Name: Piezoelektryczne chirurgiczne usuwanie okostnego ciała o wysokiej dokładności (PHASOR): technika poprawy chirurgii okna czaszkowego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj piezoelektryczną technikę chirurgiczną PHASOR do precyzyjnego tworzenia okna czaszkowego u myszy. Ta metoda skraca czas operacji, zmniejsza powikłania i umożliwia wysokiej jakości obrazowanie neuronalne in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tamara Zeric za pomoc w uzyskaniu obrazu wielofotonowego w tym artykule. Wspierane przez Brain & Behavior, Parkinson i JPB Foundations, R01 MH108186 i R01 DA07418. Stypendium F31 1F31MH109293-01A1 do S C.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami ustalonymi przez Columbia University Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eutanazję przeprowadzono poprzez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu ketaminą 100 mg/kg i ksylazyną 10 mg/kg wstrzykniętymi dootrzewnowo. Wszystkie zabiegi chirurgiczne były wykonywane w sposób sterylny (chirurg miał na sobie czepek na głowę, maskę na twarz, sterylne rękawiczki i czysty jednorazowy fartuch laboratoryjny), a narzędzia chirurgiczne były autoklawowane między każdym użyciem.
1. Kroki przedoperacyjne
<ol>
	<li>Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne, aby zapewnić sterylność.</li>
	<li>Znieczulenie myszy C57bl6 izofluranem (4% do indukcji i 1,5-2% do operacji). Ściskaj tylny palec u nogi co 10 minut, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia. Zwiększ znieczulenie, jeśli widoczna jest wokalizacja lub wycofanie kończyn tylnych.</li>
	<li>Nałóż weterynaryjny lubrykant do oczu na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Usuń włosy ze skóry głowy za pomocą 3-minutowej aplikacji żelu do depilacji lub goląc się elektryczną maszynką do</li> golenia.
	<li>Umieść mysz w ramce stereotaktycznej na poduszce grzewczej lub skalibrowanym kocu z recyrkulacją wody ustawionym na 38°C.</li>
	<li>Buprenorfinę (0,1 mg/kg) należy podawać podskórnie w celu zapewnienia przedoperacyjnego działania przeciwbólowego.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę głowy trzema naprzemiennymi aplikacjami chlorheksydyny lub betadyny i 70% etanolu za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 ml bupiwakainy rozcieńczonej w 50% w soli fizjologicznej pod skórę głowy, aby zapewnić znieczulenie miejscowe.</li>
</ol>
2. Piezoelektryczna chirurgia okna czaszki
<ol>
	<li>Za pomocą autoklawowanych sterylnych narzędzi chirurgicznych usuń 1-centymetrowy krąg skóry głowy nad czaszką, przecinając nożyczkami chirurgicznymi w okrągły wzór. Podnieś skórę głowy z czaszki, odsłaniając tkankę okostnej nad kością.</li>
	<li>Użyj końcówki kleszczy, aby zeskrobać odsłoniętą kość z pozostałej tkanki okostnej. Jest to ważne, aby mieć pewność, że cement dentystyczny nie odpadnie później.</li>
	<li>Ustaw piezoelektryczny unit chirurgiczny tak, aby wibrował na najniższym ustawieniu. Należy pamiętać, że wyższe ustawienia mogą powodować pękanie naczyń krwionośnych z powodu intensywnych wibracji.</li>
	<li>Przymocuj sterylną okrągłą końcówkę do rękojeści. 
	UWAGA: Okrągła końcówka o średnicy 4 mm doskonale nadaje się do operacji. Duży rozmiar końcówki przyczynia się do szybkości operacji, ponieważ całe okienko może być jednocześnie przerzedzone.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml lodowatym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF) i trzymaj ją w dłoni, nie trzymając głowicy piezoelektrycznej.</li>
	<li>Przepłukać czaszkę, wlewając ACSF ze strzykawki na czaszkę z szybkością 1 ml/min. Alternatywnie można użyć pompy perystaltycznej umieszczonej nad czaszką, aby uwolnić możliwość korzystania z drugiej ręki. 
	UWAGA: Nawadnianie zimnym ACSF jest ważne, aby zapobiec przegrzaniu z powodu tarcia spowodowanego wibracjami o wysokiej częstotliwości.</li>
	<li>Delikatnie przyłóż wibrującą końcówkę chirurgiczną do czaszki lekkimi okrężnymi ruchami (3 kółka na 1 s) i rozcieńcz kość na żądaną głębokość, aby wykonać cienkie przygotowanie czaszki (5 do 10 min). 
	UWAGA: Tutaj wykonano okna o grubości 4 mm, które zostały pocienione do 20 μm. Jednak rozmiar okienka będzie się różnił w zależności od wielkości końcówki chirurgicznej. Grubość kości można dostosować do żądanej głębokości w zależności od czasu spędzonego na przykładaniu końcówki do czaszki.</li>
	<li>Delikatnie wyreguluj kąt rękojeści i zmień kąt końcówki, jednocześnie wywierając nacisk na czaszkę, aby równomiernie rozrzedzić czaszkę.</li>
	<li>Aby wykonać całkowite usunięcie kości bez pozostawiania cienkiej kości, należy rozrzedzić kość, aż pęknięcia będą widoczne wokół okna. Usuń pozostałe płatki cienkiej kości za pomocą kleszczy, nie uszkadzając leżącej pod spodem opony twardej.</li>
	<li>Namocz 1 mm kawałek hemostatycznej pianki kolagenowej w zimnym ACSF. Przytrzymaj mokrą piankę kleszczami i połóż ją na cienkiej czaszce. Pozostaw go na cienkiej czaszce przez około 30 sekund, aby zapobiec rozwojowi mikrokrwawień.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 4 mm z boku na oknie, które zostało rozrzedzone do kości.</li>
	<li>Użyj tylnej części małego plastikowego lub drewnianego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby nałożyć około 100 μl akrylu dentystycznego na czaszkę, aby utrzymać okno na miejscu.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Wyjmij mysz z aparatu chirurgicznego i umieść ją w podgrzewanej klatce w celu odzyskania zdrowia. Monitoruj go w sposób ciągły, aż odzyska pełną świadomość (ocenianą na podstawie normalnej mobilności, chodu i zachowania).</li>
	<li>Oceniaj zwierzęta dwa razy dziennie przez trzy dni pod kątem objawów bólu pooperacyjnego, w tym zmniejszonej aktywności, pielęgnacji, spożycia pokarmu i wody, zachowań obronnych (np. utykania lub zgarbionej postawy) lub zwiększonej agresji. Nie należy zwracać zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.</li>
	<li>Buprenorfinę (0,05–0,1 mg/kg) podawać podskórnie jako środek przeciwbólowy 8–12 godzin po zabiegu przez 3 dni. Uważnie monitoruj obszar okna po operacji pod kątem rozejścia się, stanu zapalnego i oznak infekcji. Jeśli zwierzę nie powróci do podstawowych zachowań żywieniowych i pielęgnacyjnych, skonsultuj się z weterynarzem w sprawie możliwych interwencji lub eutanazji.</li>
</ol>

