Name: Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę wykrywania kolonizacji enterokrwotocznej Escherichia coli u myszy za pomocą bioluminescencji in vivo. Technika umożliwia monitorowanie bakterii w żywym organizmie bez konieczności eutanazji zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Chi-Chung Chen z Departamentu Badań Medycznych, Centrum Medycznego Chi Mei (Tainan, Tajwan) za pomoc w zakażeniu myszy oraz wsparcie ze strony centrum zwierząt laboratoryjnych Narodowego Uniwersytetu Cheng Kung. Prace te są wspierane przez granty Ministra Nauki i Technologii (MOST) (MOST 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006 -011 i 106-2321-B-006 -005) dla CC.

Uwaga: EHEC O157:H7 jest patogenem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) zgodnie z instrukcją bezpieczeństwa biologicznego (https://www.cdc.gov/) Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC). W związku z tym wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem EHEC muszą być wykonywane w obiekcie BSL-2. Podczas wykonywania eksperymentu noś fartuchy laboratoryjne i rękawice. Praca w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Zdezynfekować stanowisko doświadczalne przed i po procedurze doświadczalnej 70% etanolem. Wszystkie narzędzia lub sprzęt, które mają kontakt (lub mogą mieć kontakt) z EHEC, należy zdezynfekować 70% etanolem lub wybielaczem. Zanieczyszczone (lub potencjalnie skażone) odpady należy starannie uszczelnić i sterylizować w autoklawie. W razie potrzeby załóż maskę, okulary ochronne, podwójne rękawiczki lub kombinezon. 6-tygodniowe samice myszy C57BL/6 zostały zakupione i utrzymywane w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Narodowego Uniwersytetu Cheng Kung (NCKU). Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania NCKU (numer zatwierdzenia 104-039).
1. Generacja bakterii EHEC znakowanych biolucyferazą
<ol>
	<li>Zmieszać 50 ng kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), po 1 μL z 10 μM starterów do przodu i do tyłu, 2 μL 2,5 mM dezankleotydów (dNTP), 2 μL 10x buforu, 0,2 μL polimerazy DNA i sterylnej podwójnie destylowanej wody (ddH2O) do końcowej objętości 20 μL w celu amplifikacji kasety anty-kanamycyny, nptII gene24. Szablon DNA pochodzi z pBSL18024, który jest zakupiony od National BioResource Project (NBRP). Warunki PCR są wymienione w Tabeli 1, a sekwencja startera jest dostępna w Tabeli 2.</li>
	<li>Zwiąż produkty PCR z komercyjnym wektorem klonowania zgodnie z protokołem zestawu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wyciąć fragment genu nptII z wektora klonującego przez NsiI i SmaI i sklonować do pBBR1MCS4, który jest trawiony przez NsiI i ScaI z pAKlux29 w celu wytworzenia plazmidu odpornego na kanamycynę, pWF27813.</li>
	<li>Wyciąć operon luxCDABE z plazmidu eksprymującego lucyferazy9, pAKlux2, przez SpeI-HF i ScaI i sklonować do SpeI-HF i SmaI strawionego pWF278 w celu wytworzenia plazmidu opornego na kanamycynę i eksplagującego lucyferazy, pWF27913. 
	UWAGA: Do ekstrakcji plazmidów i oczyszczania wyciętych fragmentów należy użyć odpowiednio komercyjnej ekstrakcji plazmidu i zestawu do ekstrakcji żelu. Do trawienia enzymatycznego zmieszać 100 ng DNA, 1 μl 10x buforu, 1 μl każdego wybranego enzymu restrykcyjnego i sterylnego ddH2O do całkowitej objętości 10 μl i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2,5 - 3 godziny.</li>
	<li>Przekształć plazmid pWF279 w kompetentne komórki E. coli O157:H7 EDL933 za pomocą elektroporacji napięciem 2,500 V przez 4 ms.</li>
	<li>Inkubować przekształcone komórki bakteryjne w 1 ml pożywki Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Bakterie należy umieścić na płytce agarowej LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37 °C przez 16 - 18 godzin.</li>
	<li>Następnego dnia należy sprawdzić sygnał bioluminescencyjny płytki za pomocą urządzenia do obrazowania in vivo. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki i hodować ją w 3 ml LB uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37 °C przez 16 - 18 godzin.</li>
	<li>Przygotować podstawową pożywkę bakteryjną, rozcieńczając 100% glicerolu w sterylnym ddH2O, aby uzyskać 30% roztwór glicerolu.</li>
	<li>Zamrażać oporne na kanamycynę bakterie E. coli O157:H7 EDL933 zawierające plazmid lucyferazy jako zapas bakteryjny w kriowiale z zakrętką w stosunku 1:1 kultury bakterii i 30% roztworu glicerolu w temperaturze -80 °C. Końcowe stężenie glicerolu wynosi 15%.</li>
</ol>
2. Bioluminescencyjne bakterie EHEC Preparat do doustnego szczepienia
UWAGA: Schemat blokowy osi czasu procedur eksperymentalnych dla przygotowania EHEC i zgłębnika doustnego myszy jest przedstawiony w Rysunek 1, aby pomóc w przygotowaniu eksperymentalnym.
<ol>
	<li>Smuga bakterii E. coli O157:H7 EDL933 zawierających plazmid lucyferazy na płytce agarowej LB z 50 μg/ml kanamycyny z bulionu -80 °C. Hoduj bakterie przez 16 - 18 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pobrać pojedynczą kolonię z płytki na noc i hodować w 3 ml pożywki LB z 50 μg/ml kanamycyny przez 16 - 18 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 220 obr./min.</li>
	<li>Subhodowlę bakterii (rozcieńczenie 1:100) do kanamycyny (50 μg/ml) zawierającej bulion LB przez 2,5 - 3 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 200 obr./min. (Na przykład dodaj 2 ml bakterii hodowanych przez noc do 200 ml pożywki LB z dodatkiem kanamycyny (50 μg / ml).</li>
	<li>Inkubować bakterie przez 2,5 - 3 godziny i mierzyć wartość gęstości optycznej przy 600 nm (OD600), aż wartość będzie mieścić się w przedziale od 0,9 do 1. Liczba komórek bakteryjnych ma gęstość około 108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml.</li>
	<li>Odwirować ponownie wyhodowane bakterie w temperaturze 8 000 x g przez 30 minut, w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić sklarat osadu bez mieszania osadu bakteryjnego i przemyć go 100 ml 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej przez delikatne mieszanie.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.5 i 2.6 jeden raz.</li>
	<li>Po przepłukaniu odwirować kulturę bakteryjną o stężeniu 8 000 x g przez 30 minut, 4 °C i delikatnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Skondensować granulat 100-krotnie z 0,9% sterylną solą fizjologiczną. Na przykład, jeśli odwiruje się 200 ml bakterii, dodaj 2 ml zwykłej soli fizjologicznej, aby zawiesić osad.</li>
	<li>Potwierdź bakterię CFU (powinna wynosić około 109 CFU/100 μL po kondensacji w soli fizjologicznej) poprzez posiew skoncentrowanych bakterii przez 10-krotne seryjne rozcieńczenie25.</li>
</ol>
3. Zgłębnik ustny myszy z EHEC
<ol>
	<li>Traktuj 6-tygodniowe samice myszy C57BL/6 wodą ze streptomycyną (5 g/l) przez 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach przestaw się na zwykłą wodę pitną na kolejne 24 godziny przed zgłębkiem. Po leczeniu zwykłą wodą przez 24 godziny, myszy są gotowe do doustnego podania EHEC.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę 100 μl bakterii EHEC, pociągając za tłok. Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. Usunąć pęcherzyki, zatrzaskując strzykawkę palcami.</li>
	<li>Delikatnie podnieś zwierzę i ostrożnie umieść je na górze klatki.</li>
	<li>Ostrożnie chwyć mysz za ogon, a zwierzę chwyci górną część klatki i spróbuje się odsunąć.</li>
	<li>Delikatnie przytrzymuj mysz, chwytając luźną skórę szyi i grzbietu zwierzęcia kciukiem i palcem wskazującym, aby zapobiec poruszaniu się głowy myszy.</li>
	<li>Przytrzymaj mysz w pozycji pionowej, aby włożyć igłębkę i upewnij się, że głowa myszy jest unieruchomiona i pionowa.</li>
	<li>Włóż igłębkę do ust myszy wzdłuż podniebienia i przesuń się w dół do przełyku i w kierunku żołądka.</li>
	<li>Gdy wprowadzona igła osiągnie połowę lub dwie trzecie długości myszy, wstrzyknij 100 μl bakterii EHEC, które zawierają około 10-9 komórek CFU.</li>
</ol>
4. Wizualizacja
<ol>
	<li>Po zgłębniku ustnym wykryj sygnały bioluminescencyjne przez 1 i 2 dni.</li>
	<li>Przed zbadaniem sygnałów bioluminescencyjnych zwierząt należy je znieczulić, umieszczając je w komorze z 2,5% izofluranem z 1,5 l/min tlenu.</li>
	<li>Odczekaj 2 - 5 minut, aż wszystkie myszy stracą przytomność i przestaną się poruszać. Zwierzęta są gotowe do wykrywania bioluminescencji in vivo.</li>
	<li>Wykrywanie i obrazowanie sygnałów bioluminescencyjnych zwierząt za pomocą systemu obrazowania in vivo. Patrz rozdział 5 "Akwizycja danych" w celu uzyskania informacji na temat obsługi oprogramowania. Podczas procesu obrazowania wszystkie zwierzęta są stale zasilane 2,5% izofluranem z 1,5 l/min tlenu.
	<ol>
		<li>Kliknij file>live i ręcznie ustaw ostrość na myszy.</li>
		<li>Wybierz czas naświetlania i intensywność lasera.</li>
		<li>Kliknij przycisk acquire>capture.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku obrazowania ex vivo należy poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i usunąć całe jelito zakażonych myszy. Umieścić jelita na 9-centymetrowej szalce Petriego i wykonać zdjęcie za pomocą systemu obrazowania in vivo. Ustawienie jest takie samo jak w przypadku obrazowania in vivo, z wyjątkiem tego, że pole widzenia jest ustawione jako A/B. Szczegółowe informacje można znaleźć w rozdziale 5 "Gromadzenie danych". 
	UWAGA: Metoda zwichnięcia szyjki macicy: Unieruchomić myszy na górze klatki, chwytając ogon jedną ręką, tak aby zwierzęta chwyciły klatkę. Umieść marker lub kciuk i pierwszy palec drugiej ręki na karku u podstawy czaszki. Szybko pchnij do przodu ręką lub przedmiotem, przytrzymując głowę i pociągnij do tyłu, trzymając rękę trzymającą ogon. 
	Sprawdź dokładnie, aby potwierdzić zatrzymanie oddechu i brak bicia serca.</li>
</ol>
5. Akwizycja danych
UWAGA: Oprogramowanie używane do pozyskiwania danych jest wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Aby uzyskać dostęp do obrazu, otwórz Panel sterowania akwizycją oprogramowania (Rysunek 2).</li>
	<li>Wybierz "Luminescencyjny", "Zdjęcie" i "Nakładka".</li>
	<li>Ustaw Czas ekspozycji na "Auto". Ustaw Binning na "Średni".</li>
	<li>Ustaw ƒ/stop jako 1 dla luminescencyjnego i 8 dla zdjęcia. ƒ/stop kontroluje ilość światła odbieranego przez detektor CCD.</li>
	<li>Ustaw pole widzenia na podstawie pola obrazów, które są interesujące do uzyskania. Opcja "D" może zmieścić pięć 6-tygodniowych myszy i zobrazować je wszystkie na raz. "C" może obrazować trzy 6-tygodniowe myszy na jednym polu.</li>
	<li>Gdy myszy/próbki będą gotowe do obrazowania, kliknij "Pobierz", aby uzyskać obraz.</li>
	<li>Otwórz dane obrazu, który został pobrany.</li>
	<li>Otwórz panel Paleta narzędzi (Rysunek 3).</li>
	<li>Wybierz Narzędzia ROI. Zalecamy Okrąg (skrajny po lewej), aby objąć zakres obszaru bioluminescencyjnego na obrazach (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Kliknij "Zmierz ROI" (ikona ołówka), aby zmierzyć intensywność bioluminescencji powierzchni (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Pojawi się panel Pomiary zwrotu z inwestycji i wartości kwantyfikacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).</li>
	<li>Użyj opcji Konfiguruj pomiar w lewym rogu panelu Pomiary ROI, aby wybrać potrzebne wartości/informacje (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6), w przeciwnym razie kliknij "Eksportuj", aby wyeksportować tę tabelę danych i zapisać jako plik .csv (Rysunek 5).</li>
	<li>Użyj wartości z kolumny "Strumień całkowity (p/s)" jako kwantyfikację intensywności bioluminescencji w pliku .csv.</li>
</ol>

<ol><li>Pennington, H. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(10)60963-4/abstract">Escherichia coli O157.</a> Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).</li>
<li>Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxins+and+the+pathophysiology+of+hemolytic+uremic+syndrome+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals.</a> Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).</li>
<li>Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga-toxin-producing+Escherichia+coli+and+haemolytic+uraemic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome.</a> Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Shiga+Toxin+Mechanisms+of+Action+in+Renal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease.</a> Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).</li>
<li>Nguyen, Y., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+E.+coli+%28EHEC%29+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 90(2012).</li>
<li>Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+monitoring+of+in+vivo+colonization+and+clearance+dynamics+by+light-emitting+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria.</a> Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).</li>
<li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li>
<li>Rhee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+spatial+and+temporal+colonization+of+enteropathogenic+E.+coli+and+enterohemorrhagic+E.+coli+in+mice+using+bioluminescent+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging.</a> Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).</li>
<li>Roxas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+E.+coli+alters+murine+intestinal+epithelial+tight+junction+protein+expression+and+barrier+function+in+a+Shiga+toxin+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner.</a> Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).</li>
<li>Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiragusa%2C+GR+%22Real-Time+Monitoring+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+Adherence+to+Beef+Carcass+Surface+Tissues+with+a+Bioluminescent+Reporter%22">Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter</a>. , (1999).</li>
<li>Kuo, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Core+LPS+Biosynthesis+Enzyme+RfaD+Confers+Hypersusceptibility+to+Host+Intestinal+Innate+Immunity+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo.</a> Front Cell Infect Microbiol. 6, 82(2016).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).</li>
<li>Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303 (5659), 851-853 (2004).</li>
<li>Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Yersinia+enterocolitica+in+Murine+and+Bovine+Feces+on+the+Basis+of+the+Chromosomally+Integrated+luxAB+Marker+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene.</a> Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).</li>
<li>Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Yersinia+enterocolitica+invasin+expression+in+vitro+and+in+vivo+using+a+novel+luxCDABE+reporter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system.</a> Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).</li>
<li>Morin, C. E., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+stabilized+luciferase-expressing+plasmids+to+examine+in+vivo-induced+promoters+in+the+Vibrio+cholerae+vaccine+strain+CVD+103-HgR%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).</li>
<li>Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+model+systems+for+studying+enteropathogenic+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977(2013).</li>
<li>Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection.</a> Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013(2014).</li>
<li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7628717">Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Long-Wavelength+Optical+and+NIR+Imaging+Materials%3A+Contrast+Agents%2C+Fluorophores+and+Multifunctional+Nano+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Mater%22%5BJournal%5D)">Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers.</a> Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).</li>
<li>Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+green+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Improved green fluorescence.</a> Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Frangioni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
<li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium%3A+infection%2C+inflammation+and+the+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).</li>
<li>Mallick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+murine+infection+model+for+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli.</a> J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).</li>
<li>Petty, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Citrobacter+rodentium+genome+sequence+reveals+convergent+evolution+with+human+pathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).</li>
<li>Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS%2C+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li>
<li>Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Plasmid+Maintenance+in+the+Attenuated+Live+Vector+Vaccine+Strain+Salmonella+typhiCVD+908-htrA%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA.</a> Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).</li>
<li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li>
<li>Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+%28EHEC%29+infection+and+hemolytic+uremic+syndrome+%28HUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS).</a> BMC Med. 10, (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Doniesiono, że EHEC przekształcony plazmidem lucyferazy został wykorzystany do zbadania jego lokalizacji u gospodarzy lub ekspresji genów in vivo 8,11,12. Zademonstrowany tutaj model mysi wykrył również czas i lokalizację kolonizacji EHEC u mysiego gospodarza8. Niemniej jednak udostępniamy szczegółowy protokół, w jaki sposób podawać szczepionkę EHEC myszom dożołądkowo i jak starannie przygotować ...

EHEC O157:H7 to patogen, który powoduje biegunkę1, HS2, HUS3, a nawet ostrą niewydolność nerek4 poprzez skażoną wodę lub żywność. EHEC jest chorobotwórczym enterobacterium i kolonizuje przewód pokarmowy człowieka1. Kiedy EHEC po raz pierwszy przylega do nabłonka jelitowego gospodarza, wstrzykuje czynniki kolonizacyjne do komórek gospodarza przez system wydzielania typu III (T3SS), który działa jak strzykawka molekularna, indukując zmianę przyczepiania i zacierania (A / E), a następnie w celu wymuszenia adhezji (kolonizacji) 5. Geny te biorące udział w tworzeniu zmian A/E są kodowane przez locus of enterocyte effacement (LEE) pathogenicity island5.
Bioluminescencja to chemiczna reakcja wytwarzająca światło, w której lucyferazy katalizują swój substrat lucyferynę, aby wytworzyć światło widzialne6. Ten proces enzymatyczny często wymaga obecności tlenu lub adenozynotrifosforanu (ATP)6. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) umożliwia naukowcom wizualizację i kwantyzację interakcji gospodarz-patogen u żywych zwierząt7. BLI może scharakteryzować cykl infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt, śledząc bioluminescencyjne bakterie, gdy migrują do różnych tkanek i atakują je7; Świadczy to o dynamicznym postępie infekcji. Co więcej, obciążenie bakteryjne u zwierząt jest związane z sygnałem bioluminescencyjnym8; Jest to zatem wygodny wskaźnik do oszacowania stanów patologicznych zwierząt doświadczalnych w prosty i bezpośredni sposób.
Plazmid użyty tutaj zawierał operon lucyferazy, luxCDABE, który pochodzi z bakterii Photorhabdus luminescens, która koduje swój własny substrat lucyferazy7,9. Przekształcając ten plazmid wyrażający lucyferazy w bakterie, procesy kolonizacji i infekcji można monitorować, obserwując te bioluminescencyjne bakterie u żywych zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, BLI i bakterie znakowane bioluminescencją pozwalają naukowcom monitorować liczbę i lokalizację bakterii, żywotność bakterii przy antybiotykach/terapii oraz ekspresję genów bakteryjnych w infekcji/kolonizacji6,7. Opisano liczne bakterie chorobotwórcze, które wykazują ekspresję operonu luxCDABE w celu zbadania ich cyklu infekcji i/lub ekspresji genów w zakażeniu. Bakterie te, w tym uropatogenne E. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropatogenne E. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, oraz Vibrio cholerae20, zostały udokumentowane.
Kilka eksperymentalnych modeli zostało opracowanych w celu ułatwienia badania kolonizacji EHEC in vitro i in vivo21,22,23. Brakuje jednak odpowiednich modeli zwierzęcych do badania kolonizacji EHEC in vivo, a co za tym idzie niedostatek szczegółów. Aby ułatwić badanie mechanizmu kolonizacji EHEC in vivo, cenne jest budowanie modeli zwierzęcych w celu obserwacji i ilościowego określenia kolonizacji EHEC u żywych zwierząt w sposób nieinwazyjny.
Ten manuskrypt opisuje model kolonizacji myszy-EHEC, który wykorzystuje system ekspresji bioluminescencyjnej do monitorowania kolonizacji EHEC w czasie u żywych gospodarzy. Myszy są inokulowane dożołądkowo znakowanym bioluminescencyjnie EHEC, a sygnał bioluminescencyjny jest wykrywany u myszy za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo13. Myszy zakażone EHEC znakowanym bioluminescencyjnie wykazywały znaczące sygnały bioluminescencyjne w jelicie po 2 dniach od zakażenia, co sugerowało, że bakterie te skolonizowały jelito gospodarza po 2 dniach po zakażeniu. Dane obrazowe ex vivo wykazały, że kolonizacja ta występuje specyficznie w jelicie ślepym i okrężnicy myszy. Korzystając z tego mysiego modelu EHEC, bioluminescencyjna kolonizacja EHEC może zostać wykryta w żywym gospodarzu za pomocą systemu obrazowania in vivo, w celu zbadania szczegółowych mechanizmów kolonizacji bakterii jelitowych, co może przyczynić się do dalszego zrozumienia zmian fizjologicznych i patologicznych wywołanych przez EHEC.

<table><tbody><tr><td>Inkubator z wytrząsarką</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>inkubacja bakterii&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>inkubacja bakterii&nbsp;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>źródło genu nptII</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>źródło operonu luxCDABE</td></tr><tr><td>T& Zestaw do klonowania</td><td>Yeast Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>do klonowania TA&nbsp;</td></tr><tr><td>Nsi I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>zastosowanie do klonowania plazmidów&nbsp;</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>zastosowanie do klonowania plazmidów&nbsp;</td></tr><tr><td>Spe HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>służy do klonowania plazmidów&nbsp;</td></tr><tr><td>Sma I&nbsp;</td><td>Zastosowanie NEB</td><td>R0141S</td><td>do klonowania plazmidów&nbsp;</td></tr><tr><td>Ligaza T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>zastosowanie do klonowania plazmidu&nbsp;</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>zastosowanie do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>10X Ex Taq Buffer</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>zastosowanie do amplifikacji</td></tr><tr><td>PCR Mieszanina dNTP&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>zastosowanie do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>Maszyna PCR</td><td>zastosowana Biosystem&nbsp;</td><td>Termocykler 2720&nbsp;</td><td>&nbsp; do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>stosować do roztworu do przechowywania bakterii</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>substancja chemiczna do wytwarzania podłoża LB, 10 g/L</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>substancja chemiczna do produkcji podłoża LB, 10 g/L</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy w proszku</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>substancja chemiczna do produkcji podłoża LB, 5 g/L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>CONDA pronadisa Cat</td><td>1802.00</td><td>substancja chemiczna do produkcji kanamycyny agarowej LB</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Antybiotyki Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>, stosowane do selecitonu</td></tr><tr><td>streptomycyny&nbsp;</td><td>Antybiotyki Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>, eliminują mikrobiotę u myszy</td></tr><tr><td>EDL933 kompetentna komórka</td><td>Domowa</td><td></td><td>metoda znajduje się w dokumencie uzupełniającym&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>do elektroporacji</td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>do elektroporacji</td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>zastosowanie do odwirowywania bakterii&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor o stałym kącie nachylenia</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>służy do odwirowania bakterii&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor o stałym kącie</td> nachylenia <td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>służy do odwirowywania bakterii&nbsp;</td></tr><tr><td>butelki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>zastosowanie do odwirowywania bakterii&nbsp;</td></tr><tr><td>butelki wirówkowe</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>zastosowanie do odwirowania bakterii&nbsp;</td></tr><tr><td>Biofotometr Eppendorf Plus&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hamburg</td><td>do pomiaru wartości OD600 myszy bakteryjnych</td></tr><tr><td>C57BL/6&nbsp;</td><td>Laboratorium Centrum Zwierząt NCKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fartuch laboratoryjny, rękawice</td><td></td><td></td><td>do ochrony personelu&nbsp;</td></tr><tr><td>izofluran&nbsp;</td><td>Panion & BF Biotech Inc.</td><td>G-8669</td><td>do znieczulenia myszy, strzykawka 1ml klasy farmaceutycznej</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>stosować do podawania w jamie ustnej myszy Igła</td></tr> <tr><td></td><td>do karmienia wielokrotnego użytku 22 G z końcówką kulkową</td><td>&phi; 0,9 mm X L 50 mm</td><td>Zastosowanie do podawania w jamie ustnej myszy</td></tr><tr><td>chirurgiczne&nbsp; Nożyczki&nbsp;</td><td></td><td></td><td>zastosowanie do eksperymentu na myszach</td></tr><tr><td>System obrazowania Xenogen IVIS 200</td><td>Wykorzystanie widma</td><td>Perkin Elmer</td> IVIS <td>do przechwytywania obrazów bioluminescencyjnych&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Living Image</td><td>Software Perkin Elmer</td><td>w wersji 4.1</td><td>służy do ilościowego określania danych obrazu</td></tr></tbody></table>

wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterokrwotoczny E. coli (EHEC) O157:H7, który jest patogenem przenoszonym przez żywność, powodującym biegunkę, krwotoczne zapalenie jelita grubego (HS) i zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS), kolonizuje przewód pokarmowy ludzi. Aby zbadać szczegółowy mechanizm kolonizacji EHEC in vivo, niezbędne jest posiadanie modeli zwierzęcych do monitorowania i ilościowego określania kolonizacji EHEC. Demonstrujemy tutaj model kolonizacji myszy-EHEC poprzez przekształcenie plazmidu wyrażającego bioluminescencyjną do EHEC w celu monitorowania i ilościowego określenia kolonizacji EHEC u żywych gospodarzy. Zwierzęta zaszczepione znakowanym bioluminescencyjnie EHEC wykazują intensywne sygnały bioluminescencyjne u myszy poprzez wykrywanie za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo. Po 1 i 2 dniach od zakażenia u zakażonych zwierząt nadal można wykryć sygnały bioluminescencyjne, co sugeruje, że EHEC kolonizuje gospodarzy przez co najmniej 2 dni. Pokazujemy również, że te bioluminescencyjne EHEC lokalizują się w jelicie myszy, szczególnie w jelicie ślepym i okrężnicy, na podstawie obrazów ex vivo. Ten model kolonizacji EHEC za pomocą myszy może służyć jako narzędzie do pogłębiania obecnej wiedzy na temat mechanizmu kolonizacji EHEC.

Podano bioluminescencyjnie znakowane EHEC (~ 109 komórki bakteryjne) do 6-tygodniowych samic myszy szczepu C57BL/6 poprzez zgłębnik dożożołądkowy. W ciągu 1 h po doustnym zaszczepieniu myszy EHEC, u zwierząt badano sygnał bioluminescencyjny za pomocą in vivo układ obrazowania przedstawiony na Rysunek 7Wyniki wykazały silny sygnał bioluminescencyjny u myszy, którym podano drogą zgłębnika EHEC znakowane bioluminescencyjnie. Sygnały analizowa...

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie kolonizacji myszy przez enterohemoragiczne szczepy E.coli przy użyciu nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny patogenności enterohemoragicznych szczepów E.coli, takie jak mechanizmy kolonizacji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykrycia kolonizacji EHEC u żywego zwierzęcia bez konieczności jego uśmiercania.W pierwszej kolejności należy wykonać posiew z mrożonego w temperaturze -80 °C banku szczepów bakterii E.coli O157:H7 EDL933 zawierających plazmid lucyferazy na płytkę z agarem LB z dodatkiem 50 µg/mL kanamycyny. Bakterie należy inkubować przez 16 do 18 godzin w temperaturze 37 °C. Następnie należy wybrać pojedynczą kolonię z płytki inkubowanej przez noc i zaszczepić ją do 3 mL pożywki LB z dodatkiem 50 µg/mL kanamycyny.Następnie inkubuj kulturę w temperaturze 37 °C przy 220 rpm przez 16 do 18 godzin. Następnego dnia przygotuj 2 mL rozcieńczenia 1:100 kultury z nocnej inkubacji i zaszczep ją do 200 mL pożywki LB z kanamycyną. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 °C przy 200 rpm przez 2,5 do 3 godzin lub do momentu, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0,9 do 1.Następnie odwiruj ponownie hodowlę bakterii przy 8000 ×g i temperaturze 4 °C przez 30 minut. Odlej nadsącz, uważając, aby nie poruszyć osadu, a następnie przemyj bakterie 100 ml 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, delikatnie mieszając. Po przemyciu ponownie odwiruj kulturę bakteryjną i ostrożnie odlej nadsącz.Następnie należy użyć 0,9% jałowej soli fizjologicznej, aby skoncentrować osad 100-krotnie. Po podaniu myszom wody ze streptomycyną przez 24 godziny zgodnie z protokołem tekstowym, należy napełnić strzykawkę 100 µL bakterii EHEC. Delikatnie unieść zwierzę i z ostrożnością umieścić je na górze klatki.Następnie ostrożnie chwyć mysz za ogon w taki sposób, aby zwierzę chwyciło się górnej części klatki i próbowało uciec. Delikatnie unieruchom mysz, używając kciuka i palca wskazującego do uchwycenia luźnej skóry na szyi i grzbiecie zwierzęcia, aby zapobiec ruchom głowy. Następnie trzymaj mysz w pozycji pionowej, upewniając się, że głowa myszy jest w tej pozycji unieruchomiona.Wprowadź igłę do zgłębnika do pyska zwierzęcia, prowadząc ją wzdłuż podniebienia, a następnie skieruj ją w dół do przełyku w stronę żołądka. Gdy wprowadzona igła znajdzie się w połowie lub w dwóch trzecich długości wewnątrz myszy, wstrzyknij 100 µL bakterii EHEC zawierających około 10⁹ CFU komórek. Po wizualizacji komórek bioluminescencyjnych zgodnie z protokołem tekstowym otwórz panel sterowania akwizycją (Acquisition Control Panel) w oprogramowaniu.Wybierz luminescencję, fotografię oraz nakładkę. Ustaw czas naświetlania na automatyczny. Następnie ustaw binning na średni.Ustaw wartość przysłony f/stop na 1 dla luminescencji i na 8 dla fotografii. Przysłona f/stop kontroluje ilość światła docierającego do detektora CCD. Gdy próbki myszy będą gotowe do obrazowania, kliknij „acquire”, aby rozpocząć akwizycję obrazu.Otwórz pozyskane dane obrazowe, a następnie otwórz panel palety narzędzi. Wybierz narzędzia ROI, takie jak okrąg, aby zdefiniować obszar bioluminescencyjny na obrazach. Następnie, używając ikony ołówka, kliknij „measure ROI's”, aby zmierzyć natężenie bioluminescencji powierzchniowej.Pojawi się panel pomiaru ROI oraz wartości ilościowe. Następnie, w lewym górnym rogu panelu pomiarów ROI, należy użyć funkcji konfiguracji pomiaru (configure measurement), aby wybrać wymagane wartości/informacje. W przeciwnym razie należy kliknąć Export, aby wyeksportować tę tabelę danych i zapisać ją jako plik csv.Na koniec należy wykorzystać wartości z kolumny całkowitego strumienia p/s jako ilościową ocenę intensywności bioluminescencji w pliku csv. Jak pokazano na tym obrazie, silny sygnał bioluminescencji zaobserwowano u myszy poddanych inokulacji EHEC znakowanym bioluminescencyjnie drogą gavage'ową. Na tej rycinie myszy inokulowane bioluminescencyjnie znakowanym szczepem dzikim EHEC EDL933 wykazały intensywne sygnały bioluminescencyjne nawet dwa dni po zakażeniu, co sugeruje, że EHEC skolonizowały gospodarzy w ciągu dwóch dni.Jednak myszy zakażone mutantem E.coli z defektami lipopolisaracharydów nie wykazywały bioluminescencji, co sugeruje, że w organizmach tych myszy zasiedliły się nieliczne lub żadne bakterie. Aby zlokalizować bakterie znakowane bioluminescencją, wykonano obrazowanie ex vivo jelit pobranych od uśpionych zwierząt. Organy myszy zakażonych znakowanymi bioluminescencją EHEC wykazały istotny sygnał bioluminescencyjny w kątnicy i jelicie grubym, co wskazuje na kolonizację tych organów.W przeciwieństwie do nich, myszy zainfekowane mutantem LPS wykazały zmniejszoną bioluminescencję w tkance jelitowej, co jest zgodne z obrazowaniem in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentu z wykorzystaniem systemu IV w celu monitorowania kolonizacji EHEC u myszy.

detection-enterohemorrhagic-escherichia-coli-colonization-murine-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Źródło: Valentine, M. E., et al. Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje zastosowanie bioluminescencji do wizualizacji i porównania zachowania in vivo zjadliwych i atenuowanych szczepów bakteryjnych u myszy. Przedstawiono w nim przygotowanie bioluminescencyjnych zawiesin bakteryjnych i ich dootrzewnowe wstrzyknięcie myszom. Zjadliwy szczep wykazuje...

Śledzenie dynamiki infekcji bakteryjnych u myszy za pomocą bioluminescencji

Źródło: Kuo, C., et al. Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo . J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje przygotowanie enterokrwotocznej zawiesiny Escherichia coli z ekspresją lucyferazy z zamrożonego bulionu do stosowania jako inokulum doustne w modelach zwierzęcych. Umożliwia to bioluminescencyjne śledzenie kolonizacji jelit w czasie rzeczywistym podczas badań infekcji in vivo.

Przygotowanie bioluminescencyjnej enterokrwotocznej inokulacji Escherichia coli

Źródło: de Vries, C. R. i in., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje bioluminescencyjną technikę obrazowania monitorującego postęp infekcji bakteryjnej na żywym modelu myszy. Bakterie patogenne opracowane z systemem raportu luxABCDE emitują światło w miejscu zakażenia, umożliwiając wizualizację bakterii aktywnych przemianownie. Obrazując mysz w czasie, naukowcy mogą nieinwazyjnie śledzić dynamikę infekcji i...

Bioluminescencja zakażeń bakteryjnych u myszy

Źródło: Seman, B. G. i in. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)Film prezentuje model noworodkowej myszy do badania infekcji ogólnoustrojowej z użyciem zamkniętych bakterii bioluminescencyjnych. Noworodki są wstrzykiwane wysokodawkowymi lub niskodawkowymi zawiesinami bakteryjnymi i zwracane matce na opiekę poporodową. Otoczone bakterie unikają wczesnego wykrywania odpornościowego, rozprzestrzeniają się systemowo i są wizualizowane w czasie za pomocą...

Modelowanie infekcji u noworodkowych myszy z użyciem kapsulowanych bioluminescencyjnych bakterii

Źródło: Valentine, M. E. i in., Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa oraz testowanie tłumienia zjadliwości w prostym modelu infekcji myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje zastosowanie podejścia obrazowania opartego na bioluminescencji do monitorowania zakażenia bakteryjnego w modelu żywej myszy. Sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne i rentgenowskie umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oraz anatomiczną lokalizację infekcji rozprzestrzeniającej...

Obrazowanie w czasie rzeczywistym infekcji bakteryjnej w modelu myszy z użyciem bioluminescencji

Źródło: Luyts, N. i inni. Podłużna kontrola infekcji dróg moczowych i ich leczenia u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencji. J. Vis. Exp. (2021).Ten film pokazuje indukcję i śledzenie infekcji dróg moczowych w modelu mysim z wykorzystaniem bioluminescencyjnego E. coli wstrzykniętego do pęcherza, gdzie zachodzi adhezja, inwazja i replikacja wewnątrzkomórkowa bakterii. Światło emitowane z bioluminescencyjnego operonu służy jako wskaźnik w czasie rzeczywistym obciążenia bakteryjnego podczas...

Wizualizacja infekcji dróg moczowych w modelu myszy z wykorzystaniem bioluminescencji

Obrazowanie multimodalne jest cennym podejściem do badania kolonizacji bakteryjnej w małych modelach zwierzęcych. Protokół ten przedstawia zakażenie myszy bioluminescencyjnym Citrobacter rodentium i podłużne monitorowanie kolonizacji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii obrazowania 3D w świetle rozproszonym z obrazowaniem μCT w celu stworzenia filmu 4D infekcji C. rodentium.

Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy

Ten manuskrypt opisuje dopęcherzowe podawanie bakterii uropatogennych za pomocą operonu luksa w celu wywołania infekcji dróg moczowych u myszy i późniejszą podłużną analizę in vivo obciążenia bakteryjnego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Podłużna obserwacja zakażeń dróg moczowych i ich leczenie u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Poznaj nieinwazyjną metodę wykrywania kolonizacji enterokrwotocznej Escherichia coli u myszy za pomocą bioluminescencji in vivo. Technika umożliwia monitorowanie bakterii w żywym organizmie bez konieczności eutanazji zwierząt.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Przeglądaj więcej filmów