Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich
August 25th, 2017
Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.
Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest nakreślenie podstawowego podejścia w szczegółowej metodologii do pomiaru heterogeniczności genetycznej w miejscu docelowym w wiarygodny i solidny sposób. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie edycji genów, takie jak, w jaki sposób można analizować i mierzyć mutagenezę na miejscu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to ustandaryzowana metodologia naprawy kierowanej homologią lub korekcji genów przy użyciu jednoniciowych oligonukleotydów.
Aby rozpocząć protokół, należy wyhodować HTT11619 komórek w 25 mililitrach wcześniej przygotowanej pożywki do hodowli komórek HTT116 w kolbie T-175. Odessać pożywkę i przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanem dulbecco lub PBS, bez wapnia i magnezu, a następnie odessać PBS. Następnie dodaj trypsynę kroplami do kolby T-175 za pomocą pięciomililitrowej pipety.
Pozwól komórkom odłączyć się w inkubatorze. Postukać w kolbę, aby usunąć komórki, a następnie zalać komórki ośmioma mililitrami kompletnego podłoża na całej powierzchni kolby. Następnie kilkakrotnie pipetować mieszaninę w górę iw dół, aby rozbić grudki komórek i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.
Przed odwirowaniem komórek weź 10 mikrolitrów z 15-mililitrowej stożkowej rurki i połącz je z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego, aby policzyć komórki, a następnie zagnieźdź komórki. Przenieś 10 mikrolitrów komórek zmieszanych z błękitem trypanowym do hemocytometru i policz cztery siatki na zewnątrz. Na każdą 10-centymetrową płytkę komórek, która ma być zsynchronizowana, dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki i sześć mikromolów afidikoliny.
Następnie przenieś 100 mikrolitrów ponownie zawieszonych granulek komórkowych na każdą centymetrową płytkę i delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać. Inkubować płytki, aby zsynchronizować komórki na granicy G1S. Cztery godziny przed celowaniem odessać pożywkę, przemyć PBS.
Odessać PBS i dodać pięć mililitrów kompletnego podłoża. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na cztery godziny. Wprowadź zmutowaną sekwencję genu EGFP do generatora online Zane Labs i wybierz sekwencje prowadzące CRISPR, które wiążą się w bliskiej odległości od miejsca docelowego.
Wymieszaj RNA w równych stężeniach molowych do 45 mikromolowców. Dodaj 6,75 mikrolitra 200 mikromolowego zapasu CR RNA i 6,75 mikrolitra 200 mikromolowego zapasu znacznikowego RNA do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj 16,50 mikrolitrów buforu IDT, aby uzyskać końcową objętość 30 mikrolitrów.
Następnie podgrzej mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut w maszynie do PCR. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Dla każdej próbki rozcieńczyć 2,22 mikrolitra CR RNA do znacznika kompleksu RNA i 2,78 mikrolitra buforu IDT do końcowej objętości pięciu mikrolitrów.
Rozcieńczyć 1,67 mikrolitra białka Cas9 z 60 mikromolowego materiału w 3,33 mikrolitra niskiej surowicy do końcowej objętości pięciu mikrolitrów. Wymieszaj pięć mikrolitrów białka Cas9 z pięcioma mikrolitrami złożonego RNA. Odessać pożywkę, przemyć pięcioma mililitrami PBS.
Odessać PBS i dodać jeden mililitr wstępnie podgrzanej trypsyny do każdej 10-centymetrowej płytki. Umieść płytki w inkubatorze. Następnie postukaj w 10-centymetrową płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte, a następnie ugasz je czterema mililitrami kompletnego podłoża, rozpraszając je na całej powierzchni płytki.
Pipetuj wiele razy w górę iw dół, aby rozbić grudki komórek i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odłóż 10 mikrolitrów z 15-mililitrowej stożkowej rurki i połącz je z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego, aby policzyć komórki. Granulować komórki, wirując przez pięć minut w temperaturze 125 x G w temperaturze pokojowej.
Odessać pożywkę i przemyć pięcioma mililitrami PBS. Obieraj komórki, wirując 125 x G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny ogniw do każdej kuwety elektroporacyjnej o czteromilimetrowej szczelinie.
Dodaj 10 mikrolitrów kompleksu RNP do 100 mikrolitrów komórek, przy gęstości 5 x 10 do piątej gęstości komórek. Dodać dwa mikromolowe ODN do każdej próbki. Następnie zanieś stojak do maszyny do elektroporacji.