<ol><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li>
<li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intravital+thinned+skull+and+cranial+window+approaches+to+study+CNS+immunobiology+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex.</a> Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210017/meta">An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing.</a> Laser Physics Letters. 9, (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skull+Optical+Clearing+Solution+for+Enhancing+Ultrasonic+and+Photoacoustic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Med+Imaging%22%5BJournal%5D)">Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging.</a> IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).</li>
<li>Vercellotti, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezoelectric+surgery+in+implantology%3A+a+case+report--a+new+piezoelectric+ridge+expansion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).</li>
<li>Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+piezoelectric+bony+window+osteotomy+and+sinus+membrane+elevation%3A+introduction+of+a+new+technique+for+simplification+of+the+sinus+augmentation+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).</li>
<li>Vercellotti, T., Podesta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthodontic+microsurgery%3A+a+new+surgically+guided+technique+for+dental+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).</li>
<li>Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4646478/">Piezoelectric surgery in implant dentistry.</a> Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).</li>
<li>Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contemp+Dent+Pract%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li>
<li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0901502711002232">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li>
</ol>

Nie ma żadnych ujawnień.

Zabieg można modyfikować poprzez zmianę końcówki chirurgicznej. Istnieje wiele różnych rozmiarów końcówek, które można zastosować do rękojeści. Zmiana rozmiaru lub kształtu końcówki spowoduje powstanie okien o różnych rozmiarach. Oprócz końcówki 4 mm wypróbowaliśmy również końcówkę 3 mm i stwierdziliśmy, że również działa dobrze. Nawet przy irygacji lodowatym ACSF nie byliśmy w stanie uzyskać dobrych wyników z końcówkami, które były zbyt wąskie (około 0,25 mm) ze względu na skoncentrowane wibracje powodujące zbyt duże ciepło i spalanie kości, co prowadziło do uszkodzenia leżącej poniżej opony twardej. Nie wypróbowaliśmy wielu innych dostępnych końcówek i przewidujemy, że inne laboratoria mogą znaleźć nowe zastosowania dla tych różnych wskazówek. Chociaż operacja jest stosunkowo prosta, odkryliśmy, że istnieje kilka kroków, które mogą wymagać rozwiązania problemu. Pierwszym z nich jest to, że wibrująca końcówka wytwarza duże turbulencje w ACSF, co zmniejsza widoczność i utrudnia określenie głębokości kości na etapie przerzedzania kości podczas operacji. Zalecamy, aby jeśli zbyt trudno jest zobaczyć, jak cienka jest kość, zrób sobie przerwę na wysuszenie czaszki i okna, przykładając sterylny bawełniany wacik z boku kości. Nie nakładaj bawełnianego wacika bezpośrednio na okno, ponieważ szorstka powierzchnia uszkadza cienką kość. Po sprawdzeniu głębokości ponownie nałóż ACSF i kontynuuj operację. Odkryliśmy również, że jeśli dochodzi do uszkodzenia opony twardej, zwykle jest to spowodowane zbyt dużym naciskiem chirurga na końcówkę. Delikatniejsze trzymanie rękojeści i stosowanie mniejszej siły prawdopodobnie rozwiąże ten problem. Jeśli chirurg na siłę zeskrobuje końcówkę kości, spowoduje to pęknięcie cienkiej kości i uszkodzi czaszkę. Wreszcie, jeśli po rozrzedzeniu kości opona twarda pod spodem wydaje się posiniaczona, prawdopodobnie jest to spowodowane nadmiarem ciepła z wibracji. Zwiększenie szybkości przepływu ACSF rozwiąże ten problem.
Głównym ograniczeniem PHASOR jest to, że rękojeść może rozrzedzić kość, ale nie może usunąć całej kości nad oponą twardą. Końcówka pokryta diamentem ma małe szorstkie nierówności. Pocieranie potrzebne do rozrzedzenia czaszki spowodowałoby ścieranie opony twardej i krwawienie, gdyby zostało użyte do usunięcia całej kości. Dlatego do usunięcia pozostałej cienkiej warstwy wymagane jest użycie kleszczy. Chociaż toczy się debata na temat tego, czy obrazowanie przez cienką czaszkę powoduje mniejszy stan zapalny i mniejszą proliferację mikrogleju i reaktywnych astrocytów, w niektórych przypadkach preferowane jest okno, w którym nie pozostała kość, np. w celu zapewnienia większej głębi obrazowania3.
Zoptymalizowaliśmy przygotowanie okna czaszkowego do obrazowania wielofotonowego u myszy. Według naszej wiedzy PHASOR jest pierwszym zastosowaniem techniki piezoelektrycznej w chirurgii okna czaszkowego gryzoni w obrazowaniu optycznym. Odkryliśmy, że zastosowanie chirurgii piezoelektrycznej u myszy ma zalety w postaci zwiększonej prędkości i zmniejszenia zdarzeń niepożądanych zgłaszanych również u ludzi 7,8,9,10. Zastosowanie urządzenia piezoelektrycznego skutkowało szybszymi operacjami (ryc. 2A) i mniejszą liczbą zdarzeń niepożądanych związanych z krwawieniem w porównaniu z szybkoobrotową wiertarką obrotową (ryc. 2B). W naszym laboratorium odkryliśmy również, że PHASOR jest łatwiejszy do nauczenia się dla początkujących chirurgów niż tradycyjne podejścia do chirurgii okna czaszki. Zalety szybkości i łatwości użycia mogą się różnić w zależności od chirurga. Przygotowanie cienkiej czaszki zwykle wymaga 30-45 minut, aby rozrzedzić kość za pomocą wiertła i skalpela2, podczas gdy podejście PHASOR zwykle wymaga mniej niż 10 minut.
Odkryliśmy, że w oknach przygotowanych za pomocą PHASOR mogliśmy zobrazować przejściowe stany nieustalone wapnia w neuronach piramidowych warstwy 4 w korze ruchowej, które zostały transfekowane wirusem związanym z adenowirusem kodującym wskaźnik wapnia JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). Stwierdziliśmy również, że w porównaniu z cienkim oknem czaszkowym przygotowanym za pomocą wiertła obrotowego i skalpela, obszar obrazowania był większy, podczas gdy cienka czaszka przygotowana za pomocą wiertła obrotowego i skalpela ma okienko obrazowania o średnicy 20 μm2. Dzięki PHASOR byliśmy w stanie szybko przerzedzić obszar o 3-4 mm. Jest to podobne do okna obrazowania zgłaszanego za pomocą PoRTS4. To większe okienko zachowuje korzyści płynące z szybkiego obrazowania zgłoszonego dla cienkich okien czaszki przygotowanych za pomocą wiertła dentystycznego i skalpela. Co więcej, okienko przygotowane za pomocą PHASOR może być natychmiast zobrazowane, w przeciwieństwie do tradycyjnych okien usuwania kości, które mogą potrzebować tygodni na zagojenie, zanim okno będzie mogło być optymalnie zobrazowane3.
Technika ta może być stosowana do badania zmian w przepływie krwi w naczyniach pod oponą twardą. Ważnym przyszłym badaniem jest porównanie immunoreaktywności PHASOR z innymi metodami badania okna czaszkowego. Byłoby to ważne dla ustalenia, czy PHASOR powoduje mniej stanu zapalnego w porównaniu z istniejącymi metodami. Mamy nadzieję, że udokumentowana tu piezoelektryczna technika chirurgiczna pozwoli większej liczbie laboratoriów na wykonywanie okien czaszkowych i skuteczne stosowanie obrazowania wielofotonowego in vivo.
Upewnij się, że rękojeść jest ustawiona na wibracje na najniższym ustawieniu i że ACSF jest nawadniany ze stałą szybkością. Lodowaty ACSF musi być stosowany w sposób ciągły, w przeciwnym razie nagrzeje się i uszkodzi oponę twardą. Stwierdziliśmy, że ACSF musi być stosowany w dawce co najmniej 1 ml/min. Albo użyj strzykawki trzymanej w dłoni, albo użyj pompy perystaltycznej, zamiast wbudowanego irygacji w rękojeści. System nawadniania w rękojeści wyrzuca ACSF zbyt mocno i wytwarza zbyt duże turbulencje, co znacznie pogorszy widoczność.

Chirurgia okienka czaszkowego w celu przygotowania gryzoni do obrazowania wielofotonowego in vivo stała się ważną techniką w neurobiologii. Usunięcie lub ścieńczenie kości jest konieczne, aby przygotować mysz do obrazowania optycznego za pomocą mikroskopu wielofotonowego. Operacja ta jest wykonywana albo poprzez całkowite usunięcie obszaru kości w celu odsłonięcia leżącego pod nią opony twardej1, albo przez przerzedzenie obszaru kości bez całkowitego usunięcia z opony twardej2. Podejście oparte na cienkiej czaszce może powodować mniejsze stany zapalne i aktywację mikrogleju3, ale zapewnia płytszą głębokość obrazowania, mniejszy rozmiar okna obrazowania (200 μm) i ograniczony okres czasu, w którym okno może być obrazowane z powodu odrastania kości2. Dodanie okna z polerowanego i wzmocnionego szkła (PoRTS) może zwiększyć rozmiar obrazowania i okres obrazowania, ale jest trudne do wykonania4.
Obie obecne operacje wykorzystują szybkoobrotowe wiertło do rozrzedzania lub usuwania kości z czaszki. Technika cienkiej czaszki wykorzystuje również skalpel po wiertle, aby jeszcze bardziej rozrzedzić kość2. Technika PoRTS wymaga dodatkowego etapu szybkiego polerowania za pomocą grit4. W wysokoobrotowej wiertarce obrotowej turbina lub silnik elektryczny napędzany powietrzem powoduje, że wiertło obraca się z dużą prędkością. Ponieważ wiertła obrotowe tną zarówno kość, jak i tkanki miękkie, istnieje ryzyko uszkodzenia opony twardej i leżących poniżej naczyń krwionośnych. Powodzenie operacji zależy od umiejętności chirurga. Oprócz tych okien przygotowanych metodami chirurgii mechanicznej opracowano chemiczną metodę optycznego oczyszczania czaszki za pomocą różnych roztworów5,6. Ponieważ jednak chirurgia piezoelektryczna jest mechaniczną metodą chirurgii, nasze porównania tutaj będą ograniczone do innych metod mechanicznych.
Piezoelektryczne urządzenia chirurgiczne wykorzystują wibracje ultradźwiękowe do rozbijania zmineralizowanej kości bez uszkadzania leżącej pod nią tkanki miękkiej, a tym samym oferują podejście do szybkiego przerzedzania dużego obszaru kości. W piezoelektrycznej rękojeści chirurgicznej turbina jest zastąpiona stosem dysków ceramicznych, a po przyłożeniu prądu dyski wibrują z częstotliwościami ultradźwiękowymi. Drgania są przenoszone przez rękojeść na końcówki z powłoką diamentową, aby przecinać kość bez uszkadzania tkanek miękkich, co jest zaletą w porównaniu z wiertłami obrotowymi, które nie rozróżniają typów tkanek. Chirurgia piezoelektryczna została pierwotnie opracowana do stosowania u ludzi przez Tomaso Vercellottiego i doprowadziła do ulepszeń w chirurgii stomatologicznej i czaszkowo-szczękowo-twarzowej7,8,9,10,11.
Chirurgia piezoelektryczna została wykorzystana do stworzenia osteotomii u szczurów Wistar i została stwierdzona przez rezonans magnetyczny (MRI) i histologię, że powoduje znacznie mniejsze uszkodzenia niż tradycyjne wiertło dentystyczne12. Autorzy doszli do wniosku, że chirurgia piezoelektryczna jest bezpieczna w usuwaniu kości w pobliżu miękkiej tkanki mózgowej. Myszy mają jednak cieńszą oponę twardą, która łatwiej ulega uszkodzeniu, a to badanie nie przygotowało okien do przewlekłego obrazowania optycznego. Przewlekłe obrazowanie wymaga, aby naczynia krwionośne nie były uszkodzone i aby pod oknem nie tworzyły się skrzepy krwi. Uszkodzenie opony twardej prowadzi do stanu zapalnego, który powoduje zmętnienie okna i aktywuje mikroglej oraz proliferację reaktywnych astrocytów. Tutaj zoptymalizowaliśmy chirurgię piezoelektryczną dla myszy, aby stworzyć zarówno cienką czaszkę, jak i pełne okna czaszkowe do usuwania kości, odpowiednie do przewlekłego obrazowania. Porównaliśmy tę technikę chirurgiczną do operacji okna czaszkowego przygotowanych za pomocą szybkoobrotowej wiertarki obrotowej.

<table><tbody><tr><td>Piezosurgery Touch</td><td>Mectron</td><td>5120062</td><td>Piezosurgery GP model ma te same ustawienia</td></tr><tr><td>Okrągła płaska końcówka piezochirurgiczna 4 mm (# OT11)</td><td>Mectron</td><td>3370019</td><td>Ta końcówka była idealna dla naszych okien, ale dostępnych jest wiele innych końcówek o różnych rozmiarach.</td></tr><tr><td>Ramka Stereotax</td><td>Kopf</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>Adapter myszy</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna do nawadniania.</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-77120-42</td><td>Ułatwia nawadnianie i uwalnia drugą rękę, zapewniając stabilność. W razie potrzeby irygację można wykonać ręcznie za pomocą strzykawki.</td></tr><tr><td>Avitene Ultrafoam</td><td>Bard-Davol</td><td>1050020</td><td>Ważne, aby natychmiast zatrzymać wszelkie drobne krwawienia.</td></tr><tr><td>C& B Metabond</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td>Znacznie mocniejszy niż zwykły akryl dentystyczny.</td></tr><tr><td>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna Puralube</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Myszy</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop wielofotonowy Prairie Ultima</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td>Rdzeń <td></td><td></td><td>wektorowy UPENN</td></tr></tbody></table>

piezoelektryczne chirurgiczne usuwanie okostnego ciała o wysokiej dokładności (phasor): technika poprawy chirurgii okna czaszkowego u myszy

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Mikroskopia wielofotonowa została szeroko przystosowana do obrazowania neuronów in vivo. Wielokrotne obrazowanie wymaga wszczepienia okienka czaszkowego lub wielokrotnego ścieńczenia czaszki. Chirurgia okienka czaszkowego jest zwykle wykonywana za pomocą szybkoobrotowego wiertła obrotowego, a wielu badaczy uważa, że trudno jest zapobiec uszkodzeniu delikatnej opony twardej i naczyń krwionośnych przez wiertło. Do usunięcia kości bez uszkodzenia leżącej pod nią tkanki wymagany jest intensywny trening i praktyka, a zatem operacja okna czaszkowego może być trudna, czasochłonna i powodować uszkodzenie tkanek. Chirurgia piezoelektryczna, która jest szeroko stosowana w chirurgii szczękowo-twarzowej i stomatologicznej, wykorzystuje wibracje ultradźwiękowe do usuwania kości bez uszkadzania tkanek miękkich. Opracowaliśmy metodę wykorzystującą chirurgię piezoelektryczną w celu poprawy chirurgii okna czaszkowego u myszy w ramach przygotowań do obrazowania wielofotonowego. Porównania w naszym laboratorium wykazały, że metoda ta wymaga krótszego czasu operacji i ma niższy średni wskaźnik powikłań spowodowanych krwawieniem z opony twardej niż operacja okna czaszki za pomocą wiertła obrotowego.

Przed przystąpieniem do chirurgii piezoelektrycznej należy usunąć pozostałości nadkostnej z czaszki. Gdy czaszka stanie się matowa i gładka (Rycina 1a), chirurg może rozpocząć zabieg piezoelektryczny. Podczas usuwania kości za pomocą drgającego wtyku piezoelektrycznego, kluczowe jest irygowanie czaszki lodowatym ACSF. Odpowiednią irygację osiąga się, gdy dolny 1 mm wtyku jest zanurzony w ACSF (Rycina 1b). W przypadku niewłaściwej irygacji kość ulegnie przegrzaniu i spowoduje uszkodzenie mózgu. Gdy kość czaszkowa zostanie oszlifowana do żądanej przez chirurga głębokości, może wystąpić pewne resztkowe krwawienie z naczyń krwionośnych znajdujących się w kości. Aby szybko zatrzymać wszelkie krwawienie, należy nałożyć niewielki, 1 mm kawałek pianki kolagenowej nasączonej ACSF na obszar okienka. Piankę kolagenową należy pozostawić na czaszce przez około 30 s (Rycina 1c). Po usunięciu pianki kolagenowej okienko stanie się półprzezroczyste, umożliwiając wyraźne zobrazowanie naczyń krwionośnych w twardówce. Twardówka pozostanie nietknięta, bez znaczących siniaków (Rycina 1d). Jeśli twardówka wydaje się czerwona i zapalona, najprawdopodobniej jest to spowodowane pękniętymi naczyniami krwionośnymi wskutek zbyt dużego nacisku wywieranego na wtyk podczas zabiegu. Aby chronić nowe okienko i przygotować je do długotrwałego obrazowania, należy umieścić nad nim szklane pokrywkę. Poprawnie założona szklana pokrywka delikatnie spoczywa na okienku i nie powoduje żadnych uszkodzeń w tym obszarze. Szklana pokrywka musi pokrywać całe okienko. Jeśli szklana pokrywka została poprawnie założona na czaszce, okienko pozostanie półprzezroczyste pod szkłem. Wszystkie naczynia krwionośne w twardówce będą nadal widoczne (Rycina 1e). Wokół szklanej pokrywki należy nałożyć akryl dentystyczny, aby trwale przytwierdzić ją do powierzchni czaszki. Krawędzie szklanej pokrywki również muszą być pokryte akrylem dentystycznym (Rycina 1f).
Stwierdziliśmy, że chirurgia piezoelektryczna jest zazwyczaj znacznie szybsza niż tradycyjne okienko czaszkowe i trwa około 10–12 minut na zabieg (Rysunek 2A). Stwierdziliśmy również, że występuje mniej powikłań spowodowanych siniakami i krwawieniami opony miękkiej, co obserwowano gołym okiem (Rysunek 2B). Poprawnie przygotowane okienko pozwala na obrazowanie wielofotonowe fluorescencyjnych wskaźników w neuronach kory mózgowej in vivo. Zdecydowaliśmy się obrazować czerwony wskaźnik wapniowy JRGECO1a w ciałach komórkowych neuronów warstwy 4 kory mózgowej (Rysunek 3A–3B). Mogliśmy obserwować transiency wapniowe w tych ciałach komórkowych przez okienko przygotowane za pomocą PHASOR.
<img alt="Proces regeneracji tkanki; obraz mikroskopowy etapów gojenia; badanie eksperymentalnego naprawy rany." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1: Chirurgia piezoelektryczna. (a) Czaszka po odpowiednim przygotowaniu do PHASOR. Cała tkanka nadkostna została usunięta, pozostawiając gładką i czystą powierzchnię. (b) Przykładowy obraz trwającego zabiegu PHASOR. Dolny 1 mm drgającego narzędzia chirurgicznego jest zanurzony w lodowatej ACSF. Płyn jest podawany na czaszkę w tempie 1 mL/min. Na czaszce stosuje się lekkie ruchy okrężne, a kość jest cieniowana za pomocą ultradźwiękowych drgań. (c) Po ocieniowaniu czaszki, 1 mm okrągły kawałek pianki kolagenowej nasączonej zimnym ACSF pozostawia się na okienku, aby zatrzymać ewentualne mikrouszczelnienia krwawienia z kości. (d) Pomyślne okienko z przezroistą oponą miękką pokazuje wszystkie nieuszkodzone naczynia krwionośne. Na powierzchni mózgu nie widać żadnych uszkodzeń ani siniaków. (e) Nakładka szklana jest umieszczana nad okienkiem w celu ochrony powierzchni mózgu. (f) Akryl dentystyczny jest nanoszony na czaszkę, aby trwale zamocować szklaną nakładkę nad okienkiem. Szerokość podziałki 1 mm na wszystkich obrazach.
<img alt="Wykresy słupkowe porównujące wiertarkę dentystyczną i PHASOR pod względem czasu trwania operacji i współczynnika powodzenia bez krwawienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2. Porównanie współczynnika powodzenia w szkoleniu z zastosowaniem operacji PHASOR lub wiertarki dentystycznej. (A) Średni czas trwania jednej operacji był krótszy przy użyciu PHASOR niż w operacjach z wykorzystaniem wiertarki dentystycznej (p&lt;0,05, dwustronny test t), n = 30 operacji w każdej grupie, średnio 10 operacji na chirurga. (B) Odsetek udanych operacji (określonych jako brak krwawienia lub widocznych uszkodzeń twardówki, ocenionych przez oko chirurga przy użyciu obiektywu ustawionego na 350-krotne powiększenie) był wyższy w przypadku operacji z użyciem PHASOR niż w operacjach z wykorzystaniem wiertarki dentystycznej (n = 30 operacji w każdej grupie, jednostronny test z). Słupki błędów przedstawiają SD.
<img alt="Obrazy mikroskopii fluorescencyjnej, struktury komórkowe wizualizowane w czerwonej fluorescencji, analiza porównawcza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obrazowanie wielofotonowe in vivo przez okienko czaszkowe wytworzone za pomocą PHASOR. (A) Przemijające zmiany stężenia wapnia obserwowane za pomocą czerwonego wskaźnika wapniowego JRGECO1a, obrazowane w neuronach piramidalnych warstwy 4 kory ruchowej myszy in vivo. Szerokość szkali = 100 µm. (B) To samo okienko, ale inny obszar warstwy 4 kory ruchowej. Mysz z unieruchomioną głową z 3 mm okienkiem przygotowanym za pomocą PHASOR. Szerokość szkali = 30 µm. Obrazowanie wykonano za pomocą mikroskopu wielofotonowego, obiektyw 40X, długość fali wzbudzenia 1040 nm.

Chirurgia piezoelektryczna doprowadziła do poprawy w ludzkiej chirurgii szczękowo-twarzowej i stomatologicznej. Opracowaliśmy protokół optymalizacji chirurgii piezoelektrycznej w chirurgii okna czaszkowego u myszy.

Piezoelektryczne chirurgiczne usuwanie okostnego ciała o wysokiej dokładności (PHASOR): technika poprawy chirurgii okna czaszkowego u myszy

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Ogólnym celem tego zabiegu chirurgicznego jest odchudzenie czaszki bez uszkodzenia leżących poniżej tkanek oraz wszczepienie okna czaszkowego odpowiedniego do obrazowania. Metoda ta stanowi ulepszenie chirurgii okna czaszkowego i może umożliwić większej liczbie chirurgów zastosowanie tej techniki. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na skrócenie czasu trwania operacji przy niższym średnim wskaźniku powikłań.Przed rozpoczęciem operacji należy upewnić się, że wszystkie używane instrumenty zostały poddane autoklawowaniu w celu zapewnienia sterylności. Znieczulić mysz izofluranem. Nałożyć weterynaryjny lubrykant do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.Następnie uciśnij palec tylnej łapy, aby upewnić się, że głębokość znieczulenia jest odpowiednia. Dalej usuń owłosienie z okolic czaszki, nakładając żel do depilacji na trzy minuty. Następnie umieść znieczuczoną mysz w aparacie stereotaksycznym na podkładce grzewczej lub skalibrowanym kocu z recyrkulacją wody ustawionym na 38 °C.Upewnij się, że maska do podawania znieczulenia jest prawidłowo umieszczona. Podaj buprenorfinę podskórnie w celu zapewnienia przeciwbólowego przygotowania przedoperacyjnego. Następnie zdezynfekuj skórę głowy, stosując naprzemiennie trzy razy chlorheksydynę lub Betadine oraz 70% ethanol za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.Na koniec, w celu znieczulenia miejscowego, wstrzyknij pod skórę głowy 100 µL bupiwakainy rozcieńczonej 50% w soli fizjologicznej. Do końcówki urządzenia do chirurgii piezoelektrycznej zamocuj sterylną, okrągłą końcówkę o średnicy 4 mm. Duży rozmiar końcówki przyspiesza przebieg operacji, ponieważ pozwala na jednoczesne pocienienie całego okna.Ustaw urządzenie do chirurgii piezoelektrycznej na najniższy poziom wibracji, ponieważ wyższe ustawienia mogą doprowadzić do przerwania naczyń krwionośnych wskutek intensywnych drgań. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml lodowatym ACSF i trzymaj ją w ręce, w której nie znajduje się końcówka piezoelektryczna. Delikatnie przykładaj wibrującą końcówkę chirurgiczną do czaszki, wykonując lekkie ruchy okrężne i cieńcząc kość do pożądanej głębokości, aby przeprowadzić przygotowanie cienkiej czaszki.Iryguj czaszkę, aby zapobiec przegrzaniu spowodowanemu wibracjami o wysokiej częstotliwości, aplikując ACSF z strzykawki na czaszkę z prędkością 1 ml na minutę. Delikatnie koryguj kąt nachylenia końcówki narzędzia, zmieniając jej położenie podczas wywierania nacisku na czaszkę, aby równomiernie ją pocienić. Należy uważać, aby nie pocienić nadmiernie jednego fragmentu okna.Należy delikatnie regulować kąt nachylenia końcówki urządzenia, aby równomiernie odcienić czaszkę. Regularnie sprawdzaj stan czaszki, aby uniknąć usunięcia zbyt dużej ilości kości i uszkodzenia leżącej pod nią tkanki. Na odsłoniętą oponę twardą nałóż jednofalowy kawałek gąbki kolagenowej hemostatycznej o grubości 1 mm, nasączonej zimnym ACSF.Pozostawić na oponie twardej przez około 30 sekund, aby zapobiec powstawaniu mikrokrwawień. Po umieszczeniu czteromilimetrowego szkiełka nakrywkowego bocznie nad cienkim okienkiem, za pomocą tyłu małego plastikowego lub drewnianego aplikatora z watką na końcu nanieść około jednej kropli kleju cyjanoakrylowego w narożnik okienka. Następnie za pomocą końcówek pęsety upewnić się, że szkiełko nakrywkowe tworzy szczelne połączenie z czaszką.Na koniec nanieś 100 µL akrylu stomatologicznego na czaszkę, aby unieruchomić okienko. Dopóki akryl stomatologiczny jest jeszcze miękki, użyj końcówki złamanego drewnianego aplikatora, aby odsunąć nadmiar materiału zasłaniający okno obrazowania. Po zakończeniu wyjmij mysz z aparatu chirurgicznego i umieść ją w ogrzewanej klatce w celu rekonwalescencji.Monitoruj zwierzę w sposób ciągły, aż mysz odzyska pełną przytomność, co należy ocenić na podstawie normalnej mobilności, chodu i zachowania. Przez trzy dni oceniaj zwierzęta dwa razy dziennie pod kątem objawów bólu pooperacyjnego, w tym zmniejszonej aktywności, pielęgnacji, spożycia pokarmu i wody, zachowań obronnych lub zwiększonej agresji. Podawaj buprenorfinę podskórnie jako środek przeciwbólowy od 8 do 12 godzin po operacji przez trzy dni, zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC.Monitoruj obszar okna pod kątem rozwarstwienia, stanu zapalnego i oznak infekcji. Przejściowe zmiany stężenia wapnia, obserwowane przy użyciu czerwonego wskaźnika wapnia jRGECO1a, zostały zobrazowane w czystych neuronach warstwy czwartej kory ruchowej u myszy z unieruchomioną głową, z trzymilimetrowym oknem przygotowanym za pomocą PHASOR. To zdjęcie zostało wykonane przez to samo okno, ale przedstawia inny region warstwy czwartej kory ruchowej.Jak widać tutaj, czas trwania operacji był krótszy w przypadku PHASOR niż przy użyciu wiertła stomatologicznego, z istotnością statystyczną określoną jako P < 0.05 w dwustronnym teście T. Odsetek udanych operacji, zdefiniowanych jako brak krwawienia lub widocznych uszkodzeń opony twardej, był wyższy dla PHASOR niż dla operacji z użyciem wiertła stomatologicznego, co oceniono za pomocą jednostronnego testu Z. Po opanowaniu techniki, może ona zostać wykonana w czasie krótszym niż 10 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić różne metody obrazowania in vivo, w tym obrazowanie wielofotonowe, w celu wizualizacji neuronów in vivo. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

piezo-high-accuracy-surgical-osteal-removal-phasor-technique-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wprowadzenie prawokątnych mikropryzmatów do nowokory mózgu myszy umożliwia głębokie obrazowanie wielu warstw kory z perspektywy typowej dla preparatów przekrojowych. Mikropryzmaty o rozmiarze jednego milimetra zapewniają szerokie pole widzenia (~900 μm) oraz rozdzielczość przestrzenną wystarczającą do zobrazowania kolców dendrytycznych. Prezentujemy obrazowanie neuronów warstwy V oraz obrazowanie naczyń krwionośnych nowokory z wykorzystaniem mikropryzmatów.

Obrazowanie in vivo głębokich warstw kory mózgowej z wykorzystaniem mikropryzmatu

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

W tym filmie opisujemy procedurę chirurgiczną mającą na celu stworzenie okna kalwaryjnego umożliwiającego dostęp do mózgu modelu myszy.

Generowanie okna kalwaryjnego w modelu myszy: zabieg chirurgiczny mający na celu utworzenie okna w górnej części czaszki myszy

Ten film przedstawia zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu okna czaszkowego w modelu mysim w celu zapewnienia stabilnego dostępu optycznego do różnych obszarów mózgu.

Implantacja okienka obrazowania czaszki w modelu mysim: zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu szkiełka nakrywkowego na bazie szkła w celu stabilnego dostępu optycznego do obszarów mózgu myszy

Ten film demonstruje rejestrację aktywności neuronalnej mózgu przez okno optyczne u myszy transgenicznych. Myszy wyrażają białko fluorescencyjne, które umożliwia wykrywanie aktywności neuronalnej. Niewielka część czaszki jest ostrożnie usuwana w celu zainstalowania okna optycznego, a następnie czaszka jest pokrywana czarnym cementem, aby zablokować światło przed obrazowaniem.

Instalacja okien optycznych w mózgu myszy transgenicznych w celu zobrazowania aktywności neuronalnej

Prezentujemy metodę tworzenia okna korowego z cieńszą czaszką (TSCW) w modelu mysim do obrazowania in vivo OCT kory mózgowej.

Technika cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania w optycznej tomografii koherentnej in vivo

Obrazowanie dwufotonowe, sprzężone z nanodysekcją laserową, są użytecznymi narzędziami do badania procesów zwyrodnieniowych i regeneracyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym z rozdzielczością subkomórkową. Protokół ten pokazuje, jak oznaczać, obrazować i preparować pojedyncze włókna pnące w korze móżdżku in vivo.

Laserowa nanochirurgia aksonów móżdżku in vivo

Okna czaszkowe stały się powszechnie stosowaną techniką chirurgiczną, która umożliwia obrazowanie przyżyciowe u myszy transgenicznych. Protokół ten opisuje użycie robota chirurgicznego, który wykonuje półautomatyczne wiercenie kości w oknach czaszki i może pomóc zmniejszyć zmienność między chirurgami i częściowo złagodzić termiczne uszkodzenie bariery krew-mózg.

Ocena uszkodzeń termicznych spowodowanych kraniotomią z nawierceniem przez robota w chirurgii okienka czaszkowego u myszy

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę analizy naprawy kości żuchwy. Opisujemy powtarzalną technikę nieustabilizowanego złamania żuchwy w modelu mysim, pozwalającą na analizę procesu naprawy kości śródchrzęstnej przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i ubytku kości.

Mniej inwazyjna technika niestabilizowanego złamania żuchwy w modelach mysich

W badaniu przedstawiono skalowalną, wiarygodną i odtwarzalną metodę powtarzających się przewlekłych zapisów korowych w modelu świni. Metoda ma zastosowanie w różnych dziedzinach neuronauki, w tym w badaniach nad bólem i diagnostyce chorób neurologicznych.

Technika przewlekłego okna czaszkowego do powtarzających się zapisów korowych podczas znieczulenia u świń

Protokół ten opisuje dwufazową metodę chirurgiczną mającą na celu stworzenie dużego, ponownie zamykalnego, oszczędzającego dura okno czaszkowe u myszy. Technika ta umożliwia przewlekłe, wielomodalne zapisy elektrofizjologiczne z rozproszonych, głębokich sieci mózgowych, takich jak Sieć Trybu Domyślnego, przez kilka tygodni.

Protokół chirurgiczny dla dużego, zamykalnego okna czaszkowego umożliwiającego podłużne, wielomodalne rejestrowanie elektrofizjologii sieci domyślnej myszy

Poznaj piezoelektryczną technikę chirurgiczną PHASOR do precyzyjnego tworzenia okna czaszkowego u myszy. Ta metoda skraca czas operacji, zmniejsza powikłania i umożliwia wysokiej jakości obrazowanie neuronalne in vivo.

Piezoelektryczne chirurgiczne usuwanie okostnego ciała o wysokiej dokładności (PHASOR): technika poprawy chirurgii okna czaszkowego u myszy (Wideo) | JoVE Journal

Piezoelektryczne chirurgiczne usuwanie okostnego ciała o wysokiej dokładności (PHASOR): technika poprawy chirurgii okna czaszkowego u myszy

Przeglądaj więcej filmów