Prosta eliminacja fluorescencji tła w ludzkiej tkance mózgowej utrwalonej formaliną do mikroskopii immunofluorescencyjnej

Częstym problemem w mikroskopii immunofluorescencyjnej jest obecność endogennej fluorescencji tła, która może zakłócać sygnał. W wielu przypadkach ta autofluorescencja może sprawić, że wyniki będą niemożliwe do zinterpretowania. W tym protokole pokażemy, jak usunąć autofluorescencję z próbek ludzkiej tkanki mózgowej za pomocą fotowybielania za pomocą komercyjnej lampy biurkowej LED.

Głównymi zaletami tej metody są znaczne oszczędności kosztów w porównaniu z obecnymi technikami bez utraty skuteczności oraz brak wprowadzania do próbki związków egzogennych. Zanim zaczniesz, przygotuj roztwory podstawowe jednorazowo tris-buforowanej soli fizjologicznej, TBS i 10% azydku sodu. Na każde trzy szkiełka mikroskopowe o standardowym rozmiarze, które chcesz przetworzyć, potrzebna jest pojedyncza szalka Petriego o wymiarach 100 milimetrów na 100 milimetrów kwadratowych jako komora szkiełkowa.

Dla każdej komory szkiełkowej przygotuj 50 mililitrów 05% azydku w TBS, dodając 25 mililitrów 10% azydku sodu do 50 mililitrów jednokrotnego TBS. Stwórz rusztowanie, aby podnieść komorę szkiełkową tak, aby głowica lampy mogła zmieścić się pod spodem. W przypadku kwadratowej szalki Petriego o średnicy 100 milimetrów kwadratowych można przyciąć plastikowy pojemnik na żywność o podobnym rozmiarze, aby nadać mu odpowiedni kształt.

Można użyć wszystkiego, co może bezpiecznie podnieść komorę szkiełkową bez utrudniania docierania światła do próbek. Zaopatrz się w lampę biurkową LED z białym luminoforem i usuń wszelkie dyfuzory lub nieprzezroczysty plastik, które zakrywają źródło światła. Ustaw matrycę LED w górę.

W tym celu zalecana jest lampa z elastyczną szyjką. Skonstruuj odblaskową pokrywę kopuły dla aparatu, oświetlając wnętrze pudełka wystarczająco dużego, aby przykryć komory zjeżdżalni i rusztowanie folią aluminiową. W przypadku pojedynczej komory można użyć jednomilimetrowego pudełka na końcówki do pipet.

W tym filmie utrwalona ludzka tkanka mózgowa oczodołowego zakrętu czołowego FTLD-T została poddana wstępnej obróbce fotowybielającej. Procedury przygotowania tkanek i barwienia aminokwasów mogą się różnić w zależności od źródła, utrwalenia i osadzenia skrawków tkanki. W chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza, chłodni lub lodówce umieść lampę pod rusztowaniem, a komorę na próbki na rusztowaniu.

Napełnij komorę próbki 50 mililitrami azydku TBS. Zanurz skrawki tkanek o grubości 10 mikrometrów zamontowane na standardowych szklanych szkiełkach mikroskopowych w komorze próbki za pomocą czystych kleszczy. Przykryj urządzenie kopułą odblaskową i włącz diodę LED lamp.

Pozostaw próbki do fotowybielania przez 48 godzin. Ten czas inkubacji może się różnić w zależności od intensywności lampy i ilości materiału autofluorescencyjnego w tkance. Po wstępnym zabiegu fotowybielania preparaty można wybarwić immunologicznie za pomocą standardowego protokołu dla konkretnej tkanki i białek, które są przedmiotem zainteresowania.

W celach demonstracyjnych tkankę mózgową FTLD-T wybarwiono pod kątem fosforylowanego tau przy użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z Alexa 488 i Texas Red. DAPI był używany jako przeciwplama jądrowa. Przygotuj 500 mililitrów buforu do odzyskiwania antygenu, 500 mililitrów 0,025% Triton X-100 w TBS, 10 mililitrów 1% albuminy surowicy bydlęcej, BSA, w TBS i dwa mililitry roztworu blokującego, składającego się z koziej surowicy dodanej do BSA TBS.

Wykonaj pobieranie antygenu, zanurzając fotobielone szkiełka w buforze odzyskiwania antygenu w kolektorze szkiełek. Podgrzej kolektor w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po wyjęciu kolektora z obróbki cieplnej ważne jest, aby komora ostygła w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Natychmiastowe usunięcie szkiełek spowoduje wyschnięcie sekcji. Przygotuj mieszaninę przeciwciał pierwotnych zgodnie z zaleceniami producenta. W tym przypadku przeciwciało anty-fosfo PHF tau p-seryna 202 plus treonina 205 AT8 rozcieńczono jeden na 100 BSA TBS i pozostawiono na lodzie.

