy etap) w serii alkoholi o malejącym stężeniu (10%, 95%, 90%, 80% i 70%) aż do wody destylowanej, wykonując czynność w dygestorium.</li>
	<li>Barwić przez 3 min hematoksyliną (0,5% w/v), a następnie płukać wodą z kranu, aby usunąć niezwiązany barwnik z preparatów.</li>
	<li>Płukać przez 1 s 0,1% kwasem solnym w alkoholu w celu usunięcia koloru z nieobarwionych jąder.</li>
	<li>Zanurzyć w 0,5% roztworze amoniaku na 2 min, aż tło stanie się jasnoniebieskie.</li>
	<li>Barwić przez 1 min 1% eozyną.</li>
	<li>Odwodnić przez 5 min w serii alkoholi o rosnącym stężeniu (70%, 80%, 90%, 95% i 10%).</li>
	<li>Przeczyścić w ksylenie i zamknąć w medium montażowym na bazie żywicy.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu optycznego przy powiększeniu 40x, osoba nieznająca schematu eksperymentalnego powinna zaobserwować i policzyć żyjące neurony w barwieniu HE na obszarze 0,125 mm w środkowej części pola CA1 hipokampa oraz na obszarze 0,0352 mm2 w korze mózgowej.</li>
</ol>
5. Barwienie czerwienią Kongowy do oceny obciążenia neuronów Aβ
<ol>
	<li>Przeprowadzić deparafinizację każdego preparatu (20 min), używając serii alkoholi o malejącym stężeniu (10%, 95%, 90%, 80% i 70% alkoholu) oraz wody destylowanej, pracując pod wyciągiem laboratoryjnym.</li>
	<li>Barwić przez 20 min roztworem roboczym czerwieni Konga (0,5 g czerwieni Konga, 80 mL alkoholu metylowego, 20 mL gliceryny).</li>
	<li>Płukać w wodzie destylowanej przez 5 min.</li>
	<li>Przeprowadzić szybkie różnicowanie w zasadowym 80% roztworze alkoholu (0,2 g alkoholu/10 mL wodorotlenku potasu) przez 3 s.</li>
	<li>Płukać dwukrotnie, za każdym razem przez 5 min, wodą destylowaną.</li>
	<li>Barwić kontrastowo hematoksyliną Gilla przez 3 min.</li>
	<li>Płukać w wodzie z kranu przez 2 min.</li>
	<li>Zanurzyć w wodzie amoniakalnej (do wody z kranu dodać kilka kropli wodorotlenku amonu i dobrze wymieszać) na 30 s lub do momentu, aż przekroje zabarwią się na niebiesko.</li>
	<li>Płukać w wodzie z kranu przez 5 min.</li>
	<li>Odwodnić, używając serii alkoholi o rosnącym stężeniu (70%, 80%, 90%, 95% i 10% alkoholu).</li>
	<li>Przejąśnić w ksylenie i zamontować za pomocą żywicznego medium montażowego.</li>
	<li>Obserwować i policzyć komórki zabarwione czerwienią Konga przy powiększeniu 40x za pomocą mikroskopu optycznego; analizę powinien przeprowadzić badacz nieznający schematu eksperymentalnego.</li>
</ol>
6. Barwienie azotanem srebra w celu oceny tworzenia się NFT w neuronach
<ol>
	<li>Każdy preparat poddać deparafinizacji (20 min) w serii alkoholi o malejącym stężeniu (10%, 95%, 90%, 80% i 70%) oraz w wodzie destylowanej w komorze dyfuzyjnej.</li>
	<li>Zanurzyć w 20% roztworze azotanu srebra z dodatkiem czynnika blokującego na 20 min w ciemności.</li>
	<li>Przepłukać dwukrotnie w wodzie destylowanej przez 5 min za każdym razem.</li>
	<li>Zanurzyć w roztworze amoniaku z srebrem. Do 20% roztworu azotanu srebra dodawać kroplami roztwór amoniaku, aż roztwór przestanie być mętny i stanie się klarowny. Jednocześnie mieszać roztwór szklaną bagietką przez 15 min, a następnie umieścić w 1% roztworze wodorotlenku amonu na 2 min.</li>
	<li>Umieścić preparat w roboczym roztworze wywoływującym na 3-7 min, aż do momentu zaobserwowania czarnych bloków w aksonach.</li>
	<li>Zanurzyć w 0,1% roztworze amoniaku na 1 min, a następnie płukać wodą przez 1 min.</li>
	<li>Poddać utrwalaniu w 5% roztworze tiosiarczanu sodu przez 2 min, a następnie płukać wodą przez 5 min.</li>
	<li>Odwodnić w serii alkoholi o rosnącym stężeniu (70%, 80%, 90%, 95% i 10%).</li>
	<li>Przejrzystość uzyskać w ksylenie, a następnie zamontować preparat przy użyciu żywicznego medium montażowego.</li>
	<li>Zaobserwować i zarejestrować komórki wybarwione azotanem srebra przy powiększeniu 40x pod mikroskopem optycznym przez osobę nieznającą schematu eksperymentalnego.</li>
</ol>
7. Pomiar ultrastruktury neuronów hipokampa
<ol>
	<li>Przeciąć obszar CA1 hipokampa szczura na kilka sześcianów (1 x 1 x 1 mm3) i umieścić w 2,5% glutaraldehydzie na 2 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać sześciany w PBS trzy razy (pH 7,2, po 10 min każdego z płukań).</li>
	<li>Utrwalić sześciany w 1% kwasie osmiowym przez 2 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać sześciany w podwójnie destylowanej wodzie 3x (po 10 min każdego z płukań).</li>
	<li>Odwodnić przy użyciu gradientu alkoholu 50%, 70% i 90% (po 10 min dla każdego stężenia) oraz 10% dwa razy (po 15 min każdego z płukań).</li>
