Name: Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Naucz się pozyskiwać linie komórek macierzystych z blastocyst myszy przy użyciu ludzkich fibroblastów skóry przedniej jako komórek podporowych. Protokół zapewnia wysoką wydajność porównywalną z metodami 2i.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Jonatanowi Lucasowi za pomoc techniczną przy hodowli komórek karmiących, Servei Estabulari de la UAB za opiekę nad zwierzętami i Domènec Martín za nagranie filmu. Prace te były wspierane przez Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R oraz Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC jest stypendystą PIF-UAB.

Wykorzystanie zwierząt opisanych w poniższych sekcjach zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Badań na Zwierzętach i Ludziach Universitat Autònoma de Barcelona oraz przez Departament d'Agricultura, Ramaderia, Pesca i Alimentació Generalitat de Catalunya (protokół #8741).
1. Inaktywacja i przechowywanie ogniw zasilających
UWAGA: Ludzkie fibroblasty napletka (HFF-1) zostały wcześniej zamrożone w 1 ml roztworu do zamrażania składającego się z 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywane w ciekłym azocie do momentu użycia.
<ol>
	<li>Rozmrozić kriogeniczną fiolkę HFF-1 (1 ml), zanurzając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj rozmrożoną zawartość fiolki kriogenicznej do wstępnie podgrzanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionego 10% FBS, aby uzyskać rozcieńczenie 1:10.</li>
	<li>Rozcieńczone komórki (10 ml) należy rozsiać w kolbie T75 i wyhodować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia zmień podłoże, aby wyeliminować resztki DMSO. Usuń pożywkę i dodaj 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS.</li>
	<li>Hoduj HFF i zmieniaj pożywkę co 48 godzin, aż kultura osiągnie etap zlewania. Może to potrwać około 7 do 10 dni.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór inaktywacyjny, należy rozcieńczyć mitomycynę C w DMEM uzupełnioną 10% FBS w końcowym stężeniu 10 μg/ml. Inkubować komórki z roztworem inaktywacyjnym przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Usuń roztwór inaktywacyjny i trzykrotnie przepłucz komórki 2 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby wyeliminować pozostałości mitomycyny C.</li>
	<li>Aby odłączyć inaktywowane komórki, dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby upewnić się, że są odłączone (obiektyw 10x z aperturą numeryczną 0,3 lub NA). Jeżeli tak nie jest, inkubować je jeszcze przez kilka minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Sprawdź komórki ponownie pod odwróconym mikroskopem.</li>
	<li>Odpipetować roztwór pipetą Pasteura w celu dysocjacji grudek komórek.</li>
	<li>Zneutralizować roztwór enzymatyczny, dodając 4 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS i zawiesić.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność zawiesiny komórek i rozcieńczyć w HBSS w stosunku 1:100. Aby określić liczbę komórek, należy załadować 10 μl rozcieńczenia do komory Neubauera. Policz komórki znajdujące się w jednym z dużych kwadratów komory pod mikroskopem odwróconym (obiektyw 20x z 0,45 NA).
	<ol>
		<li>Powtórz liczenie w sumie w czterech dużych kwadratach. Oblicz całkowitą liczbę komórek (N) jako N = średnia liczba policzonych komórek x całkowita objętość x rozcieńczenie x 104.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resztę próbki odwirować przez 5 minut przy sile 200 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad roztworem zamrażającym o stężeniu10-6 komórek na ml.</li>
	<li>Podwielokrotność zawiesiny umieścić w fiolkach kriogenicznych po 10 6 komórek (1 ml) każda. Umieścić fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania i zamrażać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Następnego dnia przechowuj fiolki kriogeniczne w ciekłym azocie.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek karmiących