Wymagane jest 150 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał na sekcję. Po ostygnięciu skrawków przez 30 minut, przenieść szkiełka z kolektora do pobierania antygenu do słoika do barwienia wypełnionego TBS Triton. Myj szkiełka w tym roztworze przez pięć minut, delikatnie potrząsając.

Opróżnij i wymień TBS Triton, aby powtórzyć ten krok prania po raz drugi. Po umyciu wyjmij szkiełka ze słoika do barwienia i odchodź nadmiar buforu. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj kontur wokół tkanki.

Zapobiegnie to spływaniu roztworów ze zjeżdżalni. Uważaj, aby szkiełka nie wyschły. Zablokuj tkankę, pipetując 200 mikrolitrów roztworu blokującego na szkiełka podstawowe i umieść je w wilgotnej komorze.

Ta komora może być czymś tak prostym, jak stojak na suwaki w pudełku z końcówkami do pipet zawierającym mokry ręcznik papierowy. Upewnij się, że cała próbka tkanki jest pokryta roztworem blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Usunąć zablokowany roztwór za pomocą aspiratora lub pipety. Odpipetować od 100 do 150 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał pierwotnych na szkiełka. Upewnij się, że cała próbka jest pokryta roztworem przeciwciała, a skrawki są utrzymywane na równej powierzchni, aby uniknąć nierównomiernego gromadzenia się przeciwciał.

Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w wilgotnej komorze. Następnego dnia przygotuj mieszaninę przeciwciał drugorzędowych. W tym przypadku kozioł anty-mysz Alexa 488 i kozioł anty-mysz Texas Red rozcieńczono jeden na 100 przy użyciu BSA TBS.

Pobrać skrawki tkanki i usunąć pierwotny roztwór przeciwciała za pomocą aspiratora lub pipety. Umyj szkiełka dwa razy w podobny sposób jak poprzednio, używając słoika do barwienia wypełnionego TBS Triton przez pięć minut przy każdym myciu. Po umyciu usuń nadmiar bufora.

Odpipetować od 100 do 150 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciała, ponownie upewniając się, że próbka tkanki jest całkowicie pokryta. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze w ciemności. Przygotować 0,1 mikrograma na mililitr barwnika przeciwstawnego DAPI w TBS zgodnie z zaleceniami producenta lub rozcieńczeniem seryjnym.

Należy pamiętać o dokładnym wymieszaniu roztworu podstawowego DAPI ze względu na możliwą nierozpuszczalność. Pobrać szkiełka podstawowe i usunąć wtórną mieszaninę przeciwciał. Umyj próbki dwa razy, ale zamiast używać TBS Triton, użyj zwykłego TBS.

Odessać lub odpipetować pozostały roztwór do płukania i odpipetować od 100 do 150 mikrolitrów barwnika DAPI na skrawki tkanki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Pobrać próbki i umyć je trzy razy zwykłym TBS zamiast dwóch.

Po umyciu ostrożnie usuń pozostały roztwór myjący. Nałożyć medium montażowe. Zakończ montaż szkiełka, przykrywając próbki szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.

Unikaj pęcherzyków, umieszczając jedną krawędź ślizgu okładki w dół i bardzo powoli opuszczając przeciwległą krawędź za pomocą kleszczy. Poczekaj, aż nośnik montażowy wyschnie przed przechowywaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Slajdy są teraz gotowe do wizualizacji.

Ustawienia mikroskopii fluorescencyjnej będą się różnić w zależności od fluoroforów używanych do barwienia i mikroskopu. Włącz lampę fluorescencyjną, mikroskop i komputer i pozwól lampie rozgrzać się przez 15 minut. Umieść wybarwione szkiełka tkankowe w mikroskopie fluorescencyjnym.

Użyj jasnego pola, aby zlokalizować tkankę w 10-krotnym powiększeniu. Po zlokalizowaniu odpowiedniego obszaru tkanki dodaj kroplę wody na wierzch szkiełka nakrywkowego próbki. Przełącz się na soczewkę 20-krotnego zanurzenia w wodzie.

Wybierz długości fal wzbudzenia i emisji lasera odpowiednie dla każdego fluoroforu na oddzielnych ścieżkach, aby uzyskać najlepszy sygnał. Więcej szczegółów na temat zastosowanych ustawień i długości fal można znaleźć w dołączonym manuskrypcie. Dostosuj ustawienia mocy lasera i wzmocnienia, aby zoptymalizować intensywność sygnału dla każdej ścieżki.