Delikatnie strzepnąć każdą z próbek i umieścić je w komorze. Umieść stojak z powrotem w okapie i przenieś każdą próbkę do studzienki zawierającej dwa mililitry kompletnego podłoża na płytce sześciodołkowej. Inkubować płytkę przed sprawdzeniem poziomów korekcji.
Odessać pożywkę i umyć komórki dwoma mililitrami PBS. Zastąp PBS 500 mikrolitrami wstępnie podgrzanej trypsyny do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Umieść płytki w inkubatorze.
Następnie postukaj w płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte, a następnie ugasz jednym mililitrem kompletnego podłoża, rozpraszając je na całej powierzchni studzienki. Przełóż komórki do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i osadu. Po zagnieżdżeniu komórek odessać pożywkę, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach buforu FACS.
Elektroportować zsynchronizowane i uwolnione HTT11619 komórki w stężeniu 5 x 10 do piątych komórek na 100 mikrolitrów, z kompleksem RNP na 100 pikomoli i 100 pikomolami 72 NTODN na 2,0 mikromolowych. Przenieś komórki na płytkę z sześcioma dołkami i pozwól im dojść do siebie przez 72 godziny. Następnie posortuj komórki pojedynczo na 96-dołkowe płytki, używając sortera fac z laserem 488 nanometrów dla EGFP plus minus.
Z dołków, które mają wzrost, wyizoluj komórkowe gDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji DNA. Wzmocnij regiony otaczające bazę docelową za pomocą PCR. Na koniec wykonaj analizę sekwencjonowania DNA na próbkach.
72 godziny po analizie metodą inkubacyjnej cytometrii przepływowej potwierdź funkcjonalną naprawę białka zielonej fluorescencji. Obserwowano stopniową reakcję na dawkę w miarę wzrostu skoordynowanych poziomów RNP i 72NT. Reakcja edycji genów przy braku cząstki RNP korygowała około 1% docelowych komórek, gdy w reakcji edycji genów pojedynczego czynnika stosuje się 10-krotnie wyższe stężenie oligonukleotydu 72NT.
Wybrano 16 klonów próbek z dodatnim wynikiem EGFP, a integralność genetyczna otaczająca miejsce docelowe została przeanalizowana za pomocą sekwenatora DNA. Wszystkie 16 komórek EGFP dodatnich zawierało przewidywaną wymianę nukleotydów w miejscu docelowym. 15 niezielonych izolatów klonalnych przeanalizowano pod kątem niejednorodności w miejscu docelowym.
W około połowie próbek nie zaobserwowano wymiany zasad DNA. Pozostałe badane ekspansje klonalne wykazywały niejednorodną populację mutacji delecyjnych. Rozmiar usuwania wahał się od jednej bazy do 19 zasad.
CRISPR, Cas9 i jednoniciowe cząsteczki donorowego DNA donora oligonukleotydów działające w tandemie mogą prowadzić do precyzyjnej naprawy mutacji punktowej w genie EGFP, jak wykazano w tym nowym modelu naprawy mutacji punktowych, szlaku molekularnego, w którym DNA dawcy uzyskuje dostęp do matrycy replikacyjnej w celu naprawy zmutowanej zasady. Proces, który nazwaliśmy ExACT. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się edycją genów do zbadania stopnia heterogeniczności w miejscu docelowym w wyniku aktywności edycji genów w liniach komórkowych.
Przegląd
Ten protokół opisuje system edycji genów oparty na CRISPR/Cas9 do naprawiania punktowych mutacji w komórkach ssaków. Zawiera szczegółową metodologię pomiaru heterogeniczności genetycznej i analizy mutageneza na miejscu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Edycja genów
- Technologia CRISPR/Cas9
- Biologia molekularna
Tło
- CRISPR/Cas9 to rewolucyjne narzędzie do edycji genów.
- Rozumienie mutageneza na miejscu jest kluczowe dla terapii genowej.
- Standaryzowane metodologie poprawiają reproduktywalność eksperymentów.
- Ten protokół koncentruje się na naprawie ukierunkowanej na homologię z wykorzystaniem pojedynczych łańcuchów oligonukleotydów.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodną metodę analizy zmian genetycznych w miejscach docelowych.
- Aby poprawić zrozumienie technik korekcji genów.
- Aby ustalić standaryzowany podchód do przyszłych badań nad edycją genów.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek i synchronizacja komórek HTT11619.