	<li>Przenieść do tlenku propylenu dwa razy (po 15 min każdego z płukań), następnie do mieszaniny tlenku propylenu i żywicy w stosunku 1:1 (po 60 min każdego z etapów w temperaturze pokojowej) oraz tlenku propylenu i żywicy w stosunku 1:4 (po 60 min każdego z etapów w temperaturze pokojowej). Namoczyć w żywicy (120 min, w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Zatopić w EPON 812 i spolimeryzować (5 h/35 °C, 5 h/60 °C, 5 h/80 °C).</li>
	<li>Wyciąć cienkie skrawki (1 µm), zabarwić błękitem metylenowym i zlokalizować pod mikroskopem.</li>
	<li>Zabarwić ultracienkie skrawki (50 nm) octanem uranylu i cytrynianem ołowia.</li>
	<li>Obejrzeć pod mikroskopem elektronowym JEM-1400 i zebrać obrazy.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, M., Lee, B. Y., Hane, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Progress+in+Alzheimer%27s+Disease+Research%2C+Part+2%3A+Genetics+and+Epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimers.+Dis%22%5BJournal%5D)">Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 2: Genetics and Epidemiology.</a> J. Alzheimers. Dis. , (2017).</li>
<li>Hane, F. T., Lee, B. Y., Leonenko, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Progress+in+Alzheimer%27s+Disease+Research%2C+Part+1%3A+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 1: Pathology.</a> J. Alzheimers Dis. , (2017).</li>
<li>Perl, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mt.+Sinai.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Neuropathology of Alzheimer's disease.</a> Mt. Sinai. J. Med. 77, 32-42 (2010).</li>
<li>Wu, X. G., Wang, S. S., Miao, H., Cheng, J. J., Zhang, S. F., Shang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scutellaria+barbata+flavonoids+alleviate+memory+deficits+and+neuronal+injuries+induced+by+composited+A%CE%B2+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Funct%22%5BJournal%5D)">Scutellaria barbata flavonoids alleviate memory deficits and neuronal injuries induced by composited Aβ in rats.</a> Behav. Brain Funct. 12, 33-43 (2016).</li>
<li>Guo, K., Wu, X. G., Miao, H., Cheng, J. J., Cui, Y. D., Shang, Y. Z. Regulation and mechanism of Scutellaria bartata flavonoids on apopotosis of cortical neurons and cytochondriome induced by composited Aβ. Chin Hosp Pharm J. 35, 1994-1999 (2015).</li>
<li>Guo, K., Miao, H., Wang, S. S., Cheng, J. J., Shang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://manu28.magtech.com.cn/zgblsl/EN/10.3969/j.issn.1000-4718.2016.12.005">Scutellaria barbata flavonoids inhibits NFT aggregation and regulatory mechanism in rats induced by composited Aβ.</a> Chin. J. Pathophysio. 32, 2147-2156 (2016).</li>
<li>Hou, X. C., et al. Scutellaria Barbata flavonoids inhibit the brain's Aβ and NFT abnormal generation and affect the related enzymes expression in rats induced by composited Aβ. Chin J New Drugs. , Accepted (2017).</li>
<li>Zhao, H. X., Guo, K., Cui, Y. D., Wu, X. G., Shang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.cjpp.net/EN/abstract/abstract18539.shtml">Effect of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35.</a> Chin J Pathophysiol. 30, 2262-2266 (2014).</li>
<li>Cheng, J. J., et al. Flavonoid extract from Scutellaria stem and leaf attenuates composited Aβ- induced memory impairment and apoptosis in rats. Chin.J. New Drugs. 25, 2627-2636 (2016).</li>
<li>Fang, F., Yan, Y., Feng, Z. H., Liu, X. Q., Wen, M., Huang, H. Study of Alzheimer's disease model induced multiple factors. Chongqing Med. 36, 146-151 (2007).</li>
<li>Regulations for the Administration of Affairs Concerning Experimental Animals. The Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China. , 10-31 (1988).</li>
<li>Bao, X. M., Shu, S. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBao%2C+XM+%22The+stereotaxic+atlas+of+the+rat+brain%22">The stereotaxic atlas of the rat brain</a>. , People's medical publishing house. (1991).</li>
<li>Morris, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6471907">Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rats.</a> J. Neurosic. Methods. 11, 47-60 (1984).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2872979/">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897(2008).</li>
<li>Yu, J. C., Liu, C. Z., Zhang, X. Z., Han, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acupuncture+improved+cognitive+impairment+caused+by+multi-infarct+dementia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+%26+Behav%22%5BJournal%5D)">Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats.</a> Physiol. & Behav. 86, 434-441 (2005).</li>
<li>Shang, Y. Z., Miao, H., Cheng, J. J., Qi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amelioration+of+total+flavonoids+from+stems+and+leaves+of+Scutellaria+baicalensis+Georgi+on+cognitive+deficits%2C+neuronal+damage+and+free+radicals+disorder+induced+by+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Effects of amelioration of total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi on cognitive deficits, neuronal damage and free radicals disorder induced by cerebral ischemia in rats.</a> Biol. Pharm. Bull. 29, 805-810 (2006).</li>