<ol>
	<li>Od jednego do czterech dni przed rozpoczęciem procesu wyprowadzania rozmrozić fiolkę kriogeniczną zawierającą 1 x 106 inaktywowanych komórek HFF-1 w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć rozmrożony HFF-1 w podgrzanym DMEM uzupełnionym 10% FBS i utrzymywać temperaturę na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Napełnij każdą studzienkę 4-dołkowej płytki 500 μl wstępnie podgrzanej 0,2% żelatyny ze skóry świń i utrzymuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć 500 μl żelatyny ze studzienek i dodać 500 μl rozcieńczenia HFF. Delikatnie kołysz płytą, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie HFF na dnie studzienek. Unikaj ruchów okrężnych, w przeciwnym razie komórki skoncentrują się w środku studni.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy inaktywowanych HFF w każdym dołku.</li>
	<li>Następnego dnia obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem (obiektyw 10X z 0,3 NA) i sprawdź, czy są przyczepione i równomiernie rozmieszczone. Zmień podłoże, aby wyeliminować resztki DMSO. Usuń pożywkę i dodaj 500 μl wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS.</li>
</ol>
3. Pobieranie i hodowla zarodków
<ol>
	<li>Cztery dni przed pobraniem zarodka należy podać 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy we wstrzyknięciu dootrzewnowym 6-12 tygodniowym samicom myszy. 
	UWAGA: Użyliśmy samic ze szczepów 129S2 lub B6CFAF1, chociaż można użyć samic z innych szczepów myszy. Niemniej jednak, podczas pracy z samicami ze szczepów niepermisywnych (np. CBA), pożywkę należy uzupełnić o 2i, jak wspomniano w kroku 4.2.</li>
	<li>Po 48 godzinach podać 5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej we wstrzyknięciu dootrzewnowym i kojarzyć samice z samcami w wieku co najmniej 8 tygodni w stosunku 1:1. Następnego dnia oddziel samice od samców.</li>
	<li>Dzień przed pobraniem zarodków przygotuj szalkę Petriego o średnicy 35 mm z kilkoma 40 μl kropli pożywki KSOMaag uzupełnionej 4 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i napełnij płytkę olejem mineralnym, aby całkowicie pokryć krople. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu zrównoważenia pożywki.</li>
	<li>Aby przygotować pipety do manipulacji zarodkami, podgrzej cieńszą część szklanej pipety Pasteura z długą końcówką za pomocą palnika Bunsena. Gdy zmięknie, wyjmij go z płomienia i rozsuń oba końce. Przełam go na żądaną długość. Średnica wewnętrzna końcówki powinna wynosić 100-150 μm.</li>
	<li>Eutanazja samic myszy przez zwichnięcie szyjki macicy 45-48 godzin po stosunku (p.c.).</li>
	<li>Wypreparuj myszy, aby odsłonić jamę brzuszną, przecinając skórę zakrzywionymi, gładkimi, ostrymi nożyczkami, a otrzewną prostymi, ostrymi nożyczkami. Chwyć jedną macicę kleszczami, odetnij jajowód za pomocą prostych, ostrych nożyczek i umieść go w pożywce CZB buforowanej przez Hepes (HCZB)13 w temperaturze 37 °C. Powtórz proces, aby usunąć drugi jajowód.</li>
	<li>Przepłucz jajowody strzykawką o pojemności 1 ml wypełnioną HCZB, przytrzymywaną przez kleszcze zegarmistrzowskie, aby zebrać 2-komórkowe zarodki. 
	UWAGA: Aby przygotować igłę do płukania, weź igłę podskórną o sile 30 G, odetnij koniec i zmielić na końcówkę na kamieniu ściernym.</li>
	<li>Za pomocą pipety doustnej pobrać zarodki, umyć je w HCZB i wyhodować w przygotowanym wcześniej naczyniu do hodowli zarodków w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do stadium blastocysty. W każdej kropli o pojemności 40 μl można wyhodować do 50 zarodków. Monitoruj rozwój zarodka co 24 godziny pod mikroskopem stereoskopowym. 
	UWAGA: Alternatywnie zarodki można pobrać w stadium blastocysty w celu skrócenia hodowli zarodków in vitro. W takim przypadku należy poddać samice eutanazji w 3,5 - 4,5 p.c., wyciąć macicę. i przepłukać go HCZB.</li>
</ol>
4. Pochodzenie komórek macierzystych
<ol>
	<li>Przygotowanie płytek wyprowadzających