- Przygotowanie kompleksów RNA CRISPR i białka Cas9.
- Elektroporacja komórek kompleksem RNP.
- Analiza cytometria przepływowa do potwierdzenia wyników edycji genów.
Główne wyniki
- Potwierdzono funkcjonalną naprawę białka zielonego fluorescencyjnego.
- Zmierzono powstawanie indels w miejscu docelowym.
- Obserwowano odpowiedź zależną od dawki z uwagi na stężenia RNP.
- Osiągnięto około 1% korekcji w docelowych komórkach.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia solidne ramy dla badań nad edycją genów.
- Standardyzacja jest kluczowym czynnikiem dla reproduktywalności w badaniach nad terapią genową.
- Przyszłe zastosowania mogą poprawić strategie terapeutyczne w przypadku zaburzeń genetycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol provides a standardized methodology to quantify on-site mutagenesis during CRISPR/Cas9-mediated point mutation repair, a critical factor in assessing the safety and precision of gene editing approaches for therapeutic development. By measuring indel formation at the target site, the method enables mechanistic de-risking of homology-directed repair strategies, supporting predictive confidence in lead identification and preclinical advancement decisions. The approach addresses a key discovery-stage challenge: distinguishing true correction from collateral genetic lesions, thereby informing go/no-go evaluations in early-stage genetic medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypothesis by distinguishing precise point mutation repair from unintended indel formation at the target site.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow to quantify genetic heterogeneity, supporting functional target validation through correction fidelity assessment.
- Predictive Value: Measures off-target-like activity at the on-target locus, informing biological de-risking and portfolio triage of gene editing constructs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized cell-based model (HCT116 with mutant eGFP) for consistent measurement of editing outcomes across experimental conditions.
- Quantitative Output: Delivers measurable indel frequency and size distribution (1–19 bp deletions) as a functional readout for assay optimization and reagent titration.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for downstream screening campaigns requiring correction precision metrics.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase editing precision to preclinical validation by defining a benchmark for acceptable mutagenesis levels in therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Advancement: Quantifies the degree of on-site mutagenesis as a function of repair catalysis, enabling data-driven decisions on construct progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed corrections arise from true homology-directed repair or error-prone mechanisms, informing safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, specifically supporting lead identification by providing a quantitative metric for editing precision that precedes functional validation in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of repair mechanisms by isolating the contribution of CRISPR/Cas9 and ssODN to nucleotide exchange versus indel formation.
- Screening: Enables assay standardization through synchronized cell preparation and defined electroporation parameters, improving reproducibility across replicates.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (indel size, frequency, clonal distribution) that allow comparison of RNP and donor oligonucleotide dosing conditions.
- Translational Research: Connects molecular precision outcomes to preclinical risk assessment by establishing a threshold for acceptable off-target-like activity at the target site.
- Enterprise Reuse: Establishes a foundational, reusable workflow for evaluating any CRISPR/Cas9-based point mutation correction strategy in human cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in gene editing precision by directly measuring on-site mutagenesis as a confounder of apparent correction.
- Operational Value: Ensures standardization through detailed cell synchronization, RNP preparation, and electroporation protocols, reducing variability in genetic outcome measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by revealing whether observed correction is accompanied by significant indel formation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene editing approaches based on quantified mutagenesis profiles, supporting capital efficiency in preclinical investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, flow cytometry, and molecular cloning for gDNA isolation and PCR amplification.
- Dependent on access to electroporation equipment with 4 mm gap cuvettes and a FACS sorter capable of EGFP-based single-cell sorting.
- Necessitates standardization of cell synchronization (aphidicolin treatment) and RNP complex preparation across laboratories for reproducible results.
- Adaptation to other model systems may require optimization of electroporation conditions and donor oligonucleotide delivery efficiency.
- Practical limitation: The assay measures endogenous mutagenesis but does not distinguish between repair pathway contributions without additional mechanistic inhibitors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Cell Line, Culture Conditions, and Harvest
1:57
Plating the Cells and Releasing Them from Aphidicolin Synchronization
2:44
RNA Complexing
4:13
Harvesting the Cells for Targeting
5:30
Targeting Samples
6:13
Analysis of Gene Edited Cells and Transfection Efficiency
6:57
DNA Sequence Analysis
7:56
Results: Effective Point Mutation Repair
9:41
Conclusion
