Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest nakreślenie podstawowego podejścia w szczegółowej metodologii do pomiaru heterogeniczności genetycznej w miejscu docelowym w wiarygodny i solidny sposób. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie edycji genów, takie jak, w jaki sposób można analizować i mierzyć mutagenezę na miejscu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to ustandaryzowana metodologia naprawy kierowanej homologią lub korekcji genów przy użyciu jednoniciowych oligonukleotydów.

Aby rozpocząć protokół, należy wyhodować HTT11619 komórek w 25 mililitrach wcześniej przygotowanej pożywki do hodowli komórek HTT116 w kolbie T-175. Odessać pożywkę i przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanem dulbecco lub PBS, bez wapnia i magnezu, a następnie odessać PBS. Następnie dodaj trypsynę kroplami do kolby T-175 za pomocą pięciomililitrowej pipety.

Pozwól komórkom odłączyć się w inkubatorze. Postukać w kolbę, aby usunąć komórki, a następnie zalać komórki ośmioma mililitrami kompletnego podłoża na całej powierzchni kolby. Następnie kilkakrotnie pipetować mieszaninę w górę iw dół, aby rozbić grudki komórek i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Przed odwirowaniem komórek weź 10 mikrolitrów z 15-mililitrowej stożkowej rurki i połącz je z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego, aby policzyć komórki, a następnie zagnieźdź komórki. Przenieś 10 mikrolitrów komórek zmieszanych z błękitem trypanowym do hemocytometru i policz cztery siatki na zewnątrz. Na każdą 10-centymetrową płytkę komórek, która ma być zsynchronizowana, dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki i sześć mikromolów afidikoliny.

Następnie przenieś 100 mikrolitrów ponownie zawieszonych granulek komórkowych na każdą centymetrową płytkę i delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać. Inkubować płytki, aby zsynchronizować komórki na granicy G1S. Cztery godziny przed celowaniem odessać pożywkę, przemyć PBS.

Odessać PBS i dodać pięć mililitrów kompletnego podłoża. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na cztery godziny. Wprowadź zmutowaną sekwencję genu EGFP do generatora online Zane Labs i wybierz sekwencje prowadzące CRISPR, które wiążą się w bliskiej odległości od miejsca docelowego.

Wymieszaj RNA w równych stężeniach molowych do 45 mikromolowców. Dodaj 6,75 mikrolitra 200 mikromolowego zapasu CR RNA i 6,75 mikrolitra 200 mikromolowego zapasu znacznikowego RNA do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj 16,50 mikrolitrów buforu IDT, aby uzyskać końcową objętość 30 mikrolitrów.

Następnie podgrzej mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut w maszynie do PCR. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Dla każdej próbki rozcieńczyć 2,22 mikrolitra CR RNA do znacznika kompleksu RNA i 2,78 mikrolitra buforu IDT do końcowej objętości pięciu mikrolitrów.

Rozcieńczyć 1,67 mikrolitra białka Cas9 z 60 mikromolowego materiału w 3,33 mikrolitra niskiej surowicy do końcowej objętości pięciu mikrolitrów. Wymieszaj pięć mikrolitrów białka Cas9 z pięcioma mikrolitrami złożonego RNA. Odessać pożywkę, przemyć pięcioma mililitrami PBS.

Odessać PBS i dodać jeden mililitr wstępnie podgrzanej trypsyny do każdej 10-centymetrowej płytki. Umieść płytki w inkubatorze. Następnie postukaj w 10-centymetrową płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte, a następnie ugasz je czterema mililitrami kompletnego podłoża, rozpraszając je na całej powierzchni płytki.

Pipetuj wiele razy w górę iw dół, aby rozbić grudki komórek i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odłóż 10 mikrolitrów z 15-mililitrowej stożkowej rurki i połącz je z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego, aby policzyć komórki. Granulować komórki, wirując przez pięć minut w temperaturze 125 x G w temperaturze pokojowej.