<li>Song, H. R., Cheng, J. J., Miao, H. J., Shang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scutellaria+flavonoid+supplementation+reverses+ageing-related+cognitive+impairment+and+neuronal+changes+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Inj%22%5BJournal%5D)">Scutellaria flavonoid supplementation reverses ageing-related cognitive impairment and neuronal changes in aged rats.</a> Brain Inj. 23, 146-153 (2009).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+RAS+inhibitors+Poricoic+Acid+ZG+and+Poricoic+Acid+ZH+attenuate+renal+fibrosis+via+a+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+patheway+and+targeted+phosphorylation+of+smad3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel RAS inhibitors Poricoic Acid ZG and Poricoic Acid ZH attenuate renal fibrosis via a Wnt/β-Catenin patheway and targeted phosphorylation of smad3 signaling.</a> J Agric Food Chem. 66, 1828-1842 (2018).</li>
<li>Pini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+atrophy+in+Alzheimer%27s+Disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain atrophy in Alzheimer's Disease and aging.</a> Ageing Res. Rev. 30, 25-48 (2016).</li>
<li>Ubhi, K., Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: recent advances and future perspectives.</a> J. Alzheimers Dis. 33, 85-94 (2013).</li>
<li>Guo, K. <a target="_blank" href="NULL">Scutellaria barbata flavonoids inhibite NFTs aggregation, tau protein phosphorylation and the regulated mechanism of related enzymes in rats induced by composited Aβ</a>. , Master's thesis (2016).</li>
<li>Shang, Y. Z. <a target="_blank" href="NULL">Effects and Mechanism of Scutellaria Barbata Flavonoids on Rat's Memory Impairment Induced by Compound Aβ25-35</a>. , Doctoral Thesis (2013).</li>
<li>Zussy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+related+markers%2C+cellular+toxicity+and+behavioral+deficits+induced+six+weeks+after+oligomeric+amyloid-%CE%B2+peptide+injection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease related markers, cellular toxicity and behavioral deficits induced six weeks after oligomeric amyloid-β peptide injection in rats.</a> PLoS One. 8, 1-20 (2013).</li>
<li>Walton, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aluminum+involvement+in+the+progression+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Aluminum involvement in the progression of Alzheimer's disease.</a> J. Alzheimers Dis. 35, 7-43 (2013).</li>
<li>Neils-Strunjas, J., Groves-Wright, K., Mashima, P., Harnish, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysgraphia+in+Alzheimer%27s+disease%3A+a+review+for+clinical+and+research+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Speech+Lang+Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Dysgraphia in Alzheimer's disease: a review for clinical and research purposes.</a> J. Speech Lang Hear Res. 49, 1313-1330 (2006).</li>
<li>Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SAMP8+mouse%3A+a+model+to+develop+therapeutic+interventions+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease.</a> Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).</li>
<li>Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+Alzheimer%27s+disease+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powszechnie wiadomo, że utrata zdolności uczenia się i pamięci jest głównym objawem klinicznym u pacjentów z AD2. Opisana tutaj procedura jest metodą badania AD in vivo ; Dostosowaliśmy wcześniej opublikowany protokół, w którym testowaliśmy lek łagodzący deficyty pamięci i uszkodzenia neuronów w modelu szczura4. Nasz protokół dostarcza ważnych szczegółów w celu uzyskania cennych danych, a także wysokiego wskaźnika przeżywalności zwierząt, które z powodzeniem modelują operację, deficyty pamięci, uszkodzenia neuronów, obciążenie Aβ i depozycję NFT, aby naśladować AD (w obecnym eksperymencie wskaźnik przeżycia i wskaźnik udanego modelu działania wynoszą ponad 90%). Te udane szczury modelowe zostały wykorzystane do zmierzenia ich pamięci przestrzennej za pomocą testu labiryntu wodnego Morrisa. Próba nawigacji pozycyjnej wykazała, że złożony Aβ może powodować upośledzenie przyswajania pamięci u szczurów; badanie sondy wykazało, że złożony Aβ może zmniejszać retencję pamięci szczurów; a próba odwrócenia wykazała, że złożony Aβ może powodować upośledzenie ponownego uczenia się szczurów. Te dane z testu labiryntu wodnego Morrisa pokazują, że złożony Aβ może indukować pamięć przestrzenną szczurów. Ogólnie rzecz biorąc, wstrzyknięcie szczurom domózgowo-komorowego Aβ25-35 w połączeniu z AlCl3 i TGF-β1 stworzyło wykonalny i wiarygodny model zwierzęcy in vivo podobny do AD dla laboratorium.