Po znalezieniu odpowiednich ustawień i pola widzenia zapisz obraz kompozytowy zawierający dane fluorescencji z każdej ścieżki. Aby zobrazować intensywność fluorescencji w każdym kanale, zainstaluj makro RGB Profile Tools dla ImageJ. Otwórz plik obrazu konfokalnego lsm w ImageJ i przekonwertuj obrazy kompozytowe z trzech stosów na RGB, przechodząc do narzędzia Obraz, Kolor, Kanał.

Wybierz opcję Kompozytowy i sprawdź wszystkie trzy kanały. Następnie przejdź do Obraz, Typ i Kolor RGB. Wybierz ikonę Narzędzia profilu RGB i narysuj linię w poprzek przekroju obrazu, który ma zostać profilowany.

W tym filmie opisano etapy wykonywania wstępnej obróbki fotowybielającej próbek tkanek w celu uzyskania fluorescencji tła. Procedura ta może być dodana do dowolnego standardowego protokołu fluorescencji aminowej przed pobraniem antygenu i barwieniem aminokwasów. Aparatura używana do fotowybielania jest niedroga i łatwo dostępna, składa się z gotowych komponentów.

Diody LED z białym luminoforem emitują światło w szerokim spektrum długości fal, dzięki czemu doskonale nadają się do fotowybielania w szerokim zakresie. Za pomocą łatwo dostępnej lampy biurkowej LED, niebarwione próbki ludzkiej tkanki mózgowej FTLD-T zostały fotowybielone i zobrazowane przy użyciu długości fal, które byłyby odpowiednie, gdyby próbki te zostały wybarwione Texas Red i Alexa 488. Próbki niepoddane działaniu substancji wykazywały duże ilości autofluorescencji.

Natomiast fotowybielanie skutkowało znacznie zmniejszoną intensywnością plamek autofluorescencyjnych, które przypominały lipofuscynę, a także ogólną fluorescencją tła. W celu dalszej walidacji tej techniki, próbki tkanki mózgowej FTLD-T wybarwiono pod kątem hiperfosforylowanego tau, białka, które nieprawidłowo fałduje się i gromadzi w tej chorobie jako odrębne ciała inkluzyjne. Zastosowano dwa różne przeciwciała drugorzędowe, aby lepiej odróżnić znakowanie tau od fluorescencji nieswoistej.

Na tych złożonych obrazach kolokalizacja Alexa 488 i Texas Red jest pokazana na żółto, co reprezentuje prawidłowo wybarwione białko tau. Pojawienie się czerwonych lub zielonych obszarów wskazuje albo na niespecyficzną fluorescencję, albo na wygaszenie jednego z chromoforów. W niepoddanej działaniu substancji próbie kontrolnej można zaobserwować znaczne tło i niespecyficzny sygnał, szczególnie w kanale czerwonym Teksasu.

Zarówno wstępna obróbka fotowybielacza, jak i zastosowanie chemicznego wygaszacza powodują znaczne zmniejszenie sygnału tła. Jeśli podzielimy kanały fluorescencji i spojrzymy na obrazy w większym powiększeniu, można dokonać bardziej szczegółowych obserwacji. Nieleczona kontrola posiada fluorescencję tła we wszystkich kanałach, a także niespecyficzne cechy, głównie w kanale Texas Red, które mają podobną intensywność do znakowania specyficznego dla tau.

Gdyby ciała inkluzyjne tau nie miały wyraźnej, przewidywalnej morfologii, wyniki Texas Red mogłyby zostać błędnie zinterpretowane ze względu na obecność tych cech autofluorescencyjnych. Wstępna obróbka fotowybielania całkowicie znosi te niespecyficzne cechy Texas Red, zachowując jednocześnie większość specyficznych dla tau sygnałów Texas Red i Alexa 488. Wydaje się jednak, że fotowybielanie ma niewielki wpływ na fluorescencję tła DAPI.

Chemiczny wygaszacz redukował fluorescencję tła w kanale Alexa 488 równie skutecznie jak fotowybielanie. Jednak zmniejszyło to również intensywność fluorescencji zarówno DAPI, jak i Texas Red, co sugeruje obecność pewnego wygaszania przynoszącego efekt przeciwny do zamierzonego. Kwantyfikacja tych efektów jest widoczna w profilach sygnałów.

Jak widać, ta metoda daje czyste obrazy bez funkcji zakłócających. Ta wstępna obróbka fotowybielania może być włączona do dowolnego standardowego protokołu aminofluorescencji w celu usunięcia autofluorescencji i uzyskania wysokiej jakości, jednoznacznych wyników.