Odessać pożywkę i przemyć pięcioma mililitrami PBS. Obieraj komórki, wirując 125 x G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny ogniw do każdej kuwety elektroporacyjnej o czteromilimetrowej szczelinie.

Dodaj 10 mikrolitrów kompleksu RNP do 100 mikrolitrów komórek, przy gęstości 5 x 10 do piątej gęstości komórek. Dodać dwa mikromolowe ODN do każdej próbki. Następnie zanieś stojak do maszyny do elektroporacji.

Delikatnie strzepnąć każdą z próbek i umieścić je w komorze. Umieść stojak z powrotem w okapie i przenieś każdą próbkę do studzienki zawierającej dwa mililitry kompletnego podłoża na płytce sześciodołkowej. Inkubować płytkę przed sprawdzeniem poziomów korekcji.

Odessać pożywkę i umyć komórki dwoma mililitrami PBS. Zastąp PBS 500 mikrolitrami wstępnie podgrzanej trypsyny do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Umieść płytki w inkubatorze.

Następnie postukaj w płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte, a następnie ugasz jednym mililitrem kompletnego podłoża, rozpraszając je na całej powierzchni studzienki. Przełóż komórki do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i osadu. Po zagnieżdżeniu komórek odessać pożywkę, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach buforu FACS.

Elektroportować zsynchronizowane i uwolnione HTT11619 komórki w stężeniu 5 x 10 do piątych komórek na 100 mikrolitrów, z kompleksem RNP na 100 pikomoli i 100 pikomolami 72 NTODN na 2,0 mikromolowych. Przenieś komórki na płytkę z sześcioma dołkami i pozwól im dojść do siebie przez 72 godziny. Następnie posortuj komórki pojedynczo na 96-dołkowe płytki, używając sortera fac z laserem 488 nanometrów dla EGFP plus minus.

Z dołków, które mają wzrost, wyizoluj komórkowe gDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji DNA. Wzmocnij regiony otaczające bazę docelową za pomocą PCR. Na koniec wykonaj analizę sekwencjonowania DNA na próbkach.

72 godziny po analizie metodą inkubacyjnej cytometrii przepływowej potwierdź funkcjonalną naprawę białka zielonej fluorescencji. Obserwowano stopniową reakcję na dawkę w miarę wzrostu skoordynowanych poziomów RNP i 72NT. Reakcja edycji genów przy braku cząstki RNP korygowała około 1% docelowych komórek, gdy w reakcji edycji genów pojedynczego czynnika stosuje się 10-krotnie wyższe stężenie oligonukleotydu 72NT.

Wybrano 16 klonów próbek z dodatnim wynikiem EGFP, a integralność genetyczna otaczająca miejsce docelowe została przeanalizowana za pomocą sekwenatora DNA. Wszystkie 16 komórek EGFP dodatnich zawierało przewidywaną wymianę nukleotydów w miejscu docelowym. 15 niezielonych izolatów klonalnych przeanalizowano pod kątem niejednorodności w miejscu docelowym.

W około połowie próbek nie zaobserwowano wymiany zasad DNA. Pozostałe badane ekspansje klonalne wykazywały niejednorodną populację mutacji delecyjnych. Rozmiar usuwania wahał się od jednej bazy do 19 zasad.

CRISPR, Cas9 i jednoniciowe cząsteczki donorowego DNA donora oligonukleotydów działające w tandemie mogą prowadzić do precyzyjnej naprawy mutacji punktowej w genie EGFP, jak wykazano w tym nowym modelu naprawy mutacji punktowych, szlaku molekularnego, w którym DNA dawcy uzyskuje dostęp do matrycy replikacyjnej w celu naprawy zmutowanej zasady. Proces, który nazwaliśmy ExACT. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się edycją genów do zbadania stopnia heterogeniczności w miejscu docelowym w wyniku aktywności edycji genów w liniach komórkowych.