Wcześniejsze badania wykazały, że objętość mózgu u pacjentów z chorobą Alzheimera jest o 10% mniejsza niż u osób zdrowych. Różne zaniki można znaleźć w półkuli mózgowej poprzez obserwację wzrokową. Stopień zaniku kory mózgowej jest dodatnio związany z upośledzeniem pamięci19. W badaniu histologicznym duża liczba ubytków neuronów i ciężka patologia morfologiczna bezpośrednio zaburzają funkcję pamięci u pacjentów z AD20. W niniejszym badaniu obserwacja mikroskopowa światła / elektronów wykazała, że szczury, którym wstrzyknięto mikropreparat Aβ, wykazywały dramatyczne zmiany neuropatologiczne, w tym utratę neuronów oraz zaburzenie struktury neuronalnej i subkomórkowej. Wynik ten potwierdza zaburzenie pamięci przestrzennej szczurów wywołane przez złożony Aβ i jest podobny do stanu pacjentów z AD.
Powszechnie wiadomo, że obciążenie mózgu Aβ i agregacja NFT są uważane za najważniejsze cechy histopatogenne w chorobie Alzheimera. Mogą niszczyć strukturę neuronalną, zakłócać sygnalizację neuronalną, zakłócać funkcje neuronów i powodować zaawansowaną demencję17. Obecny model zwierzęcy wykazał obciążenie Aβ i agregację NFT w mózgu, co zgadza się ze stanem pacjenta z AD. W związku z tym obecne uszkodzenia neuronów u szczurów wywołane przez złożony Aβ mogą być wykorzystane jako model do badania patologii neuronalnej i strategii leczenia AD.
Poniżej znajdują się przykłady przesiewowych efektów leków w modelach szczurów AD: Zhao i wsp. stwierdzili, że zarówno flawonoidy z łodyg i liści Scutellaria (SSF), jak i Scutellaria barbata (SBF) mogą osłabiać upośledzenie pamięci i apoptozę szczurów wywołane przez złożony Aβ 8,9. Guo i wsp. poinformowali również, że SBF może hamować agregację NFT i nadmierną fosforylację białka tau po stronie Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 i Thr231 oraz zmniejszać ekspresję białka GSK-3β, CDK5 i PKA oraz mRNA u szczurów traktowanych Aβ21. Jednocześnie Shang i in. poinformowali również, że SBF może hamować proliferację astrocytów i mikrogleju oraz obniżać ekspresję mRNA Aβ1-40, Aβ1-42 i β-site APP cszczepiącego enzym 1 (BACE1) w mózgu złożonych szczurów Aβ22. Opierając się na powyższych wynikach, nasz model zwierzęcy jest korzystny w porównaniu z innymi modelami podobnymi do AD, które obejmują więcej funkcji neuronalnych i zaburzeń struktury.
Jeśli chodzi o inny model podobny do AD, pojedyncze wstrzyknięcie Aβ do śródmózgowiowo-komorowej szczurom może powodować deficyty pamięci szczurów, utratę neuronów i proliferację neuroglejocytów, ale może, ale nie musi, mieć odkładanie się Aβ i NFT23. Szczury narażone na działanie wysokiej dawki Al wydają się mieć wysoki wskaźnik sukcesu, naśladują AD i opłacalny model zwierzęcy, z upośledzeniem pamięci, utratą neuronów, proliferacją neuroglejcytów i blaszką starczą (SP) oraz agregacją NFT w mózgu. Jednak wysoka dawka Al może powodować uszkodzenia wątroby szczurów i anoreksję, którym towarzyszy zmniejszenie masy ciała24. Stary szczur to kolejny model podobny do AD. Sędziwe szczury wykazują deficyty pamięci, patologiczne zmiany w strukturze neuronalnej/podstrukturze, odkładanie się lipofuscyny, ale bez obciążenia Aβ i agregacji NFT. Szczury w wieku powyżej 24 miesięcy są uważane za starsze dla tego modelu, dlatego wymaga on dłuższego okresu karmienia, a zatem koszt jest wyższy17,25. Myszy transgeniczne SAMP8 i APP są najbliższymi mimikami AD i są najbardziej idealnymi modelami do badania AD. Ale oba modele zwierzęce są droższe i są ograniczone do użytku w laboratorium 26,27. W porównaniu z powyższymi modelami zwierzęcymi, nasz model złożony z modelu zwierzęcego poddanego działaniu Aβ ma niższy koszt i wysoką wydajność, co czyni go idealnym narzędziem do badania AD.
Podsumowując, wstrzyknięcie Aβ25-35 do komór mózgowych w połączeniu z AlCl3 i TGF-β1 szczurom stanowi cenny model zwierzęcy in vivo , aby lepiej zrozumieć upośledzenie pamięci przestrzennej, uszkodzenia neuronów, obciążenie Aβ i odkładanie się NFT leżące u podstaw AD. Model ten zapewnia szybki i stosunkowo prosty protokół eksperymentalny z wysokim wskaźnikiem przeżywalności zwierząt i wysokim wskaźnikiem udanych operacji modelu, a także wysokim wskaźnikiem duplikacji, co okazało się bardziej ekonomiczne. Obecny model zwierzęcy jest skutecznym modelem do naśladowania choroby Alzheimera i może się dalej weryfikować, wykorzystując go do naśladowania różnych innych chorób.

Powszechnie wiadomo, że choroba Alzheimera (AD) jest przewlekłą i postępującą chorobą neurodegeneracyjną, w której głównym zespołem klinicznym jest stopniowa utrata pamięci. W ogólnej patologii obserwuje się zanik tkanki nerwowej, utratę neuronów i synaps, a także zaburzenia struktur podkomórkowych i funkcji neuronów, co przyczynia się do rozwoju i manifestacji klinicznej AD1,2. Doniesiono, że w przypadku dokoncelebrowentrycularnego wstrzyknięcia Aβ u zwierząt w mózgu dochodzi do szeregu zdarzeń neurotoksycznych, obejmujących utratę neuronów, zaburzenie homeostazy wapniowej, apoptozę neuronów oraz nadprodukcję reaktywnych form tlenu3. Ponieważ jednak w patogenezę AD zaangażowanych jest wiele czynników, niezbędne jest opracowanie lepszego modelu tej choroby.
Opisano tutaj szczegółowy protokół tworzenia modelu in vivo naśladującego chorobę Alzheimera (AD) poprzez dokanałowe wstrzyknięcie Aβ25-35 oraz AlCl3, połączone z wstrzyknięciem RHTGF-β1 do przednio-grzbietowego jądra wzgórza u szczurów. Model szczurzy ten ściśle naśladuje ludzkie funkcje neuronalne oraz histopatogenezę AD, w tym zaburzenia pamięci, utratę neuronów i uszkodzenia strukturalne, apoptozę, wewnątrzkomórkowe obciążenie Aβ oraz agregację NFT4,5,6,7,8,9. AlCl3 zapobiega tworzeniu rozpuszczalnego Aβ z osadzonego Aβ, natomiast RHTGF-β1 może promować produkcję osadzonego Aβ i ułatwiać wystąpienie AD10. Taki wieloczynnikowy atak na neurony jest zgodny z wielotorową patogenezą AD.
Cały eksperyment trwał 86 dni: Rysunek 1 przedstawia harmonogram projektu eksperymentalnego, z zaznaczeniem punktów czasowych operacji zwierząt, przesiewowego badania modelu zwierzęcego, testu pamięci przestrzennej zwierząt oraz przygotowania próbek. W pierwszym dniu operacji do przedniej grzbietowej części jądra wzgórza wstrzyknięto mikrodozą RHTGF-β1. W drugim dniu operacji do komory bocznej wstrzykiwano mikrodozy Aβ25-35 codziennie rano przez 14 kolejnych dni oraz AlCl3 codziennie po południu przez 5 kolejnych dni. Wszystkie szczury miały 45 dni na rekonwalescencję po operacji. Do wyłonienia szczurów z sukcesywnie stworzonym modelem upośledzenia pamięci oraz do oceny pamięci przestrzennej zwierząt wykorzystano wodny labirynt Morrisa. Szczury przeszły 4-dniowy trening w wodnym labiryncie (2 próby dziennie), a w 4. dniu treningu oceniano ich wydajność w wodnym labiryncie Morrisa pod kątem upośledzenia pamięci. Wszystkie szczury były karmione przez kolejne 37 dni po badaniu przesiewowym modelu zwierzęcego. Pamięć przestrzenną szczurów testowano w wodnym labiryncie Morrisa przez 7 kolejnych dni, od 79. do 85. dnia po operacji. Wszystkie szczury uśmiercono przez gilotynowanie w 86. dniu w celu przygotowania próbek mózgu.
<img alt="Oś czasu eksperymentu w wodnym labiryncie Morrisa analizującego pamięć przestrzenną; próby obejmują dni od 1 do 86." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56157/56157fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Harmonogram projektu eksperymentalnego. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56157/56157fig1large.jpg">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Szczur Sprague-Dawley</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>SCXK (Jing) 2012-0001</td><td>300– 350 g</td></tr><tr><td>labirynt wodny Morrisa</td><td>Chińska Akademia Nauk Medycznych i Instytut Badań Medycznych Unii Pekińskiej, Chiny</td><td>Brak</td><td></td></tr><tr><td>ruchomego znieczulenia dla małych zwierząt</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>R580</td><td></td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny mózgu</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>68001</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczna wiertarka do kości</td><td>Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. Chiny</td><td>BW-sD908</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Japan Co., Ltd. Japonia</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>Dwukanałowa pompa mikroiniekcyjna</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>RWD202</td><td></td></tr><tr><td>EM mikrotom</td><td>Hitachi Co., Ltd. Chiny</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Atrapa kaniuli</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>62001</td><td>0.D.0.64&amp;razy; I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html</td></tr><tr><td>Kaniula prowadząca</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>62101</td><td>0.D.0.40mm/M3.5</td></tr><tr><td>Kaniula wewnętrzna</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>62201</td><td>0.D.0.41&amp;razy; I.D.0.25mm/<img alt="Special" src="/files/ftp_upload/56157/special01.jpg">M3.5</td></tr><tr><td>Dokręć nakrętkę</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>62501</td><td>0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5</td></tr><tr><td>Śruba mocująca</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>62514</td><td>M1.2&amp;razy; L2,0 mm (100BAO)</td></tr> <tr><td>Śrubokręt</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>62999</td><td>45 * 1 mm</td></tr><tr><td>Rurki PE</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chiny</td><td>62302</td><td></td></tr><tr><td>Amyloid beta 25-35</td><td>Sigma Aldrich Co. USA</td><td>SCP0002-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki transformujący czynnik wzrostu-β 1</td><td>PeproTech Inc. USA</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorek glinu</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. Chiny</td><td>3011080</td><td></td></tr><tr><td>Kongo czerwony</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. Chiny</td><td>3010016</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. Chiny</td><td>20150720</td><td></td></tr><tr><td>Materiał bazowy protezy</td><td>Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. Chiny</td><td>20170609</td><td></td></tr></tbody></table>

stworzenie cennego naśladownictwa choroby alzheimera w szczurzym modelu zwierzęcym poprzez wstrzyknięcie do komory mózgowej złożonego białka beta amyloidu

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

Choroba Alzheimera (AD) jest nieodwracalną, postępującą chorobą mózgu, która powoli niszczy pamięć i towarzyszy jej utrata neuronów oraz zmiana struktury. Wraz ze wzrostem liczby pacjentów z chorobą Alzheimera na całym świecie, patologia i leczenie choroby stały się przedmiotem zainteresowania międzynarodowego przemysłu farmaceutycznego. W związku z tym stworzenie modelu zwierzęcego naśladującego chorobę Alzheimera w laboratorium ma ogromne znaczenie.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół tworzenia mimiki AD w modelu zwierzęcym szczura poprzez domózgowo-komorowe wstrzyknięcie białka beta amyloidu 25-35 (Aβ25-35) w połączeniu z trichlorkiem glinu (AlCl3) i wstrzyknięcie do jądra przednio-grzbietowego rekombinowanego ludzkiego transformującego czynnika wzrostu-β1 (RHTGF-β1) szczurom. Zmierzono powiązane markery AD, w tym: pamięć przestrzenną, strukturę i podstrukturę neuronalną, neuronalne Aβ i produkcję splątków neurofibrylarnych (NFT). Ten model szczurzy wykazuje upośledzenie pamięci przestrzennej, zmiany patologiczne struktury neuronalnej i podstruktury, wewnątrzkomórkowe obciążenie Aβ neuronów i agregację NFT, a także zapewnia ścisłe naśladowanie struktury i funkcji neuronów w porównaniu z klinicznymi zaburzeniami AD. W związku z tym zaprezentowany model szczura AD stanowi cenne narzędzie in vivo do badania funkcji neuronów, patologii neuronalnej i badań przesiewowych leków w kierunku AD.

To jest protokół do naśladowania choroby Alzheimera u szczurów poprzez ocenę upośledzenia pamięci przestrzennej, zmian patologicznych neuronów, obciążenia neuronalnym białkiem beta amyloidu (Aβ) i agregacji splątków neurofibrylarnych, indukowanej przez wstrzyknięcie Aβ25-35 w połączeniu z trichlorkiem glinu i rekombinowanym ludzkim transformującym czynnikiem wzrostu-β1.

Stworzenie cennego naśladownictwa choroby Alzheimera w szczurzym modelu zwierzęcym poprzez wstrzyknięcie do komory mózgowej złożonego białka beta amyloidu

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera. Główną zaletą tej techniki jest to, że naśladuje ona chorobę Alzheimera w szczurzym modelu zwierzęcym poprzez dokanalikowe wstrzyknięcie A-beta 25 do 35 w połączeniu z chlorkiem glinu i rekombinowanym ludzkim czynnikiem wzrostu TGF-β1. Zapewnia ona również szybki i stosunkowo prosty protokół eksperymentalny z wysokim wskaźnikiem przeżywalności zwierząt, wysoką skutecznością tworzenia modelu, a także wysoką powtarzalnością, co okazało się bardziej ekonomiczne.Implikacje tej techniki rozciągają się na badanie skuteczności leków przeciwko AD, ponieważ ten model zwierzęcy wykazuje zaburzenia pamięci oraz nieprawidłowości neuronalne zbliżone do stanu pacjentów z AD. Procedurę zademonstruje Cheng Jianjun, technik z mojego laboratorium. U znieczulonego szczura należy rozpocząć od przycięcia futra na szczycie głowy nożyczkami chirurgicznymi, a następnie zdezynfekować obszar jodoforem.Następnie, za pomocą skalpeli chirurgicznych i nożyczek, wykonaj nacięcie skóry głowy wzdłuż pośrodkowej linii podłużnej czaszki. Oddziel tkankę podskórną i powięź, przemyj sklepienie czaszki 0,3% nadtlenkiem wodoru i zaznacz punkt bregma markerem. Następnie wyznacz trzy punkty: jądro przedgrzbietowe wzgórza w celu wstrzyknięcia RHTGF beta one oraz zamocowania jednej śruby, obszar komory bocznej, czyli LV, w celu wstrzyknięcia A-beta 25-35 i AICI3, oraz miejsce zamocowania drugiej śruby.Za pomocą giętkiego wiertła do kości ostrożnie wywierć trzy otwory o średnicy 1 mm w trzech zaznaczonych punktach na czaszce. Zatamuj krwawienie i wielokrotnie oczyść powierzchnię czaszki sterylną suchą watą. Następnie wprowadź do mózgu igłę podłączoną do pompy do mikroiniekcji na głębokość 4,2 mm i ostrożnie wstrzyknij 1 µL RHTGF beta one do obszaru ad.Pozostaw mikroigłę przez dwie minuty po wstrzyknięciu. Następnie powoli ją wycofaj. Za pomocą małego śrubokręta przykręć dwie śruby do czaszki, w miejscach wyznaczonych w poprzednio zaznaczonych punktach.Po umieszczeniu śrub złożyć system implantacji kaniuli, w pierwszej kolejności wkładając kaniulę atrapy do kaniuli prowadzącej po uprzedniej dezynfekcji poprzez zanurzenie w 75% alkoholu na 24 godziny. Następnie, przy pomocy uchwytu kaniuli zamontowanego na aparacie stereotaksycznym szczura, wprowadzić prowadzącą kaniulę z rurki ze stali nierdzewnej do mózgu na głębokość 4,6 milimetrów do obszaru LV przez otwór w czaszce. W kolejnym kroku wymieszać materiał na bazę protezy z wodą do bazy protezy w stosunku 1,5 grama na jeden mililitr.Nałóż pastę, aby pokryć plastikowy wspornik kaniuli prowadzącej oraz dwie śruby służące do unieruchomienia kaniuli prowadzącej. Przykryj całe nacięcie skóry, aby zapobiec infekcji skóry. Następnego dnia wyjmij kaniulę zastępczą i wprowadź kaniulę wewnętrzną do kaniuli prowadzącej.Wkręć śrubę mocującą, aby unieruchomić wewnętrzną kaniulę. Podłącz rurkę polietylenową łączącą pompę do mikroiniekcji z wewnętrzną kaniulą i ustaw prędkość wtrysku na 1 µL na minutę. Wykonaj mikroiniekcję A-beta 25-35 do LV. Odczekaj pięć minut po zakończeniu wtrysku, a następnie ostrożnie wyjmij wewnętrzną kaniulę.Następnie ponownie wprowadź kaniulę zastępczą (dummy cannula) do kaniuli prowadzącej. 15. dnia po operacji zdemontuj system implantacji kaniuli, usuwając nożyczkami chirurgicznymi i pęsetą utwardzony materiał bazy protezy, a następnie zdezynfekuj ranę jodoforem. Na koniec wypełnij otwór w czaszce cementem kostnym i zszyj skórę za pomocą prostych szwów przerywanych.Zacznij od zabarwienia wody w zbiorniku na czarno za pomocą czarnego barwnika spożywczego. Utrzymaj głębokość wody na poziomie 31,5 cm oraz temperaturę 23 ± 1 °C. Następnie umieść pod powierzchnią wody okrągłą, przezroczystą platformę z pleksiglasu o średnicy 1,5 cm.Następnie podziel basen na cztery równe ćwiartki za pomocą linii pomocniczych w celu gromadzenia danych opisowych. Umieść ukrytą platformę w pierwszej ćwiartce, czyli Q1, labiryntu wodnego. Na koniec zarejestruj zachowania pływackie szczura za pomocą kamery wideo umieszczonej nad labiryntem wodnym i podłączonej do komputerowego oprogramowania do analizy graficznej.Wyniki te wskazują, że szczury z grupy operowanej pozornie zawsze pływały swobodnie, podczas gdy szczury z grupy poddanej złożonej terapii A-beta zawsze pływały wzdłuż obwodu basenu w ramach adaptacyjnego pływania w wodnym labiryncie Morrisa. W ciągu czterech dni przesiewowych szczurów w modelu upośledzenia pamięci u wszystkich zwierząt odnotowano progresywny spadek czasu potrzebnego na znalezienie ukrytej platformy. Co więcej, opóźnienia w znalezieniu ukrytej platformy w grupie poddanej złożonej terapii A-beta były znacząco dłuższe niż w grupie operowanej pozornie, co dowodzi, że złożone A-beta może nasilać upośledzenie ponownej nauki pamięci u szczurów.W jednodniowej próbie retencji pamięci grupa traktowana złożonym A-beta wykazała krótszy czas pływania, mniejszy dystans pływania oraz mniejszą liczbę przejść w ciągu 60 sekund w porównaniu z grupą poddaną operacji pozorowanej. Na koniec, oprócz zmian patologicznych, liczba neuronów była również znacznie mniejsza w hipokampie i korze mózgu w grupie traktowanej złożonym A-beta w porównaniu z grupą poddaną operacji pozorowanej. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu 20 do 30 minut, jeśli jest prowadzona prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby zapobiec zsunięciu się prowadnicy kaniuli ze śruby mocującej w mózgu. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak test labiryntowy, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, czy model imitujący chorobę Alzheimera został pomyślnie stworzony. Po opracowaniu ta technika otworzyła badaczom z dziedziny neuronauki drogę do badania chorób neurodegeneracyjnych in vivo.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak prawidłowo przygotować zwierzęce modele naśladujące chorobę Alzheimera poprzez wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie A-beta 25-35 w połączeniu z chlorkiem glinu i rekombinowanym ludzkim czynnikiem wzrostu TGF-β1 u szczurów. Należy pamiętać, że praca z polimetakrylanem metylu może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie masek i rękawiczek.

establishment-valuable-mimic-alzheimer-s-disease-rat-animal-model

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ten film demonstruje procedurę wstrzykiwania monomerycznych peptydów amyloidowych do przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego w celu wytworzenia toksyczności amyloidu, naśladując uszkodzenia neuronów obserwowane w chorobie Alzheimera.

Ustalenie modelu choroby Alzheimera w mózgu danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie peptydu amyloidowego

Ten film demonstruje procedurę wstrzykiwania peptydów beta amyloidu, chlorku glinu i neurozapalnego czynnika wzrostu, które wspólnie pomagają w tworzeniu toksycznych blaszek amyloidowych w okolicy hipokampa. Powoduje to upośledzenie pamięci u szczura, charakterystyczne dla choroby Alzheimera.

Ustalenie modelu szczurzego choroby Alzheimera poprzez wstrzyknięcie peptydu beta-amyloidu

Ten film demonstruje precyzyjną stereotaktyczną infuzję beta amyloidu do zakrętu zębatego w celu stworzenia mysiego modelu choroby Alzheimera. Dokładne określenie współrzędnych i kontrolowane dostarczanie białek beta amyloidu powoduje degradację neuronów, zakłócając przetwarzanie pamięci i przyczyniając się do rozwoju choroby Alzheimera.

Bezpośrednia stereotaktyczna infuzja białek beta amyloidu w mózgu dla modelu choroby Alzheimera

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Aby zbadać współistniejącą chorobę Alzheimera (AD) i stan udaru w nowym modelu, opisano trzy zadania behawioralne, które oceniają zarówno kontrolę motoryczną, jak i zachowania poznawcze. Zadania te obejmują zadanie chodzenia po belce, zadanie cylindra i labirynt wodny Morrisa.

Uczenie się przestrzenne zależne od motoryki i hipokampa oraz ocena pamięci referencyjnej w transgenicznym szczurzym modelu choroby Alzheimera z udarem mózgu

Model zwierzęcy z wstrzyknięciem β amyloidu (Aβ) umożliwia podawanie określonej ilości i gatunku fragmentów Aβ oraz redukuje indywidualne różnice w każdej badanej grupie. Protokół ten opisuje wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych, umożliwiając wytwarzanie nieprawidłowości behawioralnych podobnych do choroby Alzheimera u normalnych myszy.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Aby zbadać efekty Aβo in vivo, opracowaliśmy model oparty na powtarzających się wlewach rozpuszczalnego Aβo z hipokampa w połączeniu z ciągłym wlewem przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych, aby przeciwdziałać neurotoksycznemu działaniu Aβo.

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

Opracowaliśmy metodologię ilościowego modelowania 3D in silico (q3DISM) amyloid-β (Aβ) fagocytoza przez jednojądrzaste fagocyty w modelach gryzoni choroby Alzheimera. Metodę tę można uogólnić w celu ilościowego określenia praktycznie każdego zdarzenia fagocytarnego in vivo.

Ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM) mózgowej fagocytozy beta-amyloidowej w modelach gryzoni choroby Alzheimera

Ten protokół opisuje syntezę, charakterystykę i wstrzykiwanie monomerycznych peptydów amyloidu-β42 do generowania toksyczności amyloidu u dorosłych ryb pręgowanego w celu stworzenia modelu choroby Alzheimera, a następnie analizy histologiczne i wykrywanie agregacji.

Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego

Ten protokół ilustruje metodę enkapsulacji komórek poprzez szybkie fizyczne żelowanie alginianu w celu unieruchomienia komórek. Uzyskane mikrogranulki umożliwiają kontrolowane i trwałe wydzielanie β amyloidu w czasie i mogą być wykorzystywane do badania skutków wydzielania β amyloidu w modelach in vitro i in vivo.

Wytwarzanie mikrogranulek alginianu wydzielających β amyloid do wykorzystania w modelowaniu choroby Alzheimera

Poznaj metodę tworzenia modelu choroby Alzheimera u szczurów poprzez wstrzyknięcie do komory mózgowej Aβ25-35 z chlorkiem glinu i TGF-β1. Technika umożliwia ocenę upośledzenia pamięci przestrzennej i zmian patologicznych neuronów.

Stworzenie cennego naśladownictwa choroby Alzheimera w szczurzym modelu zwierzęcym poprzez wstrzyknięcie do komory mózgowej złożonego białka beta amyloidu (Wideo) | JoVE Journal

Stworzenie cennego naśladownictwa choroby Alzheimera w szczurzym modelu zwierzęcym poprzez wstrzyknięcie do komory mózgowej złożonego białka beta amyloidu

Przeglądaj więcej filmów