	<ol>
		<li>W dniu wysiewu zarodków przygotuj pożywkę pochodną, uzupełniając pożywkę DMEM o 100 μM 2-β merkaptoetanolu, 1x aminokwasy endogenne, 20% zamiennika surowicy i 103 U/ml LIF.</li>
		<li>W razie potrzeby dodać również 1 μM inhibitora MEK PD0325901 i 3 μM inhibitora GSK3 CHIR99021 uzyskać pożywkę 2i.</li>
		<li>Pobrać z inkubatora płytkę 4-dołkową z monowarstwą inaktywowanych HFF (krok 2.6). Usunąć pożywkę i dodać 800 μl wstępnie podgrzanej pożywki pochodnej do każdej studzienki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie osłony przejrzystej i wysiew zarodków
	<ol>
		<li>Przygotować szalkę Petriego o średnicy 35 mm z trzema 30 μl kropli kwaśnego roztworu Tyrode'a14 i trzema kroplami po 30 μl pożywki pochodnej. Przykryj krople olejem mineralnym i utrzymuj naczynie w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wyjmij naczynie do hodowli zarodków z inkubatora. Jedna po drugiej, przenieś blastocysty z kropli hodowlanych do kropli kwaśnego roztworu Tyrode'a za pomocą pipety do manipulacji zarodkami. Jeśli to możliwe, wybierz tylko rozszerzone blastocysty, aby rozpocząć proces wyprowadzania.</li>
		<li>Monitorować trawienie osłonki przejrzystej pod mikroskopem stereoskopowym. Gdy tylko osłonka przejrzysta zniknie, przenieś blastocystę do kropli pożywki pochodnej, aby wypłukać kwaśny roztwór Tyrode.</li>
		<li>Weź 4-dołkową płytkę wyprowadzającą z inkubatora i wysiewaj jedną blastocystę wolną od zony na komórkach zasilających w każdym dołku.</li>
		<li>Umieścić 4-dołkową płytkę wyprowadzającą z powrotem w inkubatorze i hodować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitorowanie wzrostu komórek macierzystych i zmian pożywki
	<ol>
		<li>Monitoruj kultury co 24 godziny pod mikroskopem odwróconym (obiektyw 20X z 0,45 NA). Ważne jest, aby zwrócić uwagę, czy występują oznaki różnicowania komórek macierzystych, takie jak obrzęk komórek refrakcyjnych otaczających wyrostek lub nawet odsuwanie komórek żywicielskich na bok.</li>
		<li>Co drugi dzień zmieniaj medium kultury. Wyjąć płytkę 4-dołkową z inkubatora, usunąć pożywkę z każdej studzienki i dodać 800 μl wstępnie podgrzanej pożywki pochodnej uzupełnionej LIF i 2i, jeśli jest używane. Utrzymuj kulturę, aż zaobserwuje się wyrostki (6-8 dni).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Hodowla i utrzymanie komórek macierzystych
<ol>
	<li>Przygotuj uchwyty podobne do Kollegego i pipety do manipulacji komórkami macierzystymi. Wykonaj krok 3.4, aby przygotować pipety do manipulacji komórkami macierzystymi o średnicy wewnętrznej na końcówce 250-300 μm. Użyj drugiej części ciągniętej pipety Pasteura, aby przygotować uchwyt podobny do Kollegego. Podgrzej i uformuj do uzyskania haczyka.</li>
	<li>Wyjmij 4-dołkową płytkę hodowlaną z inkubatora i zlokalizuj wyrostek pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj uchwytu, aby odepchnąć zróżnicowane komórki i karmniki otaczające odrost. 
	UWAGA: Aby uniknąć ewentualnego różnicowania wyrostka, ważne jest, aby usunąć wszystkie zróżnicowane komórki z krawędzi wyrostka.</li>
	<li>Odessać wyrostek za pomocą pipety do manipulacji komórkami macierzystymi i umieścić go w nowym naczyniu w kropli 50 μl trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby przeciąć odrost na kilka części, aby zdezagregować go zarówno mechanicznie, jak i enzymatycznie.</li>
	<li>Od razu przenieś fragmenty wyrostka do świeżej kropli pożywki pochodnej, aby zneutralizować działanie trypsyny.</li>
	<li>Przenieś fragmenty wyrostka na nową 4-dołkową płytkę z monowarstwą podajników. Przenieść do 10 fragmentów na studzienkę i wyhodować je za pomocą pożywki pochodnej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Utrzymuj hodowle podobne do komórek macierzystych przez co najmniej sześć tygodni, zanim rozważysz ustalenie linii mESC. Zmieniaj podłoże co drugi dzień i subkulturuj je raz w tygodniu.</li>
</ol>

<ol><li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li>
<li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2760894">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li>
<li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).</li>
<li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/pluripotent-stem-cells/conditions-and-techniques-for-mouse-embryonic-stem-cell-derivation-and-culture">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li>
<li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+%28ES%29+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li>
<li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż wyprowadzanie linii mESC jest dobrze znaną procedurą rutynowo stosowaną w wielu laboratoriach, jej skuteczność nie zawsze jest tak wysoka, jak oczekiwano, ze względu na wiele czynników, które mogą zakłócać utrzymanie pluripotencji. W niniejszym artykule pokazujemy krok po kroku, jak ustanowić linie mESC o wysokiej wydajności za pomocą prostego i niezawodnego protokołu. Sprawności te są podobne do tych podawanych w literaturze. 
Aby zapewnić maksymalną wydajność, ważne jest, aby kontrol...

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) to pluripotencjalne komórki pochodzące z embrionów preimplantacyjnych, które zachowują zdolność do samoodnawiania się lub różnicowania w określonych warunkach1. Opierając się na tych właściwościach, ESC stały się użytecznym narzędziem w medycynie regeneracyjnej, modelowaniu chorób i badaniach inżynierii tkankowej2.
ESC zostały po raz pierwszy uzyskane z preimplantacyjnych zarodków myszy, dając początek mysim liniom ESC (mESC) o niskim sukcesie3,4. Przez lata skuteczność derywacji pozostawała niska ze względu na trudności w utrzymaniu pluripotencji in vitro. Oprócz obecności komórek zasilających5, które poprawiają efektywność wyprowadzania, promują przyłączanie się do kolonii i zwiększają stabilność kariotypową6, kilka modyfikacji protokołu prowadzi do poprawy utrzymania pluripotencji. Najważniejsze z nich to dodanie czynnika hamującego białaczkę (LIF) do pożywki hodowlanej mESC7,8, wykorzystanie zarodków z 129S2 permisive background9 oraz hodowla mESC z pożywką uzupełnioną zdefiniowaną surowicą, wolną od potencjalnych czynników różnicujących10. Niedawne przekonujące dowody wykazały, że dodanie koktajlu dwóch małocząsteczkowych modulatorów szlaków sygnałowych do pożywki hodowlanej mESC (znanej jako 2i) jest najlepsze dla utrzymania pluripotencji. Koktajl 2i składa się z połączenia inhibitora MEK PD0325901, który zmniejsza sygnały różnicowania poprzez hamowanie szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), oraz inhibitora GSK3β CHIR99021, który zwiększa przeżywalność komórek przy niskiej gęstości poprzez aktywację szlaku Wnt11. 
W tym artykule opisujemy prosty protokół do efektywnego wyprowadzania linii mESC z blastocyst myszy. Postępujemy zgodnie ze standardowymi procedurami, hodując zarodki ze szczepów permisywnych na komórkach żywicielskich w pożywce pochodnej uzupełnionej LIF i zamiennikiem surowicy12. Zgodnie z tym protokołem, linie mESC mogą być wyprowadzane z wydajnością równoważną do tych uzyskiwanych w pożywce 2i. Mimo to, 2i można dodać, aby uniknąć ewentualnych problemów z utrzymaniem pluripotencji lub podczas pracy ze szczepami niedopuszczającymi plonów.

<table><tbody><tr><td>1 ml sryringe</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>2-&beta;-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 4-dołkowa</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Kwaśny roztwór tyrody&nbsp;</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Zobacz przepis w Nagy i in., 2003. W przypadku krótkotrwałego przechowywania (do 1 miesiąca) należy przechowywać w temperaturze 4&ordm;C. Alternatywnie, w przypadku długotrwałego przechowywania należy przechowywać go w temperaturze -20&ordm;C. Jeśli wydajność roztworu maleje, należy go zakwasić przez dodanie niewielkiej kropli HCl 1M.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak anty-mysie IgG,</td><td>sondy molekularne Alexa Fluor 488 - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>rozcieńczenie 1:500. Przeciwciało drugorzędowe dla mysich przeciwciał Oct4, Tuj1, &alpha;SMA i AFP.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>Rozpuścić w 2,15 ml DMSO na każdy mg proszku, aby otrzymać 1 mM roztwór podstawowy. Porcjować w żądanej objętości i przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania.&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Dezaktywuj go przed użyciem przez ogrzewanie przez 30 minut w temperaturze 56&00C. Porcję i przechowuj w temperaturze -20&ordm; C</td></tr><tr><td>Igła do płukania</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td><td>Odetnij koniec igły i zmielić na koniec na kamieniu ściernym</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry wieprzowej</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Rozcieńczyć 0,2% w wodzie destylowanej i autoklawować. Każde rozcieńczenie można stosować przez miesiąc.</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, sondy molekularne Alexa Fluor 594</td><td>- Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>rozcieńczenie 1:500. Przeciwciało drugorzędowe dla przeciwciała królika Sox2.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>CZB&nbsp buforowany hepes;</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Zobacz kompozycję w Chatot i wsp., 1989</td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmówkowa</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Rozcieńczyć w NaCl 0,9% przy 50 j.m./ml. Podwielokrotność podsycić w 1 ml i przechowywać w temperaturze -20&ordm; C przez okres do dwóch miesięcy. Po rozmrożeniu nie zamrażaj ponownie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ludzkie fibroblasty napletka</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>Do długotrwałego przechowywania zaleca się przechowywanie ich w ciekłym azocie.</td></tr><tr><td>Technologie zastępowania życia w surowicy KnockOut</td><td></td><td>&nbsp; 10828-028</td><td>Światłoczuły. Zaleca się porcjowanie go w małych objętościach, takich jak 10 ml, i przechowywanie w temperaturze -20&ordm; C (sprawdź datę ważności). Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Suplement o działaniu 4 mg/ml BSA. Równowaga przy 37&ordm; C i 5% CO2 dziennie przed użyciem.</td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>myszy&nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>Zaleca się stosowanie myszy ze szczepu permisywnego pod względem pochodnego mESC (takiego jak 129S2 lub C57BL). Jednak szczepy wsobne są mniej wydajne w produkcji zarodków. Dlatego zaleca się stosowanie odmiany hybrydowej, takiej jak 129S2 x C57BL lub B6CBAF1, aby wykorzystać wigor hybrydy.</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Testowany na zarodkach. Światłoczuły.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Rozpuść proszek w wodzie MilliQ w stężeniu 0,5 mg/ml. Przechowywać w 4&ordm; C chroniony przed światłem. Uwaga, jest szkodliwy i podejrzewa się, że powoduje raka.</td></tr><tr><td>Mysia antytubulina &beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty-&alfa;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty-AFP</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>rozcieńczenie 1:50</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty Oct3/4&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>Rozcieńczenie 1:50</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>Rozpuścić w 2,08 ml DMSO na każdy mg proszku, aby otrzymać 1 mM roztwór podstawowy. Podwielokrotność porcjować w żądanej objętości i przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania.</td></tr><tr><td>szalka Petriego (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina surowicy ciężarnej klaczy</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Rozcieńczyć w NaCl 0,9% przy 50 j.m./ml. Podajcie w 1 ml i przechowywać w temperaturze -20&ordm; C przez okres do dwóch miesięcy. Po rozmrożeniu nie zamrażaj ponownie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>T75 falcon</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Rozcieńczyć 1:10 w HBSS w celu uzyskania 1x roztworu</td></tr></tbody></table>

pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Pozyskiwanie mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) to proces, w którym z zarodków preimplantacyjnych tworzone są pluripotencjalne linie komórkowe. Linie te zachowują zdolność do samoodnawiania się lub różnicowania w określonych warunkach. Ze względu na te właściwości mESC są użytecznym narzędziem w medycynie regeneracyjnej, modelowaniu chorób i badaniach inżynierii tkankowej. W artykule opisano prosty protokół uzyskiwania linii mESC o wysokiej skuteczności derywacji (60-80%) poprzez hodowlę blastocyst z permisywnych szczepów myszy na komórkach karmiących w określonym pożywce uzupełnionej czynnikiem hamującym białaczkę. Protokół może być również stosowany do skutecznego wyprowadzania linii mESC z niepermisywnych szczepów myszy, poprzez proste dodanie koktajlu dwóch małocząsteczkowych inhibitorów do pożywki pochodnej (pożywki 2i). Podano szczegółowe procedury dotyczące przygotowania i hodowli komórek żywicielskich, pobierania i hodowli zarodków myszy oraz wyprowadzania i hodowli linii mESC. Protokół ten nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być przeprowadzony w dowolnym laboratorium posiadającym podstawową wiedzę z zakresu hodowli komórek ssaków.

Postępując zgodnie z tym protokołem, po pierwszym tygodniu hodowli powinno dojść do powstania przerostów w ponad 95% przypadków (Rysunek 1A). Ustanowienie linii mESC po sześciu pasażach jest zmienne pomiędzy powtórzeniami doświadczalnymi, przy średniej skuteczności na poziomie 60-80%. Dodatek 2i nie poprawia znacząco wyników w przypadku pracy z permissywnymi szczepami myszy, takimi jak te o tle 129S2, jest on jednak niezbędny przy pracy ze szczepami niepermis...

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Komórki macierzyste są pluripotencjalnymi i wyspecjalizowanymi komórkami, które charakteryzują się zdolnością do długotrwałej samoodnowy oraz możliwością różnicowania się w komórki pochodzące z trzech listków zarodkowych w określonych warunkach. Dzięki tym właściwościom komórki macierzyste wykazują ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej, modelowaniu chorób i inżynierii zwierząt. Przez lata linie embrionalnych komórek macierzystych przeznaczonych do celów badawczych były pozyskiwane głównie z embrionów myszy, jednak ogólnie osiągana wydajność ich izolacji była niska.W tym filmie przedstawiamy prosty protokół wyprowadzania linii embrionalnych komórek macierzystych myszy w standardowych warunkach, który zapewnia stosunkowo wysoką wydajność wyprowadzania, porównywalną z wydajnością uzyskiwaną przy zastosowaniu modulatorów szlaków sygnałowych, takich jak 2i. W tym protokole wykorzystamy fibroblastów z napletka ludzkiego jako komórki karmne do wyprowadzania i hodowli ESC. Przed rozpoczęciem procesu wyprowadzania ESC konieczne jest inaktywowanie komórek karmnych.W pierwszej kolejności należy pobrać z przechowywanego w ciekłym azocie krioprzewodu fibroblastów prątków skóry przesączon

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu sprawia, że stanowią one ogromną obietnicę zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym materiale przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalną izolację masy komórkowej...

Wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

W niniejszym filmie prezentujemy izolację blastocyst myszy oraz wyprowadzenie komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst. Opisujemy również warunki utrzymania właściwości macierzystych komórek, a także indukcję ich różnicowania w hodowli.

Wytwarzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Prosta metoda pozyskiwania i utrzymywania linii komórek macierzystych i progenitorowych spermatogoniów od dorosłych myszy jest przedstawiona tutaj.  Metoda wykorzystuje komórki zasilające pochodzące z przedziału komórki somatycznej jądra dorosłej myszy. Ta technika ma zastosowanie do popularnych szczepów myszy, w tym myszy transgenicznych, nokautujących i knock-in.

Seryjne wzbogacanie spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych (SSC) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii SSC dorosłych myszy

W ostatnich latach tworzenie komórek rozrodczych przy użyciu metod hodowli in vitro zostało zademonstrowane przy użyciu kilku różnych typów somatycznych komórek macierzystych. W tym artykule wizualnie przedstawimy różnicowanie nowonarodzonych komórek macierzystych pochodzących od myszy do wczesnych komórek podobnych do oocytów.

Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.

Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Naucz się pozyskiwać linie komórek macierzystych z blastocyst myszy przy użyciu ludzkich fibroblastów skóry przedniej jako komórek podporowych. Protokół zapewnia wysoką wydajność porównywalną z metodami 2i.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Przeglądaj więcej